支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製

1. TEMグリッドの一般的な準備事前サポート転送 清潔で細かいピンセットを使用して、TEMグリッドを2倍蒸留水(ddH2O)または超純水で10〜15sの超純水に順番に持ち上げ、沈下し、続いて酢酸エチルを10〜15 sで使用します。注:ここでは、負の作用、斜め先端ピンセットが使用されました。 グリッドをグリップにしたままピンセットを片側に置き、約5分間空気乾燥します。 プラズマは、空気または洗浄ステップを介して発生した汚染物質の表面を取り除くためにグリッドをきれいにします。注:ここでは、プラズマクリーニングは25 Wの無線周波パワーで空気中の10-15 sのために行われました。 2. 試薬溶液の一般的な調製 ウラニル酢酸(UAc)溶液(2%w/v) 50 mLチューブをホイルで包み、50mLの超純水で満たし、UAcパウダーを1g加えます。注: UAc は光に敏感で、露出すると時間の経過とともに沈殿します。UAcは放射性と毒性であるため、高いレベルの清潔さを維持します。吸入または摂取から生じる最も深刻な危険に、細かい粒子を吸入する可能性を防ぐために余分な注意を払う必要があります。ウラニウム塩を取り扱ったり、重量を量るときは、手袋は常に着用する必要があります。マスクとゴーグルは強くお勧めします。ウラン塩は、州内の放射性危険に対して定められた法的要件に従って処分されなければならない。 溶液を1時間撹拌したままにして、すべてのUAcが溶解できるようにします。4°Cで保管する。 使用前に、0.22 μmフィルターを使用して、染色液の1mLを小さなバイアルにフィルターし、残りのアセテート結晶を除去します。 酸化グラフェン(GrOx)懸濁液 ピペット2.5 μLのGrOxを1.5mLチューブに(1%最終濃度)ピペット2.5 μLの10%(w/v) n-ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)洗剤をGrOxに入れ、穏やかに混合します(0.1%(w/v)最終濃度)。 GrOx-DDMミックスに245μLの超純水を加え、すぐに5分間激しくボルテックスを加え、調製から1時間以内にGrOx懸濁液を使用し、すぐに使用する前に少なくとも1分間激しく渦を流します。 塩化鉄(III)(FeCl3)溶液(10%w/v) 慎重に重量を量るボートのFeCl3 の5gを量る。35 mLのddH2Oと磁気攪拌棒を含む100 mL測定用シリンダーに移します。 磁気撹拌板に置き、FeCl3を溶解し、ddH2Oを最終容積50mLに加える。0.8 μmのシリンジフィルターを通して、保管用のクリーンボトルにFeCl3ソリューションをフィルターします。注: FeCl3 は腐食性と刺激性です。食べたり、飲んだり、喫煙したり、仕事を離れる前に、手や他の露出した部分を軽い石鹸と水で洗ってください。蒸気の形成を防ぐために、プロセス領域で良好な換気を提供します。霧、蒸気、スプレーを吸い込まないでください。手袋は、塩を取り扱ったり、計量したりする際に常に着用する必要があります。マスクとゴーグルは、使用時には必ずお勧めです。 3. サポートフロートブロックを使用して負の染色サンプルを準備するマイカ上のカーボンサポートフィルムのバッファー交換 洗浄およびプラズマクリーンTEMグリッド。注: ここでは、セクション 1 で上記の概略で 300 メッシュの穴あけ -炭素銅グリッドを使用しました。 ピペット10-12 μLのサンプルは、浮遊ブロックの(小さいチャネルを使用して)、2%UAc溶液の10-12 μL(セクション2.1を参照)に、隣接する非バッファ交換井戸への負の染色のために(小さいチャネルを有する)。注:ウェルの体積は10 μLです。ただし、液体の表面に凸半月板が形成され、適切なフィルムの浮き出しができるようにサンプルの体積を調整します。少量のサンプルはフィルム破損の原因となります。 慎重に上に事前堆積カーボンフィルムとマイカの2つの小片をカット。マイカの破片がウェル(3.4 mm幅)に収まるほど広く、ウェル長さ(3.45mm)よりも長く、炭素が浮遊している間に断片が井戸の上に座り、ピンセットで断片を処理するのに十分なスペースがあることを確認してください。注:炭素を処理するには、平らな負の作用の長い先端のピンセットを使用してください。マイカ断片を切断する場合は、炭素膜の完全性を維持するために単一の動きを使用して切断する。 マイカがウェルのランプに座り、液体サンプルの表面に炭素の層が観察されるまで、ほぼ45°の角度で井戸にマイカを浸します。 サンプルの最初のインキュベーション(通常、サンプルの付着に応じて20〜20分)後、この期間を実験ニーズに基づいて最適化し、マイカシートを非常にゆっくりと引き出して炭素膜を回収し、粘性差し込み残存試料の残留を最小限に抑えます。 濾紙で下面(非カーボン側)をタップしてマイカを慎重にブロットし、その後、2%UAc溶液を含む逆ウェルに塗布して試料を負の汚れに交換する(即ち、ステップ3.4のようにマイカを浸す)。注: この時点で、炭素層が染色液の上に浮かんでいるのを観察する必要があります。 洗浄され、プラズマ洗浄EMグリッドの穴のあいたカーボンカバー側で浮遊炭素層を回収します。TEMでイメージングするまで、グリッドをエアドライのままにします。理想的には、空気汚染を避けるために乾燥プロセス中にグリッドをカバーします。 4. 支持浮遊ブロックの適用はグラフェン酸化物コーティングTEMグリッドを準備する 上で概説した300メッシュの穴あき炭素銅格子を使用して、洗浄およびプラズマクリーンTEMグリッド(セクション1)。 フローティングブロックに沿って4つの非バッファ交換ウェルにGrOx懸濁液のピペット10-12 μL(セクション2.2を参照) 。ピペット10-12 μL ddH2Oまたは超純水をブロックの残りの4つのバッファー交換ウェルに入れます。注:水のこの量は、ブロックの高さを超えて上昇するわずかな凸半月板を形成するのに十分でなければなりません。 4グリッドを各ウェルのGrOxサスペンションに1分間そっと落とし、穴のあいたカーボンで覆われた側が溶液に接触することを保証します。1分後、ピンセットを各非バッファ交換のピンセット溝に入れて慎重にグリッドを回収します。 非常に穏やかに、簡単に隣接するウェルのddH2Oに各グリッドの銅、非炭素で覆われた側面に触れる。その後、慎重かつ穏やかにグリッド、水滴側を下に、ろ過用紙の一部に対して保持します。注:水をブロッティングすると、毛細血管のアクションによってグリッドを通してGrOxサスペンションが描画されます。ddH2O でグリッドを沈めないようにすることが重要なので、接触は非常に簡潔にする必要があります。グリッドが持ち上げられると、水滴がグリッドの下側に保持されるはずです。これはGrOxフレークの沈降を乱す可能性がありますので、フィルター紙のグリッドを移動しないように注意してください。 サンプルで調製するまで、ピンセット内のグリッドを空気乾燥にしておきます。理想的には、空気汚染を避けるために乾燥プロセス中にグリッドをカバーします。 5. 単層グラフェンフィルム上のサンプルの調製のための支持浮遊ブロックの適用 上述の図(セクション1)に示すようにTEMグリッドを洗浄しますが、プラズマクリーニングは省略してください。注: ここでは、300 メッシュの穴あきカーボンゴールドグリッドが使用されましたが、他の銅以外のグリッドや銅合金グリッドも実用的です。 グラフェンを用いてグリッドを堆積させるために、銅(Cu-graphene)基質上で成長したグラフェンから、クライオEMグリッドに直接移し、前述の25を挙げた。 ガラススライドに堆積したCu-grapheneシート(10mm×10mm)の上に4つの洗浄グリッドを置き、各グリッドをイソプロパノール(5〜10 μL)の滴で覆い、単層グラフェンとグリッドの間に密接な接触を可能にします。注:グラフェンシートに接触するグリッドの穴のあいたカーボンで覆われた側を配置してください。 イソプロパノールが完全に蒸発したら(通常は2時間)、グリッドを持つCu-grapheneシートを10%(w/v)FeCl3 溶液(セクション2.3を参照)にガラスペトリ皿に浮かべ、室温で一晩エッチングに残します。空気中の汚染を避けるために皿を覆う。注:エッチングが完了した後、グラフェン単層のみがFeCl3 溶液に浮いたままになります。 TEMグリッドサイズよりも大きな直径のループを使用してグラフェン単層に浮かぶグリッドを釣り、ddH2Oを含むガラスペトリ皿に慎重に移して洗浄します。注:グラフェンフィルムの破損や曲がりを引き起こす可能性のあるペトリ皿の壁にぶつかるのを避けるためにグリッドを釣るときには非常に慎重にしてください。 釣りグリッドで水でさらに2回洗浄し、すべての残留FeCl3を除去するためにddH2Oを含むきれいなペトリ皿に転送します。最後に、サンプル調製およびプランジ凍結までサンプルバッファーを含むペトリ皿にグリッドを移します。注:グラフェンで覆われたグリッドの側面は、空気中の汚染物質への暴露を避けるために常に濡れた状態に保つ必要があります。 サンプル(10-12 μL)を浮遊ブロックの非バッファ交換ウェルにピペットします。サンプルがブロック内で準備ができたら、きれいなピンセットのペアを使用して緩衝液からグラフェンコーティングされたグリッドを選び、サンプル含有ウェルの表面に置きます。 適切なインキュベーション期間(サンプルに応じて1〜5分、実験ニーズに応じて最適化)の後、きれいな凍結ピンセットでグリッドを選び、ブロッティングとガラス化を進めます。