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Biologia

Generación de tubuloides renales humanos a partir de tejidos y orina

Published: April 16, 2021
doi:
10.3791/62404
,
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Oncode Institute

Summary

Los cultivos de tubuloides renales humanos representan un valioso modelo in vitro para estudiar la fisiología y la enfermedad renal. Los tubuloides se pueden establecer a partir del tejido renal (sano y enfermo), así como de la orina, esta última representa una fuente de material de investigación fácilmente obtenible y menos invasiva.

Abstract

Los organoides epiteliales renales humanos derivados de células madre adultas (ASC), o tubuloides, se pueden establecer a partir de epitelio renal sano y enfermo con alta eficiencia. Los tubuloides renales normales recapitulan muchos aspectos de su tejido de origen. Representan distintos segmentos de nefrona, especialmente del túbulo proximal, el asa de Henle, los túbulos distales y el conducto colector, y se pueden usar para estudiar la fisiología renal normal. Además, la tecnología tubuloide facilita el modelado de enfermedades, por ejemplo,para enfermedades infecciosas y para el cáncer. Sin embargo, la obtención de células epiteliales renales para la generación de tubuloides depende del material quirúrgico sobrante (como las nefrectomías parciales) o de las biopsias con aguja. La capacidad de cultivar tubuloides a partir de la orina proporcionaría una fuente alternativa y menos invasiva de células epiteliales renales sanas. Se ha demostrado previamente que los cultivos tubuloides se pueden generar con éxito a partir de solo unos pocos mililitros de orina recién recolectada. Este artículo describe los protocolos para generar y propagar cultivos de tubuloides renales humanos derivados de ASC a partir de muestras de tejido y orina.

Introduction

Los riñones realizan la función de controlar sistémicamente el equilibrio de los fluidos corporales. El deterioro de su función fisiológica puede ser causado por diferentes factores, incluyendo diabetes, hipertensión y toxicidad inducida por medicamentos1. Para una mejor comprensión de la fisiología renal normal, así como el desarrollo de enfermedades renales, el uso de modelos preclínicos representativos es crucial. En los últimos años se han generado varios modelos renales in vitro basados en la denominada tecnología organoide2. Los organoides son estructuras tridimensionales y multicelulares que se asemejan a la morfología y fisiología del tejido (normal o enfermo) del que se originan. Se pueden generar a partir de células madre pluripotentes (PSC) o adultas (ASC), cada una con sus propias características y aplicaciones.

Los organoides renales derivados de PSC imitan la nefrogénesis3,4,5. También se pueden establecer a partir de células comprometidas derivadas del paciente mediante desdiferenciación forzada (pluripotencia inducida o iPSC). Las iPSC se pueden diferenciar posteriormente en los diferentes tipos de células de la nefrona, la unidad funcional del riñón, mediante la exposición oportuna a cócteles de factores de crecimiento específicos. Si bien se crea un mini-órgano bastante completo en un plato, su establecimiento sigue consumiendo mucho tiempo, y debido al protocolo de reprogramación, las iPSC pueden ser susceptibles a la inestabilidad genética no deseada6. Además, los organoides iPSC no son capaces de madurar completamente en células renales adultas, revelando un perfil de transcriptoma que se asemeja al riñón fetal en una etapa temprana de desarrollo7.

Se ha demostrado que los tubuloides renales humanos derivados de ASC recapitulan la renovación del epitelio renal adulto. Representan principalmente el túbulo proximal, el asa de Henle, los túbulos distales y el conducto colector, como lo confirma la expresión de diferentes proteínas transportadoras8,9,10. El protocolo de cultivo tubuloide permite la rápida expansión del tejido renal derivado del paciente, al tiempo que conserva un genoma estable. Las aplicaciones de investigación incluyen el estudio de la fisiología renal normal, la nefrotoxicidad, las pruebas de drogas, así como el modelado de enfermedades8,10,11,12. Una limitación potencial del establecimiento de cultivos de organoides derivados de pacientes, incluidos los tubuloides, es la disponibilidad de tejido fresco. Sin embargo, varios informes han demostrado que la orina puede servir como fuente de células epiteliales renales, proporcionando así una estrategia mucho más simple y menos invasiva para obtener material de paciente para cultivos tubuloides8,13,14. De hecho, recientemente se ha demostrado que los tubuloides se pueden cultivar a partir de la orina8. Este artículo describe el establecimiento y mantenimiento de cultivos tubuloides a partir de tejido renal y orina.

