JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

الجينات تدق في كريسبر / Cas9 وفرز الخلايا في خطوط الخلايا الماكروفاج و تي

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

يستخدم هذا البروتوكول المراسلات الفلورية وفرز الخلايا لتبسيط التجارب في الماكروفاج وخطوط الخلايا التائية. وتستخدم اثنين من البلازميدات لهذه التجارب المبسطة في طرق، وهي CRISPR/Cas9- وDsRed2 التعبير عن البلازميد وplasmid المانحة إعادة التركيب متجانسة التعبير عن EBFP2، والتي يتم دمجها بشكل دائم في مكان Rosa26 في الخلايا المناعية.

Abstract

تتطلب دراسات الجينوم الوظيفية للجهاز المناعي التلاعب الجيني الذي ينطوي على حذف الجينات المستهدفة وإضافة عناصر إلى البروتينات ذات الاهتمام. تحديد وظائف الجينات في نماذج خط الخلية مهم لاكتشاف الجينات واستكشاف الآليات الجوهرية للخلايا. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني للخلايا المناعية مثل الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة باستخدام CRISPR / Cas9 بوساطة طرق في صعبة بسبب انخفاض كفاءة العدوى من هذه الخلايا ، وخاصة في حالة هادئة. لتعديل الجينات في الخلايا المناعية، يتم استخدام اختيار مقاومة الأدوية والنواقل الفيروسية عادة لإثراء الخلايا التي تعبر عن نظام CRIPSR/Cas9، مما يؤدي حتما إلى تدخل غير مرغوب فيه للخلايا. في دراسة سابقة، قمنا بتصميم المراسلين الفلوريين المزدوجين إلى جانب CRISPR/Cas9 التي تم التعبير عنها بشكل عابر بعد الصعق الكهربائي. هذا الحل التقني يؤدي إلى حذف الجينات بسرعة في الخلايا المناعية; ومع ذلك ، فإن طرق الجينات في الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية والكوافير دون استخدام اختيار مقاومة الأدوية أو ناقلات الفيروسات هو أكثر تحديا. في هذه المقالة، نظهر أنه باستخدام فرز الخلايا للمساعدة في اختيار الخلايا التي تعبر بشكل عابر عن بنيات CRISPR/Cas9 التي تستهدف مكان Rosa26 بالاشتراك مع بلازميد المانح، يمكن تحقيق طرق الجينات في كل من الخلايا التائية وال الضامة دون إثراء مقاومة للأدوية. وكمثال على ذلك، نعرض كيفية التعبير عن ACE2 البشري، وهو مستقبل للسارس-كوف-2، المسؤول عن وباء كوفيد-19 الحالي، في الضامة RAW264.7 من خلال إجراء تجارب طرق. يمكن استخدام هذه الخلايا الجينية على نطاق واسع للدراسات الميكانيكية.

Introduction

الخلايا المناعية حاسمة للدفاع ضد مسببات الأمراض. مطلوبة على حد سواء المناعة الفطرية والتكيفية لإزالة المصابات والحفاظ على التوازن النسيج1،2. نماذج خط الخلية هي أدوات أساسية لفهم الأسس الجزيئية للجهاز المناعي الثدييات. يتم استخدامها في المقايسات الوظيفية في المختبر ، مثل تلك التي تصمم تنشيط الخلايا التائية البشرية ، وفي تحديد وظيفة العوامل الوراثية في تنشيط أو تخفيف الاستجابات المناعية3،4. من المهم ملاحظة أن جهاز المناعة الثديي غير متجانس بشكل كبير ، وبنفس القدر من الأهمية ، يتحكم عدد كبير من الجزيئات في التمايز والهجرة ووظيفة نوع الخلية المحدد5،6.

تتجمع بانتظام قصيرة باليندروميك يكرر (CRISPR) / Cas9 أدوات تحرير الجينوم تسمح للتلاعب الجيني لأنواع الخلايا المحددة، مما يسهل التعليق الوظيفي للجينات بطريقة دقيقة7،8. وقد وصفت العديد من البروتوكولات المنشورة تسليم CRISPR / Cas9 في شكل مجمعات الحمض النووي الريبي Cas9 دليل المعروفة باسم ريبونوكليوبروتس (RNPs) في خلايا HEK293، خطوط الخلايا جوركات، الخلايا التائيةالأولية 9،10،الضامة11،12،13،الخلايا الجذعية14،وغيرها15،16. في هذه البروتوكولات ، يتم عادة وضع علامات الجينات عن طريق دمج علامة الفلورسنت إلى البروتينات الذاتية17،18. ومع ذلك بذلت محاولات قليلة لاستخدام المراسلين الفلورسنت المزدوج، والتي تتوافق مع فرز خلية واحدة، لتسهيل التجارب طرق في19،20،لا سيما في الخلايا المناعية.

