استراتيجيات لتحسين الحصول على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد
Summary
يتطلب الطلب المتزايد على جمع البيانات على نطاق واسع في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد إجراءات اكتساب الصور عالية الإنتاجية. ويرد هنا بروتوكول ينفذ التطورات الأخيرة لاستراتيجيات الاستحواذ المتقدمة التي تهدف إلى تعظيم كفاءة الوقت والإنتاجية لجمع البيانات الطبوغرافية.
Abstract
التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryoET) هو طريقة قوية لدراسة البنية ثلاثية الأبعاد للعينات البيولوجية في حالة قريبة من الأم. تتيح عملية cryoET الحديثة الحالية إلى جانب تحليل متوسط التخطيط الفرعي التحديد الهيكلي عالي الدقة للمجمعات الجزيئية الكلية الموجودة في نسخ متعددة داخل عمليات إعادة البناء الطبوغرافي. تتطلب التجارب الطبوغرافية عادة الحصول على كمية كبيرة من سلسلة الميل عن طريق المجاهر الإلكترونية المتطورة ذات تكاليف التشغيل التشغيلية الهامة. على الرغم من أن الإنتاجية والموثوقية لروتين الحصول الآلي على البيانات قد تحسنت باستمرار على مدى السنوات الأخيرة ، فإن عملية اختيار المناطق ذات الاهتمام التي سيتم فيها الحصول على سلسلة الميل لا يمكن أن تكون آلية بسهولة ولا تزال تعتمد على الإدخال اليدوي للمستخدم. لذلك، إعداد جلسة عمل جمع البيانات على نطاق واسع هو إجراء تستغرق وقتا طويلا التي يمكن أن تقلل إلى حد كبير من الوقت المجهر المتبقية المتاحة للحصول على سلسلة الميل. هنا، يصف البروتوكول التطبيقات التي تم تطويرها مؤخرا استنادا إلى حزمة SerialEM وبرنامج PyEM الذي يحسن بشكل كبير من كفاءة الوقت لفحص الشبكة وجمع بيانات سلسلة الميل على نطاق واسع. يوضح البروتوكول المقدم كيفية استخدام وظائف البرمجة النصية SerialEM لأتمتة تعيين الشبكة بالكامل، وتعيين مربع الشبكة، واكتساب سلسلة الميل. علاوة على ذلك، يصف البروتوكول كيفية استخدام PyEM لتحديد أهداف اكتساب إضافية في وضع الاتصال بعد بدء جمع البيانات التلقائي. ولتوضيح هذا البروتوكول، يتم وصف تطبيقه في سياق جمع البيانات المتطورة لسلسلة الميل Sars-Cov-2. خط الأنابيب المعروض مناسب بشكل خاص لتعظيم الكفاءة الزمنية لتجارب التصوير المقطعي التي تتطلب اختيارا دقيقا لأهداف الاستحواذ وفي الوقت نفسه كمية كبيرة من سلسلة الميل التي سيتم جمعها.
Introduction
تعتمد طرق المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) على تصوير العينات البيولوجية عن طريق المجهر الإلكتروني (TEM) بعد التزجيج السريع ، وهي عملية إعداد عينة تحافظ على الهياكل الجزيئية والخلوية للعينات في حالة قريبة من الأصلية ورطبة1،2. في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryoET) يتم تحقيق نموذج ثلاثي الأبعاد للعينة التزجيج من خلال الحصول على عدد من الصور لنفس المنطقة ذات الاهتمام من اتجاهات مختلفة ، ما يسمى بسلسلة الميل ، تليها إعادة البناء الحسابي للمجلد الطبوغرافي3. وقد نضجت هذه التقنية التصوير المتقدمة في طريقة قوية للتحقيق الهيكلي للعمليات البيولوجية في سياق بيئاتها الخلوية الأصلية4،5،6.
بالإضافة إلى التحليل الهيكلي الفائق للعينة التزجيج ، يمكن الحصول على عمليات إعادة بناء عالية الدقة للمجمعات الجزيئية الكبيرة الموجودة في نسخ متعددة داخل المجلد الطبوغرافي عن طريق تطبيق مخطط فرعي بمتوسط5. ويستند هذا النهج إعادة الإعمار على المحاذاة التكرارية ومتوسط المجلدات الفرعية التي تحتوي على هيكل الاهتمام ويهدف إلى زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وحل إعادة الإعمار النهائي7،8. يعتمد متوسط الرسم الفرعي على جمع ومعالجة كمية كبيرة من البيانات التي تتطلب في كثير من الأحيان الحصول على مئات من سلسلة الميل عن طريق TEMs الراقية مع تكاليف تشغيل تشغيلية مرهقة.