Protocol

NOTA: Los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el comité de ética médica del Centro Médico Erasmus (Rotterdam, Países Bajos) y el Centro Princesa Máxima de Oncología Pediátrica (Utrecht, Países Bajos). 1. Generación de tubuloides renales humanos a partir de tejido Materiales Placas de cultivo de tejido multipanúculo precalentado (6, 12 y 24 pomos) durante la noche a 37 °C. Prepare el medio basal (AdDF+++) agregando 1x suplemento de L-alanina/L-glutamina, 1% p/v 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina ácido etanosulfónico (HEPES, 10 mM) y antibióticos de penicilina/estreptomicina al 1% a DMEM/F12 avanzado. Prepare el medio de cultivo agregando un suplemento de B27 al 1,5%, un medio condicionado por R-espondina al 10%, factor de crecimiento epidérmico (50 ng/mL), factor de crecimiento de fibroblastos-10 (100ng/mL), N-acetilcisteína (1,25 mM), inhibidor de la Rho-quinasa Y-27632 (10 μM), antibióticos de amplio espectro (0,1 mg/mL) y A83-01 (5 μM) a AdDF+++. Calentar a 37 °C antes de su uso. Prepare el extracto de membrana basal (BME) descongelando una alícuota durante la noche a 4 °C. Mantenga el BME en hielo durante el procedimiento. Preparar la solución de colagenasa diluyendo la colagenasa a una concentración final de 1 mg/ml en AdDF+++, con la adición de 10 μM Y-27632. Calentar hasta 37 °C. Preparar placas de Petri de 10 cm, bisturíes y pinzas. Desinfecte los utensilios aplicando una lámpara ultravioleta durante 20 min, seguido de lavados con desinfectante, agua demi y etanol al 70% v/v. Seque al aire los utensilios. Precalenta un agitador horizontal a 37 °C. Procedimiento Recolecte tejido renal en un tubo de 50 ml lleno de 30-40 ml de medio AdDF+++. Coloque el trozo de tejido en ~1 ml de medio en una placa de Petri de 10 cm. Picar el tejido en trozos de ~1 mm3 de tamaño usando bisturíes (Figura 1A). Transfiera el tejido picado a un tubo de 15 ml usando forrceps y bisturíes. Agregue 5 ml de AdDF +++ a la placa de Petri, lave y recoja el medio con una pipeta estéril de 10 ml. Transfiera todo este contenido al mismo tubo. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente, y retirar el sobrenadante. Agregue 3-4 ml de solución de colagenasa al tubo de 15 ml. Mueva el tubo a un agitador horizontal a 37 °C y a una velocidad de 250 rpm. Después de los primeros 15 minutos de incubación, revise la muestra y agite vigorosamente el tubo. Repetir hasta que la suspensión sea homogénea y la mayoría de los trozos de tejido hayan desaparecido, con un tiempo máximo de incubación de 45-60 min. (Figura 1B). Llene el tubo con AdDF+++ y mezcle invirtiendo el tubo 5-10x. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y retirar el sobrenadante. Si el pellet es rojo, continúe con el paso 1.2.6. De lo contrario, vaya al paso 1.2.8. Agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (consulte la Tabla de materiales)sobre el pellet celular. Golpee suavemente el tubo para volver a colocar el pellet (no lo vuelva a colocar con la punta de la pipeta). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Llene el tubo con AdDF+++. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y retirar el sobrenadante. Si las células sanguíneas aún son visibles, repita el procedimiento una vez más, a partir del paso 1.2.6. De lo contrario, continúe con el paso 1.2.8. Si hay trozos de tejido visibles en este punto del protocolo, continúe con el paso 1.2.8. De lo contrario, proceda con la medición del volumen de pellets en el paso 1.2.9. Agregue 5 ml de AdDF+++ al tubo y vuelva a suuspend con una pipeta estéril de 10 ml. Filtre la suspensión a través de un colador de células de nylon de 100 μm colocado en un tubo de 50 ml. Transfiera la suspensión filtrada a un nuevo tubo de 15 ml. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y retirar el sobrenadante. Mida el volumen del pellet de celda utilizando una pipeta p1000 establecida en un volumen conocido. Pipete con cuidado hacia arriba y hacia abajo para resuspendir sin crear burbujas de aire. Transfiera el tubo al hielo durante 1 min. Agregue un volumen de 70-75% de BME al pellet. Resuspend usando una pipeta p1000 o p200, y placa de gotas de 15 μL en una placa de cultivo celular multipano precalencida (6, 12 o 24 pomos, según el volumen total de chapado (200 μL, 6 pomos)). Gire la placa boca abajo y deje que la placa descanse en la incubadora durante 15-20 min a 37 ° C (Figura 1C). Agregue el medio de cultivo precalentado e inspeccione los cultivos (Figura 1C,D). 