Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım
Summary
Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.
Abstract
Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, RNA işleme, sinyal iletimi, DNA hasar yanıtı, miRNA biyogenezi ve translasyon dahil olmak üzere çeşitli hücresel yolakların düzenlenmesinde rol oynayan yaygın bir protein post-translasyonel modifikasyonudur (PTM).
Son yıllarda, biyokimyasal ve analitik gelişmeler sayesinde, kütle spektrometresi (MS) bazlı proteomikler, hücresel metil-proteomu tek bölge çözünürlüğü ile karakterize etmek için en etkili strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, MS tarafından in vivo protein R-metilasyonunun tanımlanması ve profillenmesi, esas olarak bu modifikasyonun substokiyometrik doğası ve çeşitli amino asit ikamelerinin varlığı ve metilasyona izobarik olan asidik kalıntıların kimyasal metil-esterifikasyonu nedeniyle zor ve hataya açık olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, R-metil-peptitlerin tanımlanmasını arttırmak için zenginleştirme yöntemleri ve metil-proteomik çalışmalarda Yanlış Keşif Oranlarını (FDR) azaltmak için ortogonal doğrulama stratejileri gereklidir.
Burada, hücresel örneklerden yüksek güvenilirliğe sahip R-metil-peptitlerin tanımlanması ve kantitasyonu için özel olarak tasarlanmış bir protokol tanımlanmıştır; bu, hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır izotop kodlu Metiyonin (hmSILAC) ve tüm hücre ekstraktının çift proteaz çözelti içi sindirimi ile birleştiren, ardından anti-pan-R-metil antikorları kullanılarak R-metil-peptitlerin çevrimdışı Yüksek pH Ters Faz (HpH-RP) kromatografi fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi ile eşleştirilmiştir. Yüksek çözünürlüklü MS analizi üzerine, ham veriler önce MaxQuant yazılım paketi ile işlenir ve sonuçlar daha sonra MaxQuant çıktı dosyalarındaki hafif ve ağır metil-peptide karşılık gelen MS tepe çiftlerinin derinlemesine araştırılması için tasarlanmış bir yazılım olan hmSEEKER tarafından analiz edilir.
Introduction
Arginin ( R ) -metilasyon, memeli proteomunun yaklaşık% 1’ini süsleyen bir translasyonel modifikasyondur (PTM)1. Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT’ler), R’nin yan zincirinin guanidinos grubunun azot (N) atomlarına simetrik veya asimetrik bir şekilde bir veya iki metil grubunun birikmesiyle R-metilasyon reaksiyonunu katalize eden enzimlerdir. Memelilerde, PRMT’ler hem mono-metilasyon (MMA) hem de asimetrik di-metilasyon (ADMA), MMA ve simetrik di-metilasyon (SDMA) veya sadece MMA’yı biriktirme yeteneklerine bağlı olarak üç sınıfa ayrılabilir – sırasıyla 2,3. PRMT’ler esas olarak GAR motifleri olarak bilinen glisin ve arginin bakımından zengin bölgelerde bulunan R kalıntılarını hedef alır, ancak PRMT5 ve CARM1 gibi bazı PRMT’ler prolin-glisin-metiyonin bakımından zengin (PGM) motifleri metilleştirebilir4. R-metilasyon, RNA ekleme5, DNA onarımı6, miRNA biyogenezi7 ve çeviri2 gibi çeşitli biyolojik süreçlerin bir protein modülatörü olarak ortaya çıkmış ve bu PTM üzerindeki araştırmaları teşvik etmiştir.