حاليا إعداد مثل هذه الدورات cryoET الآلي هو عملية تستغرق وقتا طويلا التي تعتمد عادة على إدخال المستخدم اليدوي9،10،11. عادة، يتم تحديد الأهداف عن طريق الفحص البصري للشبكة المعينة ثم إعدادها لاحقا لجمع البيانات تلقائيا. غالبا ما تتأثر كفاءة المستخدم في تحديد نقاط الاستحواذ بطبيعة العينة ، وتصبح صعبة بشكل خاص عند تحليل الجزيئات الكلية المنقى بتركيز دون المستوى الأمثل أو في حالة الأحداث النادرة داخل البيئات الخلوية المزدحمة ، مما يعني استخدام النهج المترابطة12. وعلاوة على ذلك، تتطلب مهام سير العمل الحالية الحصول على الصور أثناء الإعداد في التكبيرات المختلفة التي سيتم استخدامها لاحقا لتوطين دقيق وتوسيط الهدف أثناء الاستحواذ الآلي11و13و14. تعتبر خطوات إعادة المحاذاة عالية الدقة هذه حاسمة للتطبيقات عالية الدقة، والتي تتطلب إجراء التصوير عند تكبير عالي وتتطلب خطوات مركزة دقيقة للاحتفاظ بمنطقة الاهتمام داخل مجال الرؤية الصغير الناتج. بالإجمال، يتم الالتزام بعدة ساعات من كل جلسة جمع بيانات لهذا الإجراء الذي يستغرق وقتا طويلا والذي لا تشارك خلاله TEM في الحصول على سلسلة الميل. لذلك، اعتمادا على مقدار سلسلة الميل المطلوبة، يمكن أن يكون لتحديد نقاط الاستحواذ وإعدادها تأثير كبير على وقت المجهر المتاح لجمع البيانات أثناء جلسة cryoET.
وصف هنا هو بروتوكول الأمثل على أساس حزمة البرامج SerialEM15 وأحدث إصدار برنامج PyEM16 لرسم خريطة الشبكات ، خريطة مربعات الشبكة ، وتحديد الأهداف ، وإعداد اقتناء البيانات الآلي لجمع سلسلة الميل على نطاق واسع. المفهوم الرئيسي لهذا النهج هو تزويد SerialEM بالصور التي تم إنشاؤها حسابيا من قبل PyEM لكل عنصر اقتناء ، يطلق عليه خرائط افتراضية ، لتوطين دقيق ومركز الهدف. لكسب وقت الامتلاك الفعلي، يتم اختيار الأهداف وكذلك إنشاء الخرائط الافتراضية خارج الخط باستخدام مثيل وهمية ثانية من SerialEM، وفصل عملية اختيار أهداف الاستحواذ من عمليات TEM. في حين لا تتناول كيفية زيادة جودة البيانات13،17 أو سرعة الحصول على سلسلة الميل18،19، يركز هذا البروتوكول في المقام الأول على استراتيجيات لتحسين كفاءة الوقت لإعداد جلسات cryoET الآلي على نطاق واسع. ولذلك، فإن تنفيذ البروتوكول المقدم مخصص للعلماء الذين يؤسسون سير عمل لجمع بيانات cryoET يرغبون في تعظيم عائد اكتساب البيانات الآلي عن طريق زيادة وقت المجهر المتاح لاكتساب سلسلة الميل.
Protocol
Representative Results
Discussion
من تقنية متخصصة، وقد نضجت الآن cryoET إلى طريقة واسعة النطاق لإجراء الدراسات الهيكلية على المستوى الخلوي والجزيئي مع قرار لم يسبق له مثيل يمكن الوصول إليها21،22. وقد وضع الطلب المتزايد باستمرار على التصوير cryoEM ضغطا على الموارد المحدودة المتاحة للوصول إلى هذه التكنولوجيا. وعلى الرغم من افتتاح عدد من مرافق التبريد الوطنية وجهود المعاهد العلمية لزيادة قدرتها على دعم احتياجات المجتمع في جميع أنحاء العالم، فإن إمكانية الوصول إلى أدوات التبريد لا تزال محدودة، وبالتالي يجب أن يستخدم المستخدمون الوقت المتاح لجمع البيانات بكفاءة لزيادة غلة كل دورة تصوير مصغر إلى أقصى حد. الحاجة إلى الحصول على مئات من سلسلة الميل جنبا إلى جنب مع الوقت المحدود المتاح لجمع البيانات ودعا إلى إجراءات جديدة لاكتساب الصور لتحقيق إنتاجية أفضل دون المساس بجودة البيانات. وقد زادت التطورات الأخيرة في الأجهزة والتصوير سير العمل إلى حد كبير سرعة اقتناء سلسلة الميل18،19، مما أدى إلى تحول كبير في النسبة بين الوقت الذي يقضيه لاقامة نقطة الاستحواذ والوقت اللازم لاكتساب سلسلة الميل الفعلي. وإجمالا، أصبح إجراء إنشاء نقاط الاستحواذ أحد الاختناقات الرئيسية لسرعة إنتاجية جلسات cryoET التي يمكن تحقيقها.
البروتوكول الأمثل المعروض هنا مكننا من إعداد 171 موقعا ، في وضع خارج الخط ، للحصول على الطبوغرافي الآلي خلال اليوم الأول من جلسة cryoET بينما كان المجهر منخرطا بنشاط في عمليات أخرى (على سبيل المثال ، رسم الخرائط المربعة ، وضبط ، والحصول على سلسلة الميل الآلي) ، وبالتالي دون التأثير على وقت المجهر المتاح لجمع البيانات. بالإضافة إلى زيادة الإنتاجية إلى أقصى حد من جلسة cryoET ، يقلل هذا الخط بشكل كبير من مقدار الوقت الذي استثمره المستخدم في المرحلة التحضيرية لجلسة جمع البيانات الآلية. في البروتوكول الموصوف، يطلب من المستخدم استعراض مربعات الشبكة المعينة لتحديد المناطق المناسبة ذات الاهتمام وإضافتها إلى Serial EM Navigator كنقاط اقتناء. سيتم بعد ذلك معالجة كافة الأهداف تلقائيا على دفعات داخل SerialEM بواسطة أداة PyEM لإنتاج الخرائط الظاهرية16. وبالتالي فإن النهج الحسابي المقدم أسرع بكثير من الحصول على خرائط تثبيت حقيقية من خلال القضاء على فترات الانتظار المرتبطة بحركة المرحلة ، واكتساب الصور ، وتغيير ظروف التصوير بين العرض والمعاينة ، وإعادة تأكيد هذه الخطوات في نهاية المطاف مع التمركز عند التكبير العالي. بالإضافة إلى ذلك ، حيث أن كل صورة مكتسبة تؤدي إلى تراكم جرعة الإلكترون على الكائن ذي الاهتمام23، فإن استخدام الخرائط الافتراضية لإعادة تنظيم الأهداف بدقة يقلل من الأضرار الإشعاعية التي أدخلت في المرحلة التحضيرية لجلسة cryoET قبل اكتساب سلسلة الميل الفعلي. يستخدم البروتوكول الموضح هنا الخرائط الافتراضية المتوسطة والتكبير العالية (المعاينة والعرض على التوالي) لإعادة تنظيم الهدف قبل الحصول على سلسلة الميل. يمكن تعديل هذا الإجراء بسهولة لاستخدام صورة عرض التكبير الوسيط فقط عندما تكون دقة المحاذاة أقل أهمية ، على سبيل المثال ، في حالة الهياكل الكبيرة حيث تكون دقة الهدف النهائي أقل قلقا10 أو لعينات تحليل الجسيمات الفردية التي تنتشر بشكل سيئ على شبكة التبريد التي تتطلب اختيار المستخدم اليدوي لكل نقطة اكتساب24، 25. وأخيرا، فإن اتباع نهج يقوم على الاستخدام غير الإلكتروني لمثيل تسلسلي وهمي ييسر أيضا إعداد نقاط الاقتناء عن طريق الاتصال عن بعد عن طريق تقليل الحاجة إلى الوجود المادي للمستخدم على المجهر، مما يتيح مزيدا من المرونة من حيث التنظيم التشغيلي للمرفق.
وقد أدى التقدم الأخير في التكنولوجيا وأساليب cryoET إلى تحسين سرعة وموثوقية جلسات جمع البيانات الآلية بشكل كبير. ومع ذلك، يلزم إجراء مزيد من التطورات لمعالجة الخطوات المتبقية التي تحد من معدل هذه الطريقة. وعلى الأخص، فإن الخطوة الأولية لرسم الخرائط الشبكية والمربعة أصبحت الآن واحدة من الاختناقات الرئيسية لإعداد الدورة، مما يولد الحاجة إلى تحسينات في الأجهزة تهدف إلى زيادة سرعة حركات مرحلة المجهر واكتساب الصور بواسطة كاشفات الإلكترون المباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وضع نهج للتعلم الآلي لأتمتة عملية تحديد الأهداف بالكامل سيكون أمرا حاسما للقضاء على الحاجة إلى التفتيش البصري للمستخدمين لاختيار المناطق ذات الاهتمام، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ويعتمد على خبرة المستخدمين.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بالدعم المقدم من وحدة البيولوجيا الهيكلية والحسابية ومرفق المجهر الإلكتروني الأساسي في المختبر الأوروبي للبيولوجيا الجزيئية في هايدلبرغ، ألمانيا ومن iNEXT-Discovery (رقم المشروع 871037). نحن ممتنون للغاية للدعم الممتاز من مؤلف حزمة برامج SerialEM ، البروفيسور ديفيد ماسترونارد. كما نشكر هيرمان فونغ على القراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
Riferimenti
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. . Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. . Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. . Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. . Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O’Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
