דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות ושתן

הערה: הניסויים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי ארסמוס (רוטרדם, הולנד) ומרכז הנסיכה אקסימה לאונקולוגיה ילדים (אוטרכט, הולנד). 1. דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות חומרים לוחות תרבית רקמות multiwell לפני המלחמה (6, 12 ו 24 בארות) לילה ב 37 °C (50 °F). הכן מדיום בזאלי (AdDF+++) על ידי הוספת תוספת 1x L-אלנין/L-גלוטמין, 1% w/v 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין אתנסולפוניק (HEPES, 10 מ”מ), ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין אנטיביוטיקה לאנטיביוטיקה מתקדמת מסוג DMEM/F12. הכן בינוני תרבות על ידי הוספת 1.5% תוספת B27, 10% R-spondin מותנה בינוני, גורם גדילה אפידרמלי (50 ננוגרם/מ”ל), פקטור גדילה פיברובלסט-10 (100 ננוגרם/מ”ל), N-אצטילציסטאין (1.25 מ”מ), מעכב רו-קינאז Y-27632 (10 מיקרומטר), אנטיביוטיקה רחבת טווח (0.1 מ”ג/מ”ל) ו-A83-01 (5 מיקרומטר) ל-AdDF+++. יש להתחמם עד 37 °C (70°F) לפני השימוש. הכן את תמצית קרום המרתף (BME) על ידי הפשרת aliquot לילה ב 4 °C (50 °F). שמור את BME על קרח במהלך ההליך. הכן את תמיסת הקולגנאז על ידי דילול קולגנאז לריכוז סופי של 1 מ”ג/מ”ל ב-AdDF+++, בתוספת של 10 מיקרומטר Y-27632. להתחמם עד 37 °C (50 °F). הכינו מנות פטרי 10 ס”מ, אזמלים ופינצטה. לחטא את כלי החיטוי על ידי החלת מנורה אולטרה סגולה במשך 20 דקות, ואחריו כביסה עם חומר חיטוי, מים דמי, ו 70% v / v אתנול. ייבשו את כלי השיט. לפני המלחמה שייקר אופקי ל 37 °C (50 °F). פרוצדורה לאסוף רקמת כליה בצינור 50 מ”ל מלא 30-40 מ”ל של AdDF +++ בינוני. מניחים את חתיכת הרקמה ~ 1 מ”ל של בינוני בצלחת פטרי 10 ס”מ. טחון את הרקמה לחתיכות בגודל ~1 מ”מ3 באמצעות אזמלים(איור 1A). מעבירים את הרקמה הטחון לצינור 15 מ”ל באמצעות מלקחיים ואזמלים. הוסיפו 5 מ”ל של AdDF+++ לצלחת פטרי, שטפו ואספו את המדיום עם פיפטה סטרילית של 10 מ”ל. העבר את כל התוכן הזה לאותו צינור. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. יש להוסיף 3-4 מ”ל של תמיסת קולגנאז לצינור 15 מ”ל. הזז את הצינור לשייקר אופקי להגדיר ב 37 °C (55 °F) ומהירות של 250 סל”ד. לאחר 15 הדקות הראשונות של הדגירה, בדוק את המדגם ולנער במרץ את הצינור. חזור על הפעולה עד שהמתלה הומוגני ורוב חלקי הרקמה נעלמו, עם זמן דגירה מרבי של 45-60 דקות. (איור 1B). מלאו את הצינור ב-AdDF+++, וערבבו על ידי היפוך הצינור 5-10x. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. אם הכדור אדום, המשך עם שלב 1.2.6. אחרת, עבור לשלב 1.2.8. הוסף 1 מ”ל של מאגר תמה של תאי דם אדומים (ראה טבלת החומרים) על גבי גלולה התא. הקש בעדינות על הצינור כדי resuspend הכדור (לא resuspend עם קצה פיפטה). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. מלא את הצינור עם AdDF +++. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. אם תאי הדם עדיין גלויים, חזור על ההליך פעם נוספת, החל בשלב 1.2.6. אחרת, להמשיך עם שלב 1.2.8. אם גושי רקמות נראים בשלב זה של הפרוטוקול, המשך בשלב 1.2.8. אחרת, להמשיך עם מדידת נפח הכדור בשלב 1.2.9. הוסף 5 מ”ל של AdDF +++ לצינור, ו resuspend עם פיפטה סטרילית 10 מ”ל. לסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר להציב על צינור 50 מ”ל. העבר את המתלים המסוננים לצינור חדש של 15 מ”ל. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. מדוד את עוצמת הקול של גלולה התא באמצעות פיפטה p1000 להגדיר לאמצעי אחסון ידוע. בזהירות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend מבלי ליצור בועות אוויר. מעבירים את הצינור לקרח למשך דקה אחת. הוסף 70-75% נפח של BME לכדור. Resuspend באמצעות פיפטה p1000 או p200, וצלחת 15 טיפות μL בצלחת תרבית תאים רב-ערוצית מראש (6, 12, או 24 בארות, בהתבסס על נפח ציפוי כולל (200 μL, 6 בארות)). הפוך את הצלחת, ולתת את הצלחת לנוח באינקובטור במשך 15-20 דקות ב 37 °C(איור 1C). הוסיפו מדיום תרבותי מחמם מראש, ובחנו את התרבויות(איור 1C,D). 