تتطلب التحليلات الميكانيكية المتعمقة التي تهدف إلى فهم وظائف عامل وراثي جديد في الخلايا المناعية بشكل عام حذف جين معين من نوع الخلية ، وتجارب الإنقاذ الجيني ، وتحديد تفاعله بشكل مثالي. على الرغم من أن أساليب التحسين من الحذف الجيني للجينات في الخلايا المناعية قد نشرت9،15،21، تم الإبلاغ عن طرق أقل بكثير لإدخال أليليس طرق في وظائف متعددة لفهم الاستجابة المناعية. لذلك، نهدف في هذا البروتوكول إلى وصف بروتوكول فعال وقابل للاستنساخ بشكل كبير للتعبير عن بروتين مهم (POI) في مكان الميناء الآمن Rosa26 في كل من خطوط الخلايا المناعية البشرية والمرينية. صممنا نظام مراسلة من لونين لإثراء الخلايا المصابة بلازميدات تعبر عن CRISPR/Cas9 (DsRed2) وقالب الحمض النووي المؤتلف (EBFP2) ، والذي يمكن عزله عن طريق فرز الخلايا. بعد هذا البروتوكول، حصلنا على عدة خطوط طرق في خط الخلية التائية البشرية جوركات ومورين macrophage RAW264.7 للتحليلات الوظيفية للبروتينات درس بشكل سيئ.

كمثال على ذلك، نعرض في هذا البروتوكول كيفية الحصول على الضامة RAW264.7 التي تعبر بشكل ثابت عن ACE2 البشري (مستقبلات سارس-كوف-2)22. لأن الخلايا المناعية الفطرية تشارك في الإمراض من Covid-1923،24 ويعتبر ACE2 الإنسان كم مستقبلات رئيسية مطلوبة للدخول الفيروسي إلى الخلايا قبل النسخ المتماثل ، يمكن أن تكون الضامة مع طرق في ACE2 الإنسان بمثابة أداة مفيدة للدراسات الميكانيكية للتكاثر الفيروسي داخل الضامة. بالتوازي، نقدم أيضا مثالا على طرق في جين في مكان ROSA26 الإنسان للتعبير عن البروتين RASGRP1، الذي تم تنصهر في نهاية الأمينية مع تقارب التوأم ستريب العلامة (OST). الخلايا التائية هي الخلايا المستهدفة الرئيسية في العلاجات المناعية، وقد ركز عدد متزايد من الدراسات على التلاعب في استجابتها للسرطان25،26. كما Rasgrp1 ومن المعروف أن جزيء الإشارات الرئيسية المصب لمستقبلات الخلايا التائية والتفاعل لها ليست واضحة جيدا27، وOSST -RASGRP1 ضرب في نموذج يوفر الأساس لتحديد interactors تنظيم استجابة الخلايا التائية للأورام والعدوى. ويمكن استخدام هذه الأدوات معا لدراسات كوفيد-19 واكتشاف جزيئات جديدة تتفاعل مع Rasgrp1.

Protocol

1. تصميم وبناء البلازميد من sgRNAs استهداف روسا26 لوكو دليل التصميم RNAs حول موقع الإدراج المطلوب تأكد من أن موقع الإدراج ل Rosa26 الماوس (فيما يلي يسمى mRosa26) تجارب knock-in يقع في intron الأول من mRosa26; وقد استخدم هذا الموقع في الدراسات السابقة28<su…

Representative Results

بعد البروتوكول المذكور أعلاه لإجراء تجارب طرق في موقع mRosa26 باستخدام الضامة RAW264.7 مورين، صممنا متجه استهداف للتعبير عن ACE2 الإنسان، وهو مستقبل لفيروس سارس-كوف-2(الشكل 2A). باستخدام تصميم مماثل، ونحن ولدت الإنسان الخلايا T Jurkat مع طرق في من البروتين الانصهار RASGRP1 الموسومة OST<s…

Discussion

في تجاربنا، أظهرنا كيفية إجراء التحرير طرق في الخلايا المناعية من تصميم بناء لفحص الخلايا طرق في والتحقق من صحة باستخدام خلايا T جوركات الإنسان وال الضامة RAW264.7 مورين كأمثلة. كل من الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة مقاومة لالعابر36،37؛ ومع ذلك ، يمكن التغلب ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر مرفق التدفق الخلوي الأساسي لجامعة شينشيانغ الطبية. وقد تم دعم تطوير هذه التكنولوجيا من خلال منح NSFC 81601360 إلى LZ 81471595 32070898 إلى YL. ويدعم هذا العمل أيضا مؤسسة هينان لجنة التعليم رقم 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

CRISPR/Cas9Gene Knock-inMacrophageT Cell LinesROSA26 LocusSgRNA DesignHomologous RecombinationTargeting VectorFluorescent ReporterCell Sorting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image