지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비

1. TEM 그리드 사전 지원 전송의 일반 준비 10-15초의 이중 증류수(ddH2O) 또는 초순수수로 TEM 그리드를 순차적으로 들어 올리고 침수하는 한 쌍의 깨끗한 핀셋을 사용한다.참고 : 여기에 부정적인 행동, 경사 팁 핀셋이 사용되었습니다. 그리드가 그립되어 있는 핀셋을 한쪽에 놓고 ~ 5분 동안 공기 건조를 합니다. 플라즈마 청소 그리드는 공기 또는 세척 단계를 통해 발생하는 오염 물질의 표면을 제거합니다.참고 : 여기에, 플라즈마 청소는 25 W의 무선 주파수 전력으로 공기에서 10-15 s에 대해 수행되었다. 2. 시약 솔루션의 일반적인 준비 우라일 아세테이트(UAc) 용액(2% w/v) 50mL 튜브를 호일로 감싸고 50mL의 초순수를 채우고 UAc 파우더 1g을 넣습니다.참고: UAc는 빛에 민감하며 노출시 시간이 지남에 따라 침전됩니다. UAc는 방사성 및 독성이기 때문에 높은 수준의 청결을 유지하십시오. 흡입 이나 섭취에서 발생 하는 가장 심각한 위험으로, 추가 주의 해야 하지 않도록 어떤 미세입자 흡입의 가능성을 방지 하기 위해. 장갑은 우라늄 염을 취급하거나 계량할 때 항상 착용해야 합니다. 마스크와 고글은 적극 추천합니다. 우라늄 염은 국가 내 방사성 위험에 대해 명시된 법적 요구 사항에 따라 폐기되어야 합니다. 모든 UAc가 용해되도록 1h의 용액을 저어 둡니다. 4°C에 보관하십시오. 사용하기 전에 0.22 μm 필터를 사용하여 얼룩 용액의 1mL을 작은 유리병에 필터링하여 나머지 아세테이트 결정을 제거합니다. 그래 핀 옥사이드 (GrOx) 서스펜션 1.5 mL 튜브 (1 % 최종 농도)로 GrOx의 파이펫 2.5 μL. 파이펫 2.5 μL 의 10% (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) 세제에 GrOx에, 부드럽게 혼합 (0.1% (w/v) 최종 농도). GrOx-DDM 믹스에 245 μL의 초순수물을 넣고 즉시 5분 동안 격렬하게 소용돌이를 가합니다. 철(III) 염화물(FeCl3) 용액(10% w/v) 계량 보트에서 FeCl3 5 g의 무게를 신중하게 측정합니다. ddH2O 35mL 및 마그네틱 스터디 바를 포함하는 100mL 측정 실린더로 이송합니다. 자기 교반 플레이트에 놓고 FeCl3을 용해하여 최종 부피 50mL에 ddH2O를 추가합니다. 0.8 μm 주사기 필터를 통해 FeCl3 용액을 깨끗한 병에 넣고 보관합니다.참고: FeCl3 은 부식성 및 자극제입니다. 손과 가벼운 비누와 물로 씻는 후, 술을 마시거나 담배를 피우거나 직장을 그만둔다. 증기의 형성을 방지하기 위해 공정 영역에서 좋은 환기를 제공합니다. 안개, 증기, 스프레이를 마시지 마십시오. 장갑은 소금을 취급하거나 계량할 때 항상 착용해야 합니다. 사용 시 마스크와 고글도 추천합니다. 3. 지지 부동 블록을 사용하여 음수 염색 된 샘플을 준비하기 위해 운하에 탄소 지원 필름에 대한 버퍼 교환 세척 및 플라즈마 깨끗한 TEM 그리드.참고: 여기서 300개의 메쉬 홀리 카본 구리 그리드가 섹션 1에 설명된 대로 사용되었습니다. 피펫 10-12 μL 의 부동 블록의 완충 교환(작은 채널 포함)과 인접한 비버퍼 교환으로 의음 염색을 위해 2% UAc 용액의 10-12 μL(섹션 2.1 참조).참고: 우물의 부피는 10 μL; 그러나, 적절한 필름 부유를 허용하기 위해 상류반연증이 액체의 표면에 형성되도록 샘플 볼륨을 조정한다. 샘플의 양이 적으면 필름 파손이 발생할 수 있습니다. 엄선하여 전유식 카본 필름을 얹은 두 개의 작은 운하 를 잘라냅니다. 운모 파편이 우물(3.4mm 폭)에 들어갈 만큼 충분히 넓고 우물 길이(3.45mm)보다 길어지면 탄소가 떠있는 동안 조각이 잘 앉을 수 있고 핀셋으로 조각을 처리할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.참고: 탄소를 처리하려면 평평한 음수 동작 의 긴 팁 핀셋을 사용하십시오. 항유 조각을 절단 할 때, 탄소 필름의 무결성을 유지하기 위해 단일 움직임을 사용하여 잘라. 운하는 우물의 경사로에 앉아 액체 샘플의 표면에서 탄소층이 관찰 될 때까지 45 °의 대략적인 각도로 우물에 마이크를 담들입니다. 시료에 대한 초기 인큐베이션(일반적으로 샘플 준수에 따라 20내지 20분, 실험적 필요에 따라 이 기간을 최적화) 후, 카본 필름을 복구하고 잔류 점성 시료 보존을 최소화하기 위해 매우 천천히 미카 시트를 철회한다. 