Kütle Spektrometresi (MS), protein, peptit ve saha çözünürlüğünde küresel R-metilasyonunu sistematik olarak incelemek için en etkili teknoloji olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu PTM, MS tarafından yüksek güvenilirlikle tanımlanması için bazı özel önlemler gerektirir. İlk olarak, R-metilasyonu substokiyometriktir, peptitlerin değiştirilmemiş formu modifiye edilmiş olanlardan çok daha bol miktarda bulunur, böylece Veriye Bağımlı Edinme (DDA) modunda çalışan kütle spektrometreleri, yüksek yoğunluklu modifiye edilmemiş peptitleri, düşük yoğunluklu metillenmiş muadillerinden daha sık parçalayacaktır8. Ayrıca, R-metillenmiş saha tanımlaması için MS tabanlı iş akışlarının çoğu, biyoinformatik analiz düzeyinde sınırlamalardan muzdariptir. Gerçekten de, metil-peptitlerin hesaplamalı olarak tanımlanması yüksek Yanlış Keşif Oranlarına (FDR) eğilimlidir, çünkü bu PTM çeşitli amino asit ikamelerine (örneğin, glisin içine alanin) ve aspartat ve glutamatın metil-esterifikasyonu gibi kimyasal modifikasyonlara izobariktir9. Bu nedenle, Hücre kültüründe Amino Asitlerle Ağır Metil Kararlı İzotop Etiketleme (hmSILAC) gibi metil gruplarının izotop etiketlemesine dayanan yöntemler, in vivo metilasyonların güvenli MS-tanımlanması için ortogonal stratejiler olarak uygulanmış ve yanlış pozitif ek açıklamaların oranını önemli ölçüde azaltmıştır10.
Son zamanlarda, R-metillenmiş proteinleri incelemek için çeşitli proteom çapında protokoller optimize edilmiştir. R-metil-peptitlerin immüno-afinite zenginleştirilmesi için antikor tabanlı stratejilerin geliştirilmesi, insan hücrelerinde yüzlerce R-metillenmiş bölgenin ek açıklamasına yol açmıştır11,12. Ayrıca, birçok çalışma 3,13, antikor bazlı zenginleştirmenin HpH-RP kromatografi fraksiyonasyonu gibi peptid ayırma teknikleriyle birleştirilmesinin tanımlanan toplam metil-peptit sayısını artırabileceğini bildirmiştir.
Bu makalede, çeşitli biyokimyasal ve analitik adımlara dayanarak, insan hücrelerinde R-metillenmiş bölgelerin sistematik ve yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanmış deneysel bir strateji açıklanmaktadır: hmSILAC etiketli hücrelerden protein ekstraksiyonu, Tripsin ve LysargiNase proteazları ile paralel çift enzimatik sindirim, ardından sindirilmiş peptitlerin HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu, MMA-, SDMA’nın antikor bazlı immüno-afinite zenginleştirmesi ile birleştiğinde, ve ADMA içeren peptitler. Tüm afiniteyle zenginleştirilmiş peptitler daha sonra DDA modunda yüksek çözünürlüklü Sıvı Kromatografisi (LC)-MS / MS ile analiz edilir ve ham MS verileri, R-metil-peptitlerin tanımlanması için MaxQuant algoritması tarafından işlenir. Son olarak, MaxQuant çıktı sonuçları, ağır ve hafif metil-peptit çiftlerini aramak için şirket içinde geliştirilen bir biyoinformatik araç olan hmSEEKER ile işlenir. Kısaca, hmSEEKER msms dosyasından metil-peptitler tanımlamalarını okur ve filtreler, daha sonra her metil-peptidi allPeptides dosyasındaki karşılık gelen MS1 zirvesiyle eşleştirir ve son olarak ağır / hafif peptid muadilinin zirvesini arar. Her varsayılan ağır-hafif çift için, Log2 H/L oranı (LogRatio), Bekletme Süresi farkı (dRT) ve Kütle Hatası (ME) parametreleri hesaplanır ve kullanıcı tanımlı kesmeler içinde bulunan çiftler gerçek pozitif olarak etiketlenir. Biyokimyasal protokolün iş akışı Şekil 1’de açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Global MS bazlı proteomikler tarafından in vivo protein/peptit metilasyonunun yüksek güvenilirlikle tanımlanması, yüksek FDR riski nedeniyle, metilasyona izobarik olan ve ortogonal MS doğrulama stratejilerinin yokluğunda yanlış atamalara neden olabilen numune hazırlama sırasında meydana gelen çeşitli amino asit ikameleri ve metil-esterifikasyonu ile zordur. Bu PTM’nin substokiyometrik doğası, küresel metil-proteomiklerin görevini daha da karmaşıklaştırır, ancak modifiye peptidlerin seçi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM ve EM, Avrupa Moleküler Tıp Okulu (SEMM) bünyesindeki doktora öğrencileridir. EM, 3 yıllık FIRC-AIRC bursunun sahibidir (Proje Kodu: 22506). TB grubundaki R-metil-proteomların küresel analizleri AIRC IG Hibe (Proje Kodu: 21834) ile desteklenmektedir.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Riferimenti
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
