在这里,我们提供一个分步协议,为肿瘤行为分析、全山免疫荧光和共焦成像定量提供生成异种移植物的提示和指南。
斑马鱼幼虫异种草被广泛用于癌症研究,用于人体癌症 的体内 和实时研究。快速可视化对抗癌疗法(化疗、放射治疗和生物)、血管生成和转移的反应与单细胞分辨率的可能性,将斑马鱼异种草模型作为开发前cclin研究的首选。
与其他模型相比,斑马鱼幼虫异种草检测具有几个实验优势,但最引人注目的可能是尺寸尺度的缩小,从而缩短了时间。这种规模的缩小允许单细胞成像,使用相对较少的人体细胞(与活检兼容),中高通量药物筛选,但最重要的是使检测时间显著缩短。所有这些优势使得斑马鱼异种草检测对于未来的个性化药物应用极具吸引力。
许多斑马鱼异种移植协议已经开发与人类肿瘤的广泛多样性:然而,仍然缺乏一个普遍和标准化的协议,有效地产生斑马鱼幼虫异种草。在这里,我们提供一个分步协议,提供生成异种移植的提示和肿瘤行为分析、全山免疫荧光和共焦成像定量的指南。
斑马鱼(丹尼奥·雷里奥)正在成为研究发育和疾病的强大的脊椎动物模型有机体。斑马鱼与人类1,2共享高度保存的遗传(约70%的遗传同源和~84%的疾病相关基因)和基本的器官形态特征。这种保护允许使用斑马鱼模型几个人类疾病,包括癌症3,4。
斑马鱼的处理和维护比小鼠容易得多,成本更划算,因为小鼠体积小,常年高产,外来受精3,5。斑马鱼胚胎在生命的头5-7天不需要活喂养,并被用作发育、感染和癌症1、4、6、7的有效模型。斑马鱼胚胎在受精后48小时孵化(hpf),是自由游泳动物,所有器官形成,跳动的心脏和功能循环系统,肝脏,大脑,肾脏骨髓等1,3。此外,在这个发展阶段,只有与生俱来的免疫力在起作用,适应性免疫仍在发展,允许人类细胞普遍有效移植,而无需使用免疫功能减小突变体7,8。然而,重要的是要注意,并非所有的人类细胞都同样具有9,例如,对于白血病细胞,它表明噬细胞(嗜中细胞和巨噬细胞)需要耗尽才能有效移植10。
斑马鱼的遗传可遗传性和早期胚胎阶段的光学透明度允许高分辨率的单细胞内视成像,从而在生物学的不同领域建立最先进的成像技术。此外,在癌症的背景下,这些功能是有用的实时研究宿主肿瘤相互作用的最初阶段,如研究血管原性和转移潜力,以及与天生的免疫系统的相互作用8,9,11,12,13。
虽然在短的异种移植检测中,没有时间进行转移性”进化”——但可以分析肿瘤细胞的转移能力(即它们通过转移步骤(如入侵、内化、循环生存、外泄和殖民化)的效率,从而在体内和实时8、11、13、14中研究这些过程。
其生命周期的特点使斑马鱼成为癌症中个性化医学的独特模式。测定可以在较短的时间跨度内进行,结果在几周内获得7、8、9、11、12、15、16。这些检测的可耐性和可行性为医生和研究人员提供了获得转化结果的可能性,这些结果对癌症患者非常有用,而对于癌症患者来说,时间是一个基本需求。
尽管越来越多的尝试产生成功的斑马鱼胚胎异种移植物,仍然需要标准化的注射程序,以及评估细胞生存能力和注射后的肿瘤行为。
在此协议中,我们为研究人员提供了一个清晰而详细的分步指南,用于在斑马鱼胚胎中注入人类癌细胞系,以及随后对肿瘤细胞行为的固定、免疫染色、成像和定量。
斑马鱼作为癌症发展和药物筛选的典范的重要性日益增强,导致许多出版物3,4,7,13,14,16,18,19,20,21。然而,在斑马鱼胚胎中注入癌细胞是一种需要高水平灵巧的技术,这对研究人员来说可能具有挑战性。在本协议中,我们旨在提供实用信息和一些提示,以帮助克服建立斑马鱼胚胎异种草的初始挑战。
细胞处理事先注射
这种优化的协议,为生成斑马鱼异种草与细胞系可以适应不同类型的(癌症)细胞与不同的形态。我们建议,用于斑马鱼异种草的所有细胞系均不含支原体。与其他细菌污染不同,支原体在细胞培养中的存在不会产生在显微镜22下很容易检测到的变化。支原体污染可能影响细胞系的移植潜力、它们对药物的敏感性以及斑马鱼胚胎的生存能力。
虽然细胞可能会继续长期增殖,但其表型和基因型可能容易发生变化。熟悉文化中细胞系的形态和行为很重要。我们建议在 3-12 之间解冻后保留细胞通道的数量,以获得可重复的结果。因此,应定期进行支原体测试。