2. Generación de tubuloides renales humanos a partir de la orina NOTA: La orina es un ambiente hostil para las células. Es importante para una ejecución exitosa de este protocolo que las muestras de orina se procesen lo antes posible, preferiblemente dentro de las 4 h posteriores a la excreción. Mientras tanto, las muestras de orina deben almacenarse a 4 °C. Materiales Placas de cultivo de tejido multipanúculo precalentado (6, 12 y 24 pomos) durante la noche a 37 °C. Preparar medio de lavado: AdDF+++ suplementado con antibióticos de amplio espectro (0,1 mg/mL) y 10 μM Y-27632. Prepare el medio de cultivo como se describió anteriormente. Calentar a 37 °C antes de usar. Preparar la matriz BME. Mantener en hielo durante el procedimiento. Procedimiento Recoger una muestra de orina y dividirla por igual en tubos de 50 ml (Figura 2A-I). Agregue 10-20 ml de medio de lavado a cada uno de los tubos. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C (Figura 2A-II), y retirar el sobrenadante con cuidado. Agregue 10 ml de medio de lavado a cada uno de los tubos. Resuspónda cuidadosamente los gránulos usando una pipeta estéril de 10 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C(Figura 2A-III),y retirar el sobrenadante con cuidado. Vuelva a colocar los gránulos y transfiera el contenido de todos los tubos en un tubo de 15 ml. Llene el tubo con medio de lavado. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C ( Figura2A-IV), y retirar el sobrenadante. Mida el volumen del pellet de celda utilizando una pipeta p1000 establecida en un volumen conocido. Pipete con cuidado hacia arriba y hacia abajo para resuspendir sin crear burbujas de aire. Transfiera el tubo al hielo durante 1 min. Agregue un volumen del 70-75% del BME al pellet. Resuspend usando una pipeta p1000 o p200, y placa de gotas de 15 μL en una placa de cultivo celular multipano precalencida (6, 12 o 24 pomos, según el volumen total de chapado (200 μL, 6 pomos)). Gire las placas boca abajo en la incubadora durante 15-20 min a 37 °C. Agregue el medio de cultivo precalentado e inspeccione los cultivos (Figura 2B). 3. Expansión de cultivos tubuloides NOTA: Los cultivos tubuloides se pueden pasar aproximadamente cada 1-2 semanas con una proporción dividida de 1: 2-1: 3. Por lo general, se pueden expandir durante aproximadamente 15 pasajes, con variaciones específicas de la línea. Materiales Placas de cultivo de tejido multipanúculo precalentado (6, 12 y 24 pomos) durante la noche a 37 °C. Prepare el medio basal (AdDF +++) y manténgalo en hielo durante el procedimiento. Prepare el medio de cultivo como se describió anteriormente. Calentar hasta 37 °C antes de usar. Prepare la matriz BME y manténgala en hielo durante el procedimiento. Prepare el agente de reemplazo de tripsina con la adición de Y-27632 a una concentración de 10 μM. Caliente hasta 37 °C antes de su uso. Puntas p10 no filtradas en autoclave. Enfríe la centrífuga a 4 °C. Procedimiento Interrumpa las gotas que contienen los tubuloides mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p1000 utilizando el medio presente en el pozo. Use la punta para raspar el fondo del pozo, asegurándose de recolectar todas las celdas unidas al fondo. Recoger el contenido en un tubo de 15 ml. Agregue 10 ml de AdDF+++. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C, y retirar el sobrenadante. Según el tamaño del pellet, agregue el agente de reemplazo de tripsina suplementado con 10 μM Y-27632. Use 1 ml de agente de reemplazo de tripsina para 200 μL de gotas de BME que contienen tubuloides. Incubar a 37 °C durante 5 min. Use una pipeta p1000 con punta e inserte una punta p10 estéril no filtrada sobre la punta de 1000 μL. Pipete hacia arriba y hacia abajo durante 20-30x para interrumpir mecánicamente los organoides. Verifique bajo el microscopio para ver si muchos organoides intactos todavía están presentes en el tubo(Figura 3A). Si más del 10% de los organoides intactos están presentes en este punto, repita desde la incubación de 5 minutos en el paso 3.2.3 hasta la observación microscópica de organoides intactos en el paso 3.2.5 una vez más. De lo contrario, continúe con el paso 3.2.6. Llene el tubo con AdDF+++. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y retirar el sobrenadante. Mida el volumen del pellet de celda utilizando una pipeta p1000 establecida en un volumen conocido. Pipete con cuidado hacia arriba y hacia abajo para resuspendir sin crear burbujas de aire. Transfiera el tubo al hielo durante 1 min. Agregue un volumen de 70-75% de BME al pellet. Resuspend usando una pipeta p1000 o p200, y placa de gotas de 15 μL en una placa de cultivo celular multipano precalencida (6, 12 o 24 pomos, según el volumen total de chapado (200 μL, 6 pomos)). Gire las placas boca abajo y deje que la placa descanse en la incubadora durante 15-20 min a 37 ° C. Agregue el medio de cultivo precalentado e inspeccione los cultivos (Figura 3B).

Representative Results

Para el tejido renal, las estructuras tubuloides suelen aparecer dentro de los 7 días posteriores al establecimiento(Figura 1D). La falta de crecimiento aparente dentro de los primeros 7 días indica un resultado fallido del protocolo. En general, los cultivos tubuloides deben pasarse dentro de 1-2 semanas después del primer recubrimiento. Para la orina, el crecimiento celular se hace evidente aproximadamente 14-21 días después del establecimiento, con la aparición de estructuras tubuloides compactas y / o células adherentes en la parte inferior de la placa (Figura 2B). Lo más probable es que el establecimiento de cultivo haya fallado si no se puede detectar ningún crecimiento con un microscopio de campo brillante dentro de las 4 semanas posteriores al recubrimiento. Para los cultivos derivados de la orina, el primer paso generalmente ocurre entre 3 y 4 semanas. Mientras que en los primeros pasajes los cultivos tubuloides renales consisten principalmente en estructuras compactas, la presencia de tubuloides epiteliales quísticos aumenta con el aumento del número de pasajes(Figura 1D y Figura 2B). La generación exitosa de cultivos tubuloides renales humanos se puede evaluar mediante la realización de tinción inmunohistoquímica para marcadores expresados en epitelio renal tubular, como la proteína pareada del gen 8 de la caja (PAX8) (Figura 4A,B). Figura 1: Cultivos de tubuloides renales derivados de tejidos. (A) Descripción general del procedimiento para picar tejido renal. El tejido se níte hasta un tamaño de ~ 1 mm3 usando bisturíes. (B) Ejemplo de correcta digestión enzimática del tejido renal sano. El tejido se muestra antes (izquierda) y después (derecha) 45 min de digestión enzimática con colagenasa. Pocos trozos de tejido todavía son visibles en la parte inferior del tubo, y la solución debe volverse turbia, lo que indica la presencia de células en la suspensión. (C) Imagen representativa de las placas de cultivo celular después del recubrimiento de las gotas de BME que contienen el tejido renal procesado. Después de emplatar las gotas, las placas de cultivo se giran boca abajo (izquierda) y se colocan en la incubadora a 37 °C. Después de 15-20 min, el medio de cultivo precalentado se agrega al pozo (derecha). (D) Imágenes representativas de campos brillantes de cultivos tubuloides derivados de tejidos. Las primeras estructuras tubuloides se hacen visibles 2-3 días después de la primera siembra. Con el aumento del número de pasajes, los tubuloides generalmente cambian la morfología a un fenotipo más quístico. Barras de escala = 300 μm. Abreviaturas: BME = extracto de membrana basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Cultivos de tubuloides renales derivados de la orina. (A) Descripción general del procesamiento de muestras de orina. Tan pronto como sea posible después de la recolección (I), las muestras de orina se dividen en tubos de 50 ml y se diluyen en medio de lavado (II). Después de un segundo paso de lavado (III), el contenido de los tubos se agrupa y se realiza un tercer y último paso de lavado (IV) antes del emplatado. (B) Imágenes representativas de campos brillantes de cultivos tubuloides derivados de la orina. Las primeras estructuras tubuloides y las células adherentes deben ser visibles dentro de los 21 días posteriores al primer recubrimiento. Barras de escala = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Paso de cultivos tubuloides renales. (A) Imagen representativa de cultivos tubuloides renales después de la digestión enzimática. Después de completar la digestión, no debe permanecer más del 10% de las estructuras tubuloides intactas. Barra de escala = 300μm. (B) Imagen representativa de cultivos tubuloides renales después del recubrimiento. La inspección de los cultivos confirma que la mayoría de los tubuloides han sido interrumpidos. Barra de escala = 300 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Caracterización histológica de cultivos tubuloides. (A) Tinción H&E de tejido renal sano y tubuloides. Barras de escamas = 100 μm. (B) Inmunohistoquímica de PAX8 en tejido renal normal, tubuloides, tejido MRTK y organoides MRTK. La positividad PAX8 de las estructuras organoides confirma su origen epitelial renal. El tejido renal sano muestra estructuras positivas (túbulos) y negativas (glomérulos). El tejido MRTK y los organoides se incluyeron como control negativo. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina y eosina; PAX8 = gen de caja pareada 8; MRTK = tumor rabdoide maligno del riñón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los organoides se consideran avatares del tejido del que se derivan. Permiten una rápida expansión del material del paciente al tiempo que conservan las características genotípicas y fenotípicas del tejido de origen15. La tecnología organoide ha abierto recientemente las puertas para el desarrollo de modelos preclínicos más representativos, que pueden utilizarse como herramientas importantes para traducir los hallazgos del banco a la cabecera. Los tubuloides renales son modelos in vitro prometedores para probar la nefrotoxicidad inducida por fármacos, un efecto secundario común de muchos fármacos quimioterapéuticos2,8,12. Como tal, se demostró que los cultivos de organoides tumorales derivados del paciente son predictivos de la respuesta del paciente al tratamiento16,17,18. Por lo tanto, probar medicamentos de manera de alto rendimiento en tubuloides permite potencialmente una mejor definición de las ventanas terapéuticas y disminuye el riesgo de nefrotoxicidad inducida por medicamentos en los pacientes.

Se ha descrito que los antibióticos de uso común ejercen un efecto tóxico sobre los riñones19. Aunque la presencia de antibióticos de amplio espectro es necesaria para el establecimiento exitoso de los cultivos mediante la prevención de la contaminación, es importante considerar su posible nefrotoxicidad. Aunque no se han observado efectos negativos de los antibióticos en el establecimiento de cultivos tubuloides, se necesita más investigación para evaluar a fondo sus efectos. Los tubuloides pueden ser explotados para estudiar y modelar enfermedades8. Las ciliopatías (disfunción patológica de los cilios), así como otros síndromes genéticos que afectan al riñón, podrían estudiarse generando líneas tubuloides directamente de los sujetos afectados, o mediante el uso de cultivos sanos en los que se pueden introducir mutaciones impulsoras específicas de la enfermedad a través de la edición del genoma CRISPR / Cas920.