필터 용지로 하부 표면(non-carbon side)을 탭하여 항유를 조심스럽게 얼룩지게 하고, 이어서 2% UAc 용액을 포함하는 상대우물(즉, 3.4단계에서와 같이 약체를 침전)에 적용하여 이산화탄소 베어링을 음의 얼룩으로 교환한다.참고: 이 시점에서 탄소 층이 얼룩 용액 위에 떠 있는 것을 관찰해야 합니다. 세척 및 플라즈마 세척 EM 그리드의 구멍이 있는 카본으로 덮인 측면으로 부동 탄소 층을 복구합니다. TEM에서 이미징할 때까지 그리드를 공기 건조상태로 둡니다. 이상적으로는 건조 공정 중에 그리드를 덮어 공기 오염을 방지합니다. 4. 그래핀 산화물 코팅 TEM 그리드를 준비하기 위한 지원 부동 블록의 적용 위에서 설명한 대로 300메쉬 홀리 카본 구리 그리드를 사용하여 세척 및 플라즈마 청정 TEM 그리드(섹션 1). 파이펫 10-12 μL GrOx 서스펜션(섹션 2.2 참조)을 플로트 블록을 따라 4개의 비버퍼 교환 우물에 넣습니다. 파이펫 10-12 μL ddH2O 또는 블록의 나머지 4 개의 완충 교환 우물에 초순수.참고: 이 물 량은 블록의 높이 위로 솟아오르는 약간의 볼록 한 반월 상 연골을 형성하기에 충분합니다. 4개의 그리드를 각 웰의 GrOx 서스펜션에 1분 동안 부드럽게 떨어뜨려 구멍이 뚫은 카본으로 덮인 면이 용액과 접촉할 수 있도록 합니다. 1분 후, 핀셋을 각 비버퍼 교환의 트위저 홈으로 슬라이딩하여 각 그리드를 조심스럽게 복구합니다. 매우 부드럽게 짧게 구리를 터치, 비 탄소 덮인 측면 각 그리드의 ddH2O 인접 우물에서. 그런 다음, 조심스럽게 부드럽게 필터 종이 의 조각에 대한, 아래로 물방울 측, 그리드, 물방울 측을 잡아.참고: 물을 블로팅하면 모세관 작용으로 GrOx 서스펜션이 그리드를 통과하게 됩니다. ddH2O에서 그리드를 잠그지 않도록 하는 것이 중요하므로 접촉은 매우 간단해야 합니다. 그리드를 들어 올릴 때, 물 방울은 그리드의 밑면에 고정되어야 합니다. 이 GrOx 플레이크의 정착을 화나게 할 수 로 필터 용지에 그리드를 이동하지 않도록주의하십시오. 핀셋에 그리드를 두어 시료를 준비할 때까지 공기 건조를 합니다. 이상적으로는 건조 공정 중에 그리드를 덮어 공기 오염을 방지합니다. 5. 단층 그래핀 필름에 샘플의 준비를위한 지원 부동 블록의 응용 프로그램 위에서 설명한 대로 TEM 그리드를 세척(섹션 1)하지만 플라즈마 세척을 생략합니다.참고: 여기서는 300개의 메쉬 홀리 카본 금 그리드가 사용되었지만 다른 비구리 그리드 또는 구리 합금 그리드도 실행 가능합니다. 그래핀으로 그리드를 예치하려면 구리(Cu-graphene) 기판에서 저온-EM 그리드로 직접 전송하여 이전에 설명한 바와 같이 25. 유리 슬라이드에 증착된 Cu-graphene 시트(10mm × 10mm) 위에 4개의 세척 그리드를 놓고, 각 그리드를 이소프로파놀(5-10 μL)으로 덮어 모노레이어 그래핀과 그리드 사이의 친밀한 접촉을 허용합니다.참고: 그래핀 시트와 접촉하여 그리드의 구멍이 뚫린 카본 으로 덮인 면을 배치해야 합니다. 이소프로판올이 완전히 증발되면(일반적으로 2h), 그리드가 있는 Cu-graphene 시트를 유리 페트리 접시에 10% (w/v) FeCl3 용액(섹션 2.3 참조)에 띄우고 밤새 실온에서 에칭상태로 둡니다. 공기 오염을 방지하기 위해 접시를 덮습니다.참고: 에칭이 완료되면 그래핀 단층만 FeCl3 솔루션에 떠 있는 상태로 유지되며, 적절한 조명을 통해 눈으로 볼 수 있습니다. TEM 그리드 크기보다 직경이 큰 루프를 사용하여 그래핀 모노레이어에 떠있는 그리드를 어획하고 ddH2O가 함유된 유리 페트리 접시로 조심스럽게 이송하여 세척합니다.참고: 페트리 접시의 벽에 부딪히지 않도록 그리드를 낚시할 때 매우 주의해야 하며, 이로 인해 그래핀 필름이 파손되거나 구부러질 수 있습니다. 낚시 그리드에 의해 물에 두 번 더 씻고 모든 잔류 FeCl3을 제거하기 위해 ddH2O가 들어있는 깨끗한 페트리 접시로 옮겨 넣습니다. 마지막으로, 샘플 준비 및 플런지 동결때까지 샘플 버퍼를 포함하는 페트리 접시로 그리드를 전송합니다.참고: 공기 중 오염 물질에 노출되지 않도록 그리드의 그래핀 으로 덮인 측면은 항상 젖은 상태로 유지되어야 합니다. 피펫 시료(10-12 μL)를 부동 블록의 비버퍼 교환웰에 넣습니다. 샘플이 블록에 준비되면 클린 핀셋 쌍을 사용하여 버퍼 솔루션에서 그래핀 코팅 그리드를 선택하고 샘플을 잘 함유하는 시료의 표면에 배치합니다. 적절한 잠복기(시료에 따라 1-5분, 실험적 필요에 따라 최적화), 깨끗한 동결 핀셋으로 그리드를 선택하고 블로팅 및 진동을 진행합니다.