细胞应处于日志阶段(在达到汇合之前呈指数增长阶段~70%)在注射当天。这将使肿瘤的独特特征得到充分的增强和适当发展。为了防止异种移植细胞表型的变化,保持实验之间注射的汇合至关重要。注射的细胞数量可以适应每个细胞系的特征,因为有些细胞可能需要更高的注射密度才能在斑马鱼胚胎中茁壮成长。
细胞标记考虑
为了更好地可视化人类肿瘤细胞进行注射和未来分析,肿瘤细胞可以贴上荧光染料的标签。由于细胞大小的差异,细胞系中细胞/cm2的总数因细胞系而异。这将影响染色协议的功效以及为注射而收获的细胞数量。每个烧瓶(即 Hs578T)或在集群中生长(即 BFTC905)的大细胞需要为单个实验汇集多个烧瓶。在这种情况下,细胞的染色不应该直接在烧瓶中进行,因为这将导致使用过量的染料(高成本)。另一方面,对离心周期过高高度敏感的细胞以及每瓶产生高数的细胞(即 HCT116)可直接在烧瓶中染色,然后用 EDTA/细胞刮刀分离(有关更多信息,请参阅表 1)。
尽可能,不要使用酶方法,而是在注射当天使用EDTA分离细胞,使细胞更快地恢复细胞-细胞结,并接受更少的离心步骤。然而,如果细胞对EDTA敏感,非常粘附或在群中生长 – 可以应用酶方法。注射理想浓度的优化以及注射介质的优化取决于每个细胞系的特性,因此可能需要一些调整(表1)。
微投射校准
与将寡核苷酸或药物输送到斑马鱼胚胎相反,无偿使用无偿药物在使用细胞系进行异种移植时不用于校准针头。注射一段时间后,细胞会开始堵塞,有必要切针尖以增加其直径或完全改变针头。此过程妨碍了格栅校准。
为了解决这个问题,分配的细胞数量受弹出压力和达到1-3脉冲内胚胎眼大小所需的时间的调节。然后,为了进一步控制肿瘤大小,在1 dpi,异种草根据肿瘤大小排序,如图6 B-B所示。如图6C示例所示,这种分拣方法可有效减少肿瘤大小的变化:如果我们将它们汇集在一起(+、+、++),STEV 是 +类(+906 细胞到 +422 细胞)的两倍,系数变化为 +31.9%,而 +类为 14,5%。由于注射的参考是体积,细胞总数因细胞类型而异 – 取决于细胞的大小和形状。例如,像乳腺癌Hs578T这样细胞质大的细胞产生小得多的肿瘤(~600个细胞)。此外,每个细胞系需要不同数量的细胞。例如,HT29 CRC和RT112尿膀胱癌细胞系表明,注射的细胞数量越高,斑马鱼的死亡率就越高。因此,在开发异种移植物时需要一段时间的优化来测试细胞系是否对胚胎有毒性作用,或者需要更高/更低的注射密度。
注射部位
生成斑马鱼胚胎异种移植物时最常见的差异之一是注射部位。蛋黄通常是注射的首选地点,因为它易于使用。然而,我们观察到,注射在蛋黄中的细胞有更高的死亡倾向。虽然技术上比较困难,但我们建议注射PVS,并尽可能远离心脏。在PVS中,细胞可以聚集、招募血管和免疫细胞,如果它们表现出转移特征8、11,则可以迁移、侵入、外化并形成微转移。
增大效率
由于基底细胞死亡/存活/增殖程度不同,而且由于每个细胞系可能显示9的与生俱来的免疫原性,预计细胞系之间的移植效率和肿瘤大小在4dpi的差异。
转移
转移包括一个多步骤级联的事件,可以分为两个任意阶段。在第一阶段,肿瘤细胞必须脱离原位,迁移和入侵相邻的组织,然后侵入血液。在第二阶段,肿瘤细胞必须在循环中存活,从血液或淋巴血管中外泄,最后在23号二级位聚。为了区分这些早期和后期事件,并解决不同肿瘤细胞执行这些步骤的潜在/熟练程度,我们设计了一个简单的检测。
一般来说,当注射到PVS中时,肿瘤细胞可以直接进入循环,然后被物理困在细胞造血组织(CHT)(尾部区域)中。然而,根据每个肿瘤细胞的特征 – 我们已经看到,一些肿瘤细胞留在CHT 4 dpi,并能够形成微转移,而其他肿瘤细胞消失(在被夹在CHT后清除)。
因此,通过比较微转移效率(在4分贝),当细胞直接进入循环 – CIRC(细胞只需要经历转移的后期步骤)与时不 – 没有保监会(细胞需要经过早期和后期的步骤,才能形成微转移),我们可以评估其早期或后期转移的潜力。我们观察到肿瘤细胞可以有效地形成微介质在CHT在两组(CIRC和NO CIRC),表明这些细胞有能力经历转移级联的所有步骤(SW480和MDA-MB-468例如)8,11。相比之下,其他肿瘤细胞在这两组的转移潜力非常低,几乎从来没有作出微转移,即使注射到循环(即,可见的CHT在24hpi,但在4 dpi他们不再存在,Hs578T例如)8。然而,我们清楚地发现了另一个群体——一个只有在注入循环时才能形成微代谢的群体(我们只能观察保监会组中的微代谢)。这表明,这些细胞在执行转移级联的第一步效率较低,但另一方面,它们能够在循环中生存、外化和殖民遥远的部位。