Aunque los tubuloides son cultivos renales multicelulares, carecen de varios tipos de células renales, incluyendo podocitos y células endoteliales8. Además, a diferencia de algunos otros modelos organoides derivados de ASC, los tubuloides tienen un potencial replicativo limitado, ya que se pueden cultivar durante aproximadamente 15 pasajes. Sin embargo, esta vida útil limitada puede extenderse significativamente mediante la adición de Wnt al medio de cultivo21. Se requiere una mayor optimización del protocolo de cultivo de tubuloides para hacerlos aún más representativos del riñón, incluidos los tipos de células más diferenciadas. Aunque la eficiencia del establecimiento de tubuloides a partir de muestras de tejido es muy alta (>95%), puede, en casos raros, fallar. Puede haber diferentes causas que incluyen: 1) mala calidad del material de partida(por ejemplo,tejido necrótico como consecuencia del tratamiento farmacológico), 2) sobredigestión de la muestra de tejido o 3) contaminación de la muestra primaria.

Para asegurarse de que la calidad de las muestras de tejido recibidas es suficiente para proceder con el protocolo, es importante mantener un contacto cercano con el personal de patología que realiza la evaluación del tejido en la cirugía. Si se dispone de material suficiente, su viabilidad debe confirmarse mediante un examen histológico(por ejemplo,tinción de hematoxilina y eosina). Además, para prevenir la lisis celular durante la digestión enzimática, es importante que el procedimiento de incubación no sea superior a 1 h. Por último, para evitar la contaminación, se deben agregar antibióticos y agentes antifúngicos a los medios de lavado y cultivo.

La orina puede contener células epiteliales exfoliadas que no se derivan del riñón22,lo que puede contaminar los cultivos tubuloides. Estos incluyen, por ejemplo, células de urotelio que son, a diferencia de las células tubulares renales, positivas para la proteína tumoral P63 y negativas para PAX88. Por lo tanto, se recomienda probar la positividad de PAX8 en los cultivos para confirmar la pureza de las líneas tubuloides renales establecidas antes de proceder con experimentos de seguimiento(Figura 4B).

La orina representa un ambiente hostil para las células debido a la alta presión osmótica y el bajo pH. Por lo tanto, es crucial para el éxito del protocolo que las muestras se procesen lo antes posible después de la recolección de orina. Como tal, la orina recolectada debe diluirse y lavarse ampliamente con solución tamponada lo antes posible para garantizar la presencia de células viables en el momento de la siembra. La tasa de éxito del establecimiento de tubuloides disminuirá significativamente si la orina se almacena durante varias horas antes del procesamiento. Por último, aunque estéril, la orina tiene un alto riesgo de contaminación asociado con el proceso de recolección. Por lo tanto, es importante complementar el lavado y el medio de crecimiento con antibióticos y agentes antifúngicos. Al tener en cuenta todo lo anterior, se puede lograr una tasa de éxito de aproximadamente el 50%.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los pacientes y sus familias por participar en el estudio. Agradecemos al equipo clínico que facilitó nuestra investigación. Agradecemos el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC) 850571 (J.D.), la Sociedad Holandesa del Cáncer (KWF) / Premio Alpe d’HuZes Bas Mulder (no. 10218, J.D.), el Instituto Oncode y la Fundación Children Cancer Free (KiKa no. 292, C.C.)

Materials

A83-01 Tocris 2939/10 Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634010
antiPAX8 antibody LSBio LS-B13466
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044 Stock of 50x, final concentration of  1x
BME Trevigen 3533-010-02
Collagenase Sigma Aldrich  C9407 Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF Peprotech AF-100-15 Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX – L-alanine/L-glutamine Gibco 35050061 Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes Gibco 15630106 Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells CELLSTAR 665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells CELLSTAR 662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells CELLSTAR 657160
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140163 Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin – broad-range antibiotics Invivogen ant-pm-1 Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer Roche 11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience M1817 Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent ThermoFisher Scientific 12605010
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Riferimenti

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Calandrini, C., Drost, J. Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine. J. Vis. Exp. (170), e62404, doi:10.3791/62404 (2021).
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