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Biologia dello sviluppo

Ein mikrofluidischer Ansatz zur funktionellen Untersuchung von Signalschwingungen, die die Somitogenese steuern

Published: March 19, 2021
doi:
10.3791/62318
, ,
1Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center Utrecht

Summary

Ein Protokoll für die Kultur und Manipulation von embryonalem Gewebe der Maus auf einem mikrofluidischen Chip wird bereitgestellt. Durch die Anwendung von Impulsen von Signalwegmodulatoren kann dieses System verwendet werden, um Signalschwingungen für die funktionelle Untersuchung der Maussomitogenese extern zu steuern.

Abstract

Die periodische Segmentierung des präsomitischen Mesoderms eines sich entwickelnden Mausembryos wird durch ein Netzwerk von Signalwegen gesteuert. Es wird angenommen, dass Signalschwingungen und -gradienten das Timing bzw. den Abstand der Segmentbildung steuern. Während die beteiligten Signalwege in den letzten Jahrzehnten umfassend untersucht wurden, fehlten direkte Beweise für die Funktion von Signalschwingungen bei der Kontrolle der Somitogenese. Um die funktionelle Untersuchung der Signaldynamik zu ermöglichen, ist die Mikrofluidik ein bisher etabliertes Werkzeug zur subtilen Modulation dieser Dynamik. Bei diesem mikrofluidikbasierten Entrainment-Ansatz werden endogene Signalschwingungen durch Impulse von Signalwegmodulatoren synchronisiert. Dies ermöglicht die Modulation beispielsweise der Schwingungsperiode oder der Phasenbeziehung zwischen zwei oszillierenden Bahnen. Darüber hinaus können räumliche Gradienten von Signalwegmodulatoren entlang des Gewebes etabliert werden, um zu untersuchen, wie sich spezifische Veränderungen in den Signalgradienten auf die Somitogenese auswirken.

Das vorliegende Protokoll soll dazu beitragen, mikrofluidische Ansätze für Erstanwender der Mikrofluidik zu etablieren. Die Grundprinzipien und die Ausrüstung, die für den Aufbau eines mikrofluidischen Systems erforderlich sind, werden beschrieben und ein Chip-Design bereitgestellt, mit dem eine Form für die Chip-Generierung bequem mit einem 3D-Drucker vorbereitet werden kann. Schließlich wird diskutiert, wie primäres Mausgewebe auf einem mikrofluidischen Chip kultiviert wird und wie Signalschwingungen zu externen Impulsen von Signalwegmodulatoren mitgerissen werden.

Dieses mikrofluidische System kann auch angepasst werden, um andere In-vivo- und In-vitro-Modellsysteme wie Gastruloide und Organoide für die funktionelle Untersuchung von Signaldynamiken und Morphogengradienten in anderen Kontexten zu beherbergen.

Introduction

Die Entwicklung wird durch interzelluläre Kommunikation über Signalwege gesteuert. Es gibt nur eine begrenzte Anzahl von Signalwegen, die die komplexe Bildung von Geweben und die richtige Zelldifferenzierung in Raum und Zeit orchestrieren. Um diese Vