نهج الموائع الدقيقة للتحقيق الوظيفي لتذبذبات الإشارات التي تحكم تكوين السوميتوجينيسيس
Summary
يتم توفير بروتوكول لزراعة ومعالجة الأنسجة الجنينية للفأر على رقاقة الموائع الدقيقة. من خلال تطبيق نبضات من معدلات المسار ، يمكن استخدام هذا النظام للتحكم خارجيا في تذبذبات الإشارات للتحقيق الوظيفي في تكوين الماوس somitogenesis.
Abstract
يتم التحكم في التقسيم الدوري للأديم المتوسط البريسوميتي لجنين الفأر النامي بواسطة شبكة من مسارات الإشارات. ويعتقد أن تذبذبات الإشارات والتدرجات تتحكم في توقيت وتباعد تكوين المقطع على التوالي. في حين تمت دراسة مسارات الإشارات المعنية على نطاق واسع على مدى العقود الماضية ، إلا أن الأدلة المباشرة على وظيفة تذبذبات الإشارات في التحكم في تكوين المحاكاة كانت غير موجودة. لتمكين التحقيق الوظيفي في ديناميكيات الإشارات ، تعد الموائع الدقيقة أداة تم إنشاؤها مسبقا للتعديل الدقيق لهذه الديناميكيات. مع هذا النهج القائم على الموائع الدقيقة ، تتم مزامنة تذبذبات الإشارات الداخلية بواسطة نبضات من معدلات المسار. وهذا يتيح تعديل فترة التذبذب أو علاقة الطور بين مسارين متذبذبين، على سبيل المثال. علاوة على ذلك ، يمكن إنشاء تدرجات مكانية لمعدلات المسار على طول الأنسجة لدراسة كيفية تأثير التغيرات المحددة في تدرجات الإشارات على تكوين الميزات.
ويهدف هذا البروتوكول إلى المساعدة في وضع نهج للموائع الدقيقة لمستخدمي الموائع الدقيقة لأول مرة. يتم وصف المبادئ والمعدات الأساسية اللازمة لإعداد نظام الموائع الدقيقة ، ويتم توفير تصميم رقاقة ، والتي يمكن من خلالها إعداد قالب لتوليد الرقائق بسهولة باستخدام طابعة 3D. وأخيرا ، تتم مناقشة كيفية زراعة أنسجة الفئران الأولية على رقاقة ميكروفلويديك وكيفية تدريب تذبذبات الإشارات على النبضات الخارجية لمعدلات المسار.
يمكن أيضا تكييف نظام الموائع الدقيقة هذا لإيواء أنظمة نموذجية أخرى في الجسم الحي وفي المختبر مثل gastruloids و organoids للتحقيق الوظيفي في ديناميكيات الإشارات والتدرجات المورفوجينية في سياقات أخرى.
Introduction
يتم التحكم في التنمية عن طريق الاتصال بين الخلايا عبر مسارات الإشارة. لا يوجد سوى عدد محدود من مسارات الإشارات التي تنظم التكوين المعقد للأنسجة والتمايز السليم للخلايا في المكان والزمان. لتنظيم هذا العدد الكبير من العمليات، يمكن ترميز المعلومات في ديناميكيات مسار الإشارة، وتغيير المسار بمرور الوقت، مثل تردد أو مدة الإشارة1,2.
أثناء تكوين السوميتوجيني، يتم تقسيم الأنسجة السوميتيكية بشكل دوري من الأديم المتوسط قبل السوميتيك (PSM)3. يتم تنظيم PSM مكانيا بواسطة تدرجات Wnt وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) وإشارات حمض الريتينويك. في PSM الأمامي في جبهة التحديد ، حيث تكون إشارات Wnt و FGF منخفضة ، يتم إعداد الخلايا للتمايز إلى somites. يحدث التمايز عندما تصل موجة من التنشيط النسخي إلى جبهة التحديد هذه. داخل PSM ، تذبذب إشارات Wnt و FGF و Notch. تتأرجح الخلايا المجاورة قليلا خارج الطور ، مما يؤدي إلى موجات من التنشيط النسخي المتذبذب في اتجاه مجرى مسارات Wnt و FGF و Notch التي تنتقل من PSM الخلفي إلى الأمامي. في أجنة الفئران ، تصل موجة النسخ إلى جبهة التحديد كل 2 ساعة تقريبا وتبدأ تكوين السوميت. يمكن أن توضح دراسة تكوين السوميتوجينيسيس عن طريق إزعاج أو تنشيط مسارات الإشارات أهمية هذه المسارات4،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، لتكون قادرا على التحقيق في وظيفة ديناميكيات الإشارات في التحكم في السلوك الخلوي ، من الضروري تعديل مسارات الإشارات بمهارة بدلا من تنشيطها أو تثبيطها بشكل دائم.
لتعديل نشاط مسار الإشارات مؤقتا داخل جنين الفأر المجزأ، طور سونين وآخرون نظاما ميكروفلوديا10. يسمح هذا النظام بالتحكم المحكم في تدفقات السوائل داخل القنوات الدقيقة للرقاقة التي تحتوي على العينة البيولوجية11. لدراسة أهمية ديناميكيات الإشارات للتجزئة الصحيحة ل PSM ، يتم استخدام إعداد الموائع الدقيقة هذا لتعديل ديناميكيات الإشارات لساعة تجزئة الماوس خارج الجسم الحي. من خلال النبض المتسلسل لمنشطات المسار أو المثبطات في غرفة الثقافة، يتم تحقيق التحكم الخارجي في ديناميكيات إشارات Wnt وFGF و Notch10. على سبيل المثال ، من الممكن تعديل فترة المسارات الفردية وعلاقة الطور بين مسارات الإشارات المتذبذبة المتعددة. باستخدام التصوير المتزامن في الوقت الفعلي لمراسلي الإشارات الديناميكية ، يمكن تحليل تأثير التقييد على المسارات نفسها ، على التمايز وتكوين السوميت. وباستخدام هذا المستوى من التحكم في ديناميكيات الإشارات، تم تسليط الضوء على أهمية علاقة الطور بين مسارات إشارات Wnt و Notch أثناء تكوين السوميتون10.
تسمح تصميمات الرقائق المخصصة بمجموعة كبيرة من الخيارات للاضطرابات الزمانية المكانية داخل البيئة المحلية ، على سبيل المثال ، تكوين التدرج المستقر12،13،14،15 ، التنشيط / التثبيط النابض 10،16،17،18 أو الاضطرابات الموضعية19،20 . يمكن للموائع الدقيقة أيضا تمكين قراءة أكثر قابلية للتكرار وإنتاجية أعلى بسبب أتمتة المناولة التجريبية21،22،23. يهدف هذا البروتوكول إلى جلب الموائع الدقيقة وتقييد تذبذبات الإشارات الداخلية داخل الأنسجة إلى كل مختبر قياسي لعلوم الحياة. حتى في غياب المعدات المتطورة لتوليد الرقائق، مثل الغرفة النظيفة ومعدات الطباعة الحجرية الناعمة، يمكن تصنيع رقائق الموائع الدقيقة واستخدامها لمعالجة المسائل البيولوجية. يمكن تصميم القوالب باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) المتاح مجانا. يمكن طباعة قالب لتوليد رقائق الموائع الدقيقة ، التي تتكون عادة من polydimethylsiloxane (PDMS) ، باستخدام طابعة 3D ، أو طلبها من شركات الطباعة. وبهذه الطريقة، يمكن إنتاج رقائق الموائع الدقيقة في غضون يوم واحد دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن24. هنا ، يتم توفير تصميم رقاقة ، والتي يمكن من خلالها طباعة قالب لتقييد ساعة تجزئة الماوس في ثقافات خارج الجسم الحي ثنائية الأبعاد (2D) 25 باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد.
تمتلك الثقافات الموجودة على الرقاقة والاضطرابات الدقيقة ، التي يتم تمكينها بواسطة الموائع الدقيقة ، إمكانات بارزة في كشف الآليات الجزيئية لكيفية تحكم مسارات الإشارات في السلوك متعدد الخلايا. هناك حاجة إلى ديناميكيات الإشارات والتدرجات المورفوجينية للعديد من العمليات قيد التطوير. في السابق ، كانت المختبرات قد زرعت الخلايا والأنسجة والكائنات الحية بأكملها في رقائق الموائع الدقيقة ويتم توفير بروتوكولات للاضطراب المكاني الزماني لزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد في المقام الأول في أماكن أخرى12،26،27،28،29. إن تطبيق الموائع الدقيقة لتعديل البيئات المحلية في الأنظمة متعددة الخلايا يفتح آفاقا جديدة للاضطرابات الزمانية المكانية عالية الإنتاجية والدقيقة. لقد وصل مجال الموائع الدقيقة الآن إلى نقطة أنه أصبح أداة غير متخصصة وغير مكلفة وقابلة للتطبيق بسهولة لعلماء الأحياء التنموية.
هنا ، يتم توفير بروتوكول لتقييد ساعة تجزئة الماوس إلى نبضات مثبط إشارات Notch. تتكون هذه التجربة من الخطوات التالية: (1) توليد رقاقة الموائع الدقيقة ، (2) إعداد الأنابيب وطلاء الشريحة ، و (3) تجربة الموائع الدقيقة نفسها (الشكل 1 أ). تتطلب الأبحاث التي تنطوي على أنظمة نماذج الفقاريات موافقة أخلاقية مسبقة من اللجنة المسؤولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كيف تتحكم ديناميكيات الإشارات في الأنظمة متعددة الخلايا كان سؤالا قديما في هذا المجال. ويشكل التحقيق الوظيفي تحديا رئيسيا، لأن هذه الديناميكيات يجب أن تعدل بمهارة للسماح بذلك11. ويمكن تحقيق مثل هذه السيطرة الزمنية على اضطرابات المسار من حيث المبدأ باستخدام علم البصريات الوراثي، الذي يتيح أيضا تحكما مكانيا عاليا34. ومع ذلك ، يتطلب علم البصريات الوراثي إنشاء أدوات وراثية متطورة لتحليل كل مسار إشارة معني. يوفر البروتوكول الحالي الموصوف هنا أداة متعددة الاستخدامات للغاية لاضطراب أي مسار إشارة. تسمح تجربة الموائع الدقيقة بتطبيق نبضات الدواء التي يتم التحكم فيها مؤقتا للتحقيق وظيفيا في ديناميكيات مسارات الإشارات في مزارع الأنسجة. هنا ، ينصب التركيز على دراسة تكوين السوميتوجينيسيس في الثقافات خارج الجسم الحي ، ولكن يمكن تكييف البروتوكول ليناسب أي أنظمة نموذجية أخرى.
بعض الخطوات في البروتوكول حاسمة لإجراء تجربة الموائع الدقيقة الناجحة (ملخصة في الجدول 1). وتناقش النقاط الرئيسية على النحو التالي. بسبب التدفق المتوسط أثناء التجربة ، تعاني زراعة الأنسجة من إجهاد القص. يمكن أن يؤدي تعرض النظام النموذجي للتدفق المستمر إلى إجهاد الخلايا وفي الحالات القصوى موت الخلايا بسبب تأثير القص. بالنسبة لمزارع الأنسجة خارج الجسم الحي لبراعم ذيل الفأر وتصميم الرقاقة الحالي ، وجد أن معدل التدفق البالغ 60 ميكرولتر / ساعة (بحد أقصى 100 ميكرولتر / ساعة) يعمل بشكل جيد مع الحد الأدنى من تأثير القص. عند تشغيل مضخات متعددة في وقت واحد لنفس الشريحة، يجب تعديل معدل تدفق المضخات الفردية وفقا لذلك حتى لا يتسبب في زيادة في معدل التدفق الكلي. عندما يتم تكييف البروتوكول الحالي مع أنظمة النماذج الأخرى وتصميمات الرقائق ، يجب تحسين معدل التدفق. بدلا من ذلك ، من الممكن عدم تدفق الوسط بشكل مستمر ، ولكن تغيير الوسط بشكل دوري على الشريحة35. يمكن أيضا تطبيق مثل هذا الإعداد للتحكم في تذبذبات الإشارات في تكوين الماوس (غير منشور ، البيانات غير معروضة). علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تصور إعداد ، حيث لا تتعرض مزارع الأنسجة لتدفق السوائل المباشر ، ولكن الأدوية تصل إلى الأنسجة عن طريق الانتشار من قناة مجاورة. وقد استخدمت هذه الأنظمة بنجاح لتطبيق تدرجات عوامل النمو على النماذج المختبرية لتمايز ESC14,36.
إحدى القضايا الرئيسية لتجارب الموائع الدقيقة هي حدوث فقاعات الهواء على الرقاقة أثناء التجربة. يمكن أن تتداخل فقاعات الهواء داخل الشريحة أو الأنابيب مع تدفق سائل موحد على الشريحة ويمكن أن تؤدي إلى إزالة مزرعة الجنين من موقعها. لمنع وجود فقاعات الهواء ، لا غنى عن خطوات مختلفة من البروتوكول. أولا، يجب تفريغ وسط الاستزراع داخل المحاقن ورقاقة الموائع الدقيقة نفسها باستخدام مجفف (الخطوة 3-1-3). ثانيا ، عند تحميل العينات في مداخل التحميل ، يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم سحب الهواء إلى الشريحة مع العينة (الخطوة 3.2.3). ثالثا ، عند ملء الأنبوب بالوسط ، يجب ضخ جميع فقاعات الهواء قبل توصيل الشريحة (الخطوة 3.3.2). خلاف ذلك ، سيتم دفع هذه الفقاعات إلى الشريحة الرئيسية أثناء التجربة. أخيرا ، أثناء التجربة ، يتم توازن الوسط داخل غرفة التصوير أو الحاضنة بسبب الأنابيب شبه القابلة للنفاذ. تسمح نفاذية الأنابيب أيضا بتبخر الوسط ، لذا تأكد من تنظيم الرطوبة أثناء التجربة لمنع تكوين فقاعات جديدة في الأنابيب.
بشكل عام ، تعد الموائع الدقيقة أداة متعددة الاستخدامات للغاية يمكن تكييفها مع سؤال الباحث المحدد. يسمح نهج التصميم الحالي بتصوير ما يصل إلى 12 مزرعة خارج الجسم الحي بالتوازي مع كل رقاقة. هذا العدد محدود بشكل أساسي بعدد الأجنة لكل تجربة والوقت الذي يستغرقه تصوير كل مزرعة أجنة بدقة كافية. إذا كانت هناك حاجة إلى مقارنة ظروف متعددة في تجربة واحدة ، فيمكن تركيب شرائح متعددة على شريحة زجاجية واحدة. يتم توفير تصميم رقاقة، وهو مثالي لتصوير العديد من الأنسجة الخارجية بالتوازي، ولكن التصاميم الشخصية يمكن أن تتغلب على القيود المفروضة على عدد العينات للسماح بتحليل الإنتاجية العالية وزيادة مزيج من المزيد من الظروف داخل تجربة واحدة16,17. تقتصر الموائع الدقيقة على النماذج التي يمكن زراعتها على رقاقة ويجب تحسين الثقافة على الرقاقة لكل نظام طراز على حدة27،37،38.
على مدى السنوات 5-10 الماضية ، تم تطبيق الموائع الدقيقة لمعالجة مختلف المسائل البيولوجية بسبب إمكاناتها لنهج الإنتاجية العالية والتعديلات الدقيقة لديناميات الإشارات والتدرجات. في الوقت الحاضر ، أصبحت الموائع الدقيقة أداة سهلة التطبيق ورخيصة ومتعددة الاستخدامات يمكن للمختبرات تأسيسها بسهولة. هنا ، يتم تحسين البروتوكول الحالي لتطبيق معين ، وهو دراسة ديناميكيات الإشارات التي تحكم تكوين السوميتوجينيك. من السهل تكييف هذا البروتوكول والتصميم ليناسب أسئلة البحث الفردية في بيولوجيا الأنسجة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون ليانغ لي وجوس مالدا من UMC Utrecht للمساعدة في الطباعة ثلاثية الأبعاد للقوالب ، وكارين فان دن أنكر من مجموعة Sonnen للحصول على تعليقات مفيدة للغاية حول البروتوكول ، و Tjeerd Faase من ورشة العمل الميكانيكية في معهد Hubrecht لحامل رقائق الموائع الدقيقة داخل المجهر. نود أن نشكر مجموعة Sonnen بأكملها على القراءة النقدية للمخطوطة والمراجعين على ملاحظاتهم البناءة. تلقى هذا العمل تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي بموجب اتفاقية منحة بدء ERC رقم 850554 إلى K.F.S.
Materials
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
Riferimenti
- Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
- Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
- Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
- Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding – From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
- Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
- Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
- Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
- Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
- Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
- Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
- Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
- Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
- Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
- Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF – Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
- Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data – pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
- Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
- Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).
