Generatie van menselijke nier tubuloïden uit weefsel en urine

OPMERKING: De hierin beschreven experimenten zijn goedgekeurd door de medisch ethische commissie van het Erasmus Medisch Centrum (Rotterdam) en prinses Máxima Centrum voor Kinderoncologie (Utrecht). 1. Generatie van menselijke nier tubuloïden uit weefsel Materiaal Voorwarm multiwell weefselkweekplaten (6, 12 en 24 putten) ‘s nachts bij 37 °C. Bereid basaal medium (AdDF +++) door toevoeging van 1x L-alanine / L-glutamine supplement, 1% w / v 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethaansulfonzuur (HEPES, 10 mM), en 1% Penicilline / Streptomycine antibiotica aan Advanced DMEM / F12. Bereid kweekmedium voor door 1,5% B27-supplement, 10% R-spondin-geconditioneerd medium, epidermale groeifactor (50 ng / ml), fibroblastgroeifactor-10 (100 ng / ml), N-acetylcysteïne (1,25 mM), Rho-kinaseremmer Y-27632 (10 μM), breedspectrumantibiotica (0,1 mg / ml) en A83-01 (5 μM) toe te voegen aan AdDF +++. Verwarm voor gebruik tot 37 °C. Bereid het keldermembraanextract (BME) door een aliquot een nacht bij 4 °C te ontdooien. Houd de BME op ijs tijdens de procedure. Bereid collagenaseoplossing voor door collagenase te verdunken tot een eindconcentratie van 1 mg/ml in AdDF+++, met toevoeging van 10 μM Y-27632. Warm op tot 37 °C. Bereid petrischalen van 10 cm, scalpels en pincetten. Desinfecteer het keukengerei door gedurende 20 minuten een ultraviolette lamp aan te brengen, gevolgd door wassen met desinfectiemiddel, demi-water en 70% v / v ethanol. Droog het keukengerei aan de lucht. Verwarm een horizontale shaker voor op 37 °C. Procedure Verzamel nierweefsel in een buis van 50 ml gevuld met 30-40 ml AdDF +++ medium. Plaats het stukje weefsel in ~1 ml medium in een petrischaaltje van 10 cm. Gehakt het weefsel in stukjes van ~ 1 mm3 grootte met behulp van scalpels (Figuur 1A). Breng het gehakte weefsel over in een buis van 15 ml met behulp van een tang en scalpels. Voeg 5 ml AdDF+++ toe aan de petrischaal, was en verzamel het medium met een steriele pipet van 10 ml. Breng al deze inhoud over naar dezelfde buis. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Voeg 3-4 ml collagenase-oplossing toe aan de buis van 15 ml. Verplaats de buis naar een horizontale shaker ingesteld op 37 °C en een snelheid van 250 rpm. Controleer na de eerste 15 minuten incubatie het monster en schud de buis krachtig. Herhaal dit totdat de suspensie homogeen is en de meeste stukjes weefsel zijn verdwenen, met een maximale incubatietijd van 45-60 min. (Figuur 1B). Vul de buis met AdDF+++, en meng door de buis 5-10x om te keren. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Als de pellet rood is, gaat u verder met stap 1.2.6. Ga anders naar stap 1.2.8. Voeg 1 ml lysisbuffer voor rode bloedcellen (zie de tabel met materialen)toe aan de celkorrel. Tik voorzichtig op de buis om de pellet opnieuw te suspenden (niet resuspend met pipetpunt). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vul de tube met AdDF+++. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Als er nog steeds bloedcellen zichtbaar zijn, herhaalt u de procedure nogmaals, te beginnen met stap 1.2.6. Ga anders verder met stap 1.2.8. Als er op dit punt van het protocol brokken weefsel zichtbaar zijn, gaat u verder met stap 1.2.8. Ga anders verder met de meting van het pelletvolume in stap 1.2.9. Voeg 5 ml AdDF+++ toe aan de buis en resuspend met een steriele pipet van 10 ml. Filter de suspensie door een 100 μm nylon cel zeef geplaatst op een 50 ml buis. Breng de gefilterde suspensie over naar een nieuwe buis van 15 ml. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Meet het volume van de celkorrel met een p1000-pipet die is ingesteld op een bekend volume. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspend zonder luchtbellen te creëren. Breng de buis gedurende 1 minuut over op ijs. Voeg 70-75% volume BME toe aan de pellet. Resuspend met behulp van een p1000- of p200-pipet en plaat 15 μL druppels in een voorgewarmde, multiwell celkweekplaat (6, 12 of 24 putten, gebaseerd op het totale platingvolume (200 μL, 6 putten)). Draai de plaat ondersteboven en laat de plaat 15-20 min in de couveuse rusten bij 37 °C(figuur 1C). Voeg voorgewarmd kweekmedium toe en inspecteer de culturen(figuur 1C,D). 2. Generatie van menselijke nier tubuloïden uit urine OPMERKING: Urine is een vijandige omgeving voor cellen. Voor een succesvolle uitvoering van dit protocol is het belangrijk dat urinemonsters zo snel mogelijk worden verwerkt, bij voorkeur binnen 4 uur na uitscheiding. In de tussentijd moeten urinemonsters bij 4 °C worden bewaard. Materiaal Voorwarm multiwell weefselkweekplaten (6, 12 en 24 putten) ‘s nachts bij 37 °C. Wasmedium bereiden: AdDF+++ aangevuld met breedspectrumantibiotica (0,1 mg/ml) en 10 μM Y-27632. Bereid cultuurmedium voor zoals hierboven beschreven. Warm voor gebruik op bij 37 °C. Bereid een BME-matrix voor. Blijf op ijs tijdens de procedure. Procedure Verzamel een urinemonster en verdeel het gelijkmatig in buizen van 50 ml(figuur 2A-I). Voeg 10-20 ml wasmedium toe aan elk van de buizen. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (figuur 2A-II) en verwijder het bovennatuurlijk voorzichtig. Voeg 10 ml wasmedium toe aan elk van de buizen. Reuspens de pellets voorzichtig met behulp van een steriele pipet van 10 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C (figuur 2A-III) en verwijder het bovennatuurlijk voorzichtig. Resuspend de pellets en breng de inhoud van alle buizen over in één buis van 15 ml. Vul de tube met wasmedium. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C (figuur 2A-IV) en verwijder het supernatant. Meet het volume van de celkorrel met een p1000-pipet die is ingesteld op een bekend volume. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspend zonder luchtbellen te creëren. Breng de buis gedurende 1 minuut over op ijs. Voeg 70-75% volume van de BME toe aan de pellet. Resuspend met behulp van een p1000- of p200-pipet en plaat 15 μL druppels in een voorgewarmde, multiwell celkweekplaat (6, 12 of 24 putten, gebaseerd op het totale platingvolume (200 μL, 6 putten)). Draai de platen ondersteboven in de couveuse gedurende 15-20 min bij 37 °C. Voeg voorgewarmd kweekmedium toe en inspecteer de culturen(figuur 2B). 3. Uitbreiding van tubuloïde culturen OPMERKING: Tubuloïde culturen kunnen ongeveer elke 1-2 weken worden gepasseerd met een splitverhouding van 1: 2-1: 3. Ze kunnen meestal worden uitgebreid voor ongeveer 15 passages, met lijnspecifieke variaties. Materiaal Voorwarm multiwell weefselkweekplaten (6, 12 en 24 putten) ‘s nachts bij 37 °C. Bereid basaal medium (AdDF+++) en houd het tijdens de procedure op ijs. Bereid cultuurmedium voor zoals eerder beschreven. Warm voor gebruik op tot 37 °C. Bereid de BME-matrix voor en blijf tijdens de procedure op ijs. Bereid trypsinevervangend middel met toevoeging van Y-27632 tot een concentratie van 10 μM. Warm vóór gebruik op tot 37 °C. Autoclaaf niet-gefilterde p10 tips. Koel de centrifuge tot 4 °C. Procedure Verstoor de druppels met de tubuloïden door op en neer te pipetteren met een p1000-pipet met behulp van het medium dat in de put aanwezig is. Gebruik de punt om de bodem van de put te schrapen en zorg ervoor dat u alle cellen verzamelt die aan de bodem zijn bevestigd. Verzamel de inhoud in een buis van 15 ml. Voeg 10 ml AdDF+++ toe. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg op basis van de grootte van de pellet trypsinevervangend middel aangevuld met 10 μM Y-27632 toe. Gebruik 1 ml trypsinevervangend middel voor 200 μl BME-druppels die tubuloïden bevatten. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Gebruik een p1000 pipet met punt en plaats een niet-gefilterde, steriele p10-tip over de punt van 1000 μL. Pipetteer 20-30x op en neer om de organoïden mechanisch te verstoren. Controleer onder de microscoop of er nog veel intacte organoïden in de buis aanwezig zijn(figuur 3A). Als op dit punt meer dan 10% van de intacte organoïden aanwezig is, herhaal dit dan nogmaals van de incubatie van 5 minuten in stap 3.2.3 tot de microscopische waarneming voor intacte organoïden in stap 3.2.5. Ga anders verder met stap 3.2.6. Vul de tube met AdDF+++. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Meet het volume van de celkorrel met een p1000-pipet die is ingesteld op een bekend volume. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspend zonder luchtbellen te creëren. Breng de buis gedurende 1 minuut over op ijs. Voeg 70-75% volume BME toe aan de pellet. Resuspend met behulp van een p1000- of p200-pipet en plaat 15 μL druppels in een voorgewarmde, multiwell celkweekplaat (6, 12 of 24 putten, gebaseerd op het totale platingvolume (200 μL, 6 putten)). Draai de platen ondersteboven en laat de plaat 15-20 min rusten in de couveuse bij 37 °C. Voeg voorgewarmd kweekmedium toe en inspecteer de culturen(figuur 3B).