إعداد عينات من أفلام الدعم في المجهر الإلكترون الإرسال باستخدام كتلة دعم التعويم
Summary
إعداد عينة للجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) هو عنق الزجاجة كبيرة في سير عمل تحديد هيكل هذه الطريقة. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام سهلة الاستخدام، كتلة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لإعداد أفلام الدعم لتحقيق الاستقرار في عينات لدراسات EM الإرسال.
Abstract
وقد نما بسرعة في العقد الماضي تحديد الهيكل عن طريق المجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) ؛ ومع ذلك، إعداد عينة لا يزال اختناق كبير. يتم تصوير العينات الجزيئية الكلية بشكل مثالي مباشرة من التوجهات العشوائية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي. ومع ذلك ، فإن العديد من العينات هي الانكسار لهذا ، وتشبع البروتين في واجهة الهواء والماء هو مشكلة شائعة. للتغلب على مثل هذه القضايا، يمكن تطبيق أفلام الدعم بما في ذلك الكربون غير المتبلور والجرافين وأكسيد الجرافين على الشبكة لتوفير سطح يمكن للعينات ملؤه، مما يقلل من احتمال تعرض الجسيمات للآثار الضارة لواجهة الهواء والمياه. ومع ذلك، يتطلب تطبيق هذه الدعامات الحساسة على الشبكات معالجة متأنية لمنع الكسر أو التلوث المحمول جوا أو خطوات الغسيل والتنظيف الواسعة النطاق. يصف تقرير حديث تطوير كتلة عائمة سهلة الاستخدام تسهل النقل الرطب لأفلام الدعم مباشرة إلى العينة. استخدام كتلة يقلل من عدد من خطوات المعالجة اليدوية المطلوبة، والحفاظ على السلامة البدنية للفيلم الدعم، والوقت الذي التلوث الكاره للماء يمكن أن تتراكم، وضمان أن فيلم رقيقة من الجليد لا يزال يمكن أن تتولد. توفر هذه الورقة بروتوكولات خطوة بخطوة لإعداد الكربون والجرافين وأكسيد الجرافين لدعم دراسات EM.
Introduction
10- وخلال العقد الماضي، يسرت الإنجازات، ولا سيما في مجال تكنولوجيا الكاشفات، وكذلك في مجالات تقنية أخرى، سلسلة من الزيادات الكبيرة في القرار الذي يمكن عنده تصوير النظم ذات الصلة بيولوجيا بالمنظار المجهري للإلكترون الإرسالي (TEM)1،2. على الرغم من حقيقة أن cryo-EM يسمح بالفعل بدقة الهياكل عالية الدقة من أقل من 50 ميكروغرام من البروتين من خلال تحليل الجسيمات المفردة (SPA) ، فإن عينة cryo-EM وإعداد الشبكة لا تزال اختناقات رئيسية3،4،5. تتكون عينات SPA من الجزيئات الكبيرة الموزعة بشكل عشوائي تقريبا داخل طبقة من الجليد الزجاجي. يجب أن يكون الجليد رقيقة قدر الإمكان لتحقيق أقصى قدر من الفرق التباين بين الجسيمات والمذيبات. الجزيئات البيولوجية هي أكثر استقرارا (أي أقل عرضة لفقدان بنيتها الأصلية) في الجليد سمكا، لأنها لا تزال أفضل حلها. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يتم العثور على جزيئات أن تكون أفضل بكثير موزعة على مجال الرؤية في الجليد سمكا بكثير من حجم الجسيمات6 وكثيرا ما قد لا تكون موجودة داخل ثقوب في أفلام الكربون على الإطلاق.
بالإضافة إلى ذلك، تقلل الطبقات الأكثر سمكا من الجليد من احتمال أن تكون الجزيئات قريبة من واجهة الهواء والماء بسبب ارتفاع نسبة السطح إلى الحجم، وتشير التقديرات إلى أن استخدام طرق التجميد القياسية لدراسات التبريد و EM يؤدي إلى امتصاص ~ 90٪ من الجسيمات إلى واجهة مياه الهواء7. ينتج عن الجليد الأكثر سمكا خلفية عالية بشكل غير مرغوب فيه بسبب زيادة أحداث التشتت داخل المذيبات وما يصاحبها من تخفيف للإشارة6،7. ولذلك فمن الضروري تحقيق طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي قدر الإمكان؛ من الناحية المثالية ، فإن الطبقة تكون أكثر سمكا قليلا من الجسيم. التحدي الذي يواجه الباحث ، والذي يجب التغلب عليه لكل عينة مختلفة تطبق على الشبكة ، هو إعداد عينات رقيقة بما يكفي للتصوير عالي التباين مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للجسيمات داخل العينة. ويرافق الامتزاز البروتين إلى واجهة الهواء والماء من قبل العديد من الآثار الضارة عادة.
أولا، ربط البروتينات بهذه الواجهة الكارهة للماء غالبا ما يحفز على تشبع البروتين، الذي يستمر بسرعة وعادة ما يكون لا رجعة فيه8،9. وأظهرت دراسة أجريت باستخدام synthase الخميرة الأحماض الدهنية أن ما يصل إلى 90٪ من الجسيمات الممتزة هي denatured10. ثانيا، أظهرت الأدلة المستقاة من دراسة تقارن التوزيع التوجيهي لمجموعات بيانات الريبوسوم 80S التي تم جمعها إما على carbon11 غير متبلور أو بدون دعم12 أن واجهة الهواء والمياه يمكن أن تسبب توجها تفضيليا شديدا يعرض إعادة بناء المجلد 3D للخطر13. طرق للحد من تفاعل الجسيمات مع واجهة الهواء والماء وتشمل مكملات العازلة تجميد مع السطحي (مثل المنظفات)، واستخدام أفلام الدعم، وتقارب التقاط أو السقالات من الركائز، وأوقات الهبوط المتسارع. ويرتبط استخدام المواد السطحية بمشاكلها الخاصة، حيث أن بعض عينات البروتين قد تتصرف بشكل غير مثالي في وجودها، في حين أن ركائز التقاط التقارب والسقالات تتطلب بشكل عام أسطح الشبكة الهندسية المخصصة واستراتيجيات التقاطها. وأخيرا، على الرغم من أن هناك الكثير من البحوث على تطوير الأجهزة السريعة الهبوط14،15،16، وهذه تتطلب الجهاز الذي هو عموما غير متوفر على نطاق واسع.
على الرغم من أن شبكة TEM القياسية ل cryo-EM البيولوجية تتميز بالفعل بورق كربون مثقب غير متبلور17 ، إلا أن هناك عددا من البروتوكولات المتاحة لتوليد أفلام دعم إضافية ونقلها إلى شبكات TEM. استخدام هذه الأفلام هو وسيلة راسخة منذ فترة طويلة لتحقيق الاستقرار عينة18. يتم إنشاء دعامات الكربون غير المتبلور عن طريق التبخر والترسب على أوراق الميكا البلورية19 ، والتي يمكن من خلالها تعويم الطبقات على الشبكات ، مع دعم فائدة التعويم كأدوات مفيدة تم إنشاؤها في التقارير السابقة20. وقد استخدمت رقائق أكسيد الجرافين، التي يتم إعدادها عادة باستخدام نسخة معدلة من طريقة هامر21، كهيكل دعم مفضل على الكربون غير المتبلور لإشارة الخلفية المنخفضة الخاصة بها وكذلك القدرة على شل استقرار الجزيئات الكبيرة22. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام resurging في استخدام الجرافين كفيلم دعم TEM بسبب استقراره الميكانيكي ، والتوصيلية العالية ، والمساهمة المنخفضة للغاية في الضوضاء الخلفية23 ، فضلا عن ظهور طرق قابلة للاستنساخ لتوليد مساحات كبيرة بشكل كبير من الجرافين أحادي الطبقة24 ونقله إلى شبكات TEM25 . بالمقارنة مع الكربون غير المتبلور ، الذي يخضع لحركات ناجمة عن الحزمة على نحو مماثل ، أو أسوأ ، من الجليد الذي يفتقر إلى فيلم دعم11،12،17 ، أظهر الجرافين انخفاضا كبيرا في الحركة الناجمة عن الحزمة من صور cryo-EM12.
ومع ذلك ، في حين أن الجرافين المائي يحمي سينثاز الأحماض الدهنية من التشبع بين العوامل في المياه الهوائية ، لاحظ مؤلفو هذه الدراسة أن الجرافين أصبح ملوثا أثناء إعداد العينة ، على الأرجح بسبب مزيج من تلوث الهيدروكربون في الغلاف الجوي ومن الكاشف المستخدم في هيدروفيليا الشبكات10. في الواقع ، على الرغم من العديد من الصفات المتفوقة من الجرافين ، لا يزال استخدامه على نطاق واسع يعوقه الاشتقاق المطلوب لتقليل رهاب الماء12 ، والذي هو في نهاية المطاف صعب كيميائيا ويتطلب معدات متخصصة. تقدم هذه الورقة تقارير عن بروتوكولات لإعداد الكربون غير المتبلور وأكسيد الجرافين وعينة الجرافين باستخدام كتلة عائمة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)27 لنقل أفلام الدعم مباشرة من الركائز التي تم إنشاؤها على شبكات TEM (الشكل 1). ومن المزايا الرئيسية لاستخدام مثل هذا الجهاز هو النقل الرطب للأفلام، وتقليل التلوث المائي للدعم وبالتالي الحاجة إلى مزيد من العلاج، والحد من عدد خطوات المناولة اليدوية التي يحتمل أن تكون ضارة. وهذه النهج غير مكلفة التنفيذ، وبالتالي فهي متاحة على نطاق واسع وقابلة للتطبيق في دراسات التبريد والتبريد حيثما تكون دعامات العينة ضرورية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولات للتعامل مع كل من أفلام الكربون غير المتبلور والجرافين لإعداد عينة cryo-EM باستخدام كتلة عائمة عينة27. يتوفر ملف STL لكتلة الدعم مجانا من مستودع Thingiverse العام [www.thingiverse.com/thing:3440684]، ويمكن طباعته ثلاثي الأبعاد مع أي طابعة تصوير مجسم مناسبة من راتنج مناسب. استخدام أفلام الكربون التي تغطي شبكة TEM عادة ما ينطوي على تعويم الكربون على sample28. هذا النهج لإعداد شبكات البقع السلبية يقلل من التعرض للهواء أثناء التعامل مع الدعم ، وبالتالي تقليل التلوث وتشبع البروتين. إعداد الشبكات باستخدام الكربون العائم في الآبار الصغيرة مفيد لتعويم مساحة أكبر من السطح، أي في حمام مائي أو طبق بيتري، وفي هذه الحالة القص الميكانيكي للكربون يحدث بسهولة أكبر بكثير.
قد يكون من الصعب شراء UAc بسبب اللوائح الحالية للصحة والسلامة في وقت النشر. وتتوفر العديد من الكواشف الأخرى الشائعة الاستخدام وغير المشعة والسلبية، وقد وصفت بروتوكولات إعدادها سابقا29. على الرغم من أن البقع البديلة لم تستخدم مع كتلة التعويم هذا الدعم، فإنه ليس من المرجح أن يكون هناك أي اختلافات في هذه البروتوكولات إلى جانب الاستفادة المثلى من وقت الحضانة مع عينة (الخطوة 3.5)، والتي هي بالفعل بطبيعتها تعتمد على العينة. الخطوة الرئيسية في هذا البروتوكول إعداد دعم GrOx هي الخطوة 4.4، أبرزها مذكرة لمنع المياه و GrOx الحل من إجراء اتصال حول حافة الشبكة. خلط غير مناسب للماء وحلول GrOx يمنع الاستقرار أحادي الاتجاه من رقائق GrOx عن طريق العمل الشعرية. وجود رقائق GrOx على جانبي رقائق الكربون يؤدي إلى طبقات سميكة ، وبالتالي نفي مزايا استخدام GrOx كدعم طبقة واحدة تقريبا ، وكذلك محاصرة المياه بين الرقائق ، مما يسبب تلوث المناطق الصالحة للاستخدام مع طبقات إضافية من الجليد. إعداد دعم أكسيد الجرافين من السهل نسبيا لتحقيق باستخدام قطرات من الحل على فيلم البولي أوليفين مرنة. ومع ذلك، عندما يتم تنفيذها بهذه الطريقة، فمن الأسهل تلويث الجانب النحاسي من الشبكة عن طريق سوء التعامل مع الأخطاء؛ استخدام كتلة التعويم يقلل من احتمال حدوث هذا الاحتمال.
وأخيرا، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإعداد شبكات مغطاة بالجرافين تتجنب أي نوع من المعالجة المسبقة للجرافين لجعله هيدروفيليا، مما يقلل من تكلفته ويزيد من إمكانية الوصول إليه. الحفاظ على فيلم مبلل في جميع أنحاء إعداد العينة وتطبيق العينة في الموقع في الكتلة قبل التجميد يكفي للسماح لتوليد طبقات الجليد المناسبة لالتبريد م مع توزيع عينة متجانسة. وعموما، فإن البروتوكولات المعروضة هنا تقلل من اتصال العينة بالواجهة بين الهواء والمياه، مما يقلل من التشبع بالعينة ودعم التلوث. وبالنسبة لأفلام الدعم الثلاثة المستخدمة في هذه النهج، يمكن تحقيق توزيعات متجانسة للعينات عبر الشبكات إلى جانب تصوير جزيئات مفردة سليمة ومصانة جيدا.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء قسم البيولوجيا الهيكلية والاصطناعية في إمبريال كوليدج لندن الذين ساعدوا في اختبار هذه التقنيات، وكذلك هاري بارنيت في الكلية الإمبراطورية المتقدمة هاكسبيس، وبول سيمبسون في مركز البيولوجيا الهيكلية. يتم دعم CHSA من قبل زمالة السير هنري ديل بتمويل مشترك من صندوق ويلكوم والجمعية الملكية (206212/Z/17/Z).
Materials
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
Riferimenti
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and “Visual Proteomics”. Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E. Preparation of Graphitic Oxide. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339 (1958).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochimica. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