2. דור טובולואידים כליות אנושיים משתן הערה: שתן הוא סביבה עוינת לתאים. חשוב לביצוע מוצלח של פרוטוקול זה כי דגימות שתן מעובדים בהקדם האפשרי, רצוי בתוך 4 שעות מן ההפרשה. בינתיים, דגימות שתן צריך להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F). חומרים לוחות תרבית רקמות multiwell לפני המלחמה (6, 12 ו 24 בארות) לילה ב 37 °C (50 °F). הכן מדיום כביסה: AdDF+++ בתוספת אנטיביוטיקה רחבת טווח (0.1 מ”ג/מ”ל) ו-10 מיקרומטר Y-27632. הכן מדיום תרבות כמתואר לעיל. יש להתחמם במהירות של 37 °C (77°F) לפני השימוש. הכן מטריצת BME. שמור על קרח במהלך ההליך. פרוצדורה אסוף דגימת שתן, וחלק אותה באופן שווה לצינורות 50 מ”ל(איור 2A-I). הוסף 10-20 מ”ל של כביסה בינונית לכל אחד הצינורות. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C(איור 2A-II),ולהסיר את supernatant בזהירות. הוסף 10 מ”ל של כביסה בינונית לכל אחד מהצינורות. בזהירות respend הכדורים באמצעות פיפטה סטרילית 10 מ”ל. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C(איור 2A-III),ולהסיר את supernatant בזהירות. resuspend הכדורים, ולהעביר את התוכן של כל הצינורות לתוך צינור אחד 15 מ”ל. מלאו את הצינור בשטיפה בינונית. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C(איור 2A-IV),ולהסיר את supernatant. מדוד את עוצמת הקול של גלולה התא באמצעות פיפטה p1000 להגדיר לאמצעי אחסון ידוע. בזהירות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend מבלי ליצור בועות אוויר. מעבירים את הצינור לקרח למשך דקה אחת. הוסף 70-75% נפח של BME לכדור. Resuspend באמצעות פיפטה p1000 או p200, וצלחת 15 טיפות μL בצלחת תרבית תאים רב-ערוצית מראש (6, 12, או 24 בארות, בהתבסס על נפח ציפוי כולל (200 μL, 6 בארות)). להפוך את הצלחות באינקובטור במשך 15-20 דקות ב 37 °C (7 °F). הוסיפו מדיום תרבות עם קדם-ווארוך, ובחנו את התרבויות(איור 2B). 3. הרחבת תרביות טובולואיד הערה: ניתן לעבור תרבויות טובולואידיות בערך כל 1-2 שבועות עם יחס פיצול של 1:2-1:3. הם יכולים להיות מורחבים בדרך כלל עבור כ 15 קטעים, עם וריאציות ספציפיות לקו. חומרים לוחות תרבית רקמות multiwell לפני המלחמה (6, 12 ו 24 בארות) לילה ב 37 °C (50 °F). הכן מדיום בזאלי (AdDF+++), ולשמור אותו על קרח במהלך ההליך. הכן מדיום תרבות כפי שתואר בעבר. יש לחמם עד 37 °C (77 °F) לפני השימוש. הכן מטריצת BME, ולשמור על קרח במהלך ההליך. הכן סוכן טריפסין חלופי עם תוספת של Y-27632 לריכוז של 10 מיקרומטר. לחמם עד 37 °C (77 °F) לפני השימוש. מנעו אוטומטית עצות p10 שאינן מסוננות. מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. פרוצדורה לשבש את הטיפות המכילות את טובולואידים על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפטה p1000 באמצעות המדיום הנוכחי בבאר. השתמש בקצה כדי לגרד את תחתית הבאר, הקפד לאסוף את כל התאים המחוברים לתחתית. לאסוף את התוכן בצינור 15 מ”ל. הוסף 10 מ”ל של AdDF+++. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. בהתבסס על גודל הכדור, להוסיף סוכן תחליף טריפסין בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. השתמש 1 מ”ל של סוכן תחליף טריפסין עבור 200 μL של טיפות BME המכילות טובולואידים. דגירה ב 37 °C (5 דקות). השתמשו בפיפטה p1000 עם קצה, והכניסו קצה p10 סטרילי ולא מסונן מעל קצה 1000 μL. פיפטה למעלה ולמטה עבור 20-30x כדי לשבש באופן מכני את organoids. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם איברנואידים שלמים רבים עדיין קיימים בצינור(איור 3A). אם יותר מ -10% של organoids שלם נמצאים בשלב זה, לחזור מן הדגירה 5 דקות בשלב 3.2.3 לתצפית מיקרוסקופית עבור organoids שלם בשלב 3.2.5 פעם נוספת. אחרת, להמשיך עם שלב 3.2.6. מלא את הצינור עם AdDF +++. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. מדוד את עוצמת הקול של גלולה התא באמצעות פיפטה p1000 להגדיר לאמצעי אחסון ידוע. בזהירות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend מבלי ליצור בועות אוויר. מעבירים את הצינור לקרח למשך דקה אחת. הוסף 70-75% נפח של BME לכדור. Resuspend באמצעות פיפטה p1000 או p200, וצלחת 15 טיפות μL בצלחת תרבית תאים רב-ערוצית מראש (6, 12, או 24 בארות, בהתבסס על נפח ציפוי כולל (200 μL, 6 בארות)). להפוך את הצלחות, ולתת את הצלחת לנוח בחממה במשך 15-20 דקות ב 37 °C (77 °F). הוסיפו מדיום תרבותי מחמם מראש, ובחנו את התרבויות(איור 3B).