免疫染色和成像
固定前,此注塑方案可用于其他实时成像方法,如活微分干扰对比 (DIC) 显微镜、旋转盘显微镜、高分辨率实时共焦成像和光片显微镜等。
当通过荧光立体显微镜观察时,死细胞和细胞碎片看起来是明亮的,并且可能被误认为是活细胞,特别是如果研究的目的是评估细胞系的转移潜力。我们想强调使用特定的生存能力标记和DAPI进行共焦成像的重要性,以评估肿瘤和微转移的生存状态。此外,使用特定的人类抗体来检测人体细胞(如反人类线粒体或反人类HLA)也是至关重要的。在实施该协议时,列车实验者通过比较立体显微镜中的污渍和对焦图像来眼睛。一段时间后,实验者可以清楚地区分荧光立体显微镜中活细胞的碎片。
虽然其他方法量化肿瘤负担,如整个荧光区被广泛使用,我们建议执行全安装免疫染色和共焦成像作为一个更准确的方法。不仅嗜脂染料染色的效率非常可变(即,有些细胞染色良好,而另一些细胞则不是-可能是由于其膜的脂质含量),而且很多时候嗜脂染料形成聚合物,死细胞往往更亮 – 产生一些可能被误认为是活细胞的神器。
细胞可以用荧光蛋白进行转化,以帮助跟踪细胞并跳过细胞标签。但是,请确保转导细胞和非转导细胞在斑马鱼异种草中产生相同的结果。
此外,巨噬细胞可以使这些荧光细胞碎片成为荧光标记和迁移,产生假阳性转移细胞。因此,我们推荐一系列分析工具,当然可以扩展到许多其他读数,以便更准确地解释肿瘤行为:
对于控制癌细胞 HCT116 Z 堆中的切片(平均核直径为 10-12μm)与 DAPI 计数器之间的 5μm 间隔的共焦采集,我们观察到,50% 的细胞在连续两片之间共享。因此,如果计算每片,则计算相同细胞两次的风险很高。在切片之间来回移动以避免量化问题,可产生耗时且容易出错的技术。为了简化细胞总数的量化,并允许研究人员之间有更多的可重复性,我们创建了本协议8中先前描述的肿瘤大小公式。
我们包括一个校正编号 (1.5), 以占切片之间共享的约 50% 的细胞。我们发现研究人员之间对整个肿瘤的人工计数平均误差为20%。使用该公式的两名研究人员有2%的错误。此公式的使用具有 93% 的准确率和 98% 的可重复率。我们还测试了自动化方法,但它们显示阈值设置导致的错误大于 50%。
由于凋亡细胞的特点,活性卡斯帕斯3细胞的定量比较困难。为了减少错误和结果的变化,我们建议由同一研究人员计算控制和实验样本。此外,在学习这项技术时,新研究人员必须计算经验更丰富的研究人员已经量化的图像,以比较结果并进行训练。
如有需要,可以延长检测的长度。然而,重要的是要考虑到斑马鱼幼虫需要从受精后7天(注射后5天)开始进行活食喂养。此外,适用于受精后6天以上的幼虫的动物福利准则和条例可能有所不同。
该协议提供了有用的工具,使单个研究人员能够每小时注射约200-300个斑马鱼幼虫:并在三周内获得完整检测的结果,包括分析和统计解释。我们希望,这一协议可以帮助研究人员成为专家,在产生斑马鱼异种草。这并不容易:你需要练习,但你会到达那里。祝你好运!
The authors have nothing to disclose.
我们感谢香帕利莫基金会,康根托(LISBOA-01-0145-FEDER-022170,由FCT/利斯博亚2020共同出资)提供资金。FCT 奖学金,用于副总裁(SFRH/BD/118252/2016)、MML(PD/BD/138203/2018)。Fior 实验室的所有成员进行批判性讨论;B. 科斯塔和C.雷贝洛·德阿尔梅达分享数据;和我们的实验室成员 C. 雷贝洛 · 德 · 阿尔梅达, M. 巴罗佐和 L. 莱特参与视频。我们要感谢CF鱼类设施(C.Certal,J.蒙泰罗等人)和尚帕利莫沟通,活动和外展团队,特别是亚历山大·阿津海拉的梦幻般的电影制作和卡塔琳娜·拉莫斯和特雷莎·费尔南德斯的帮助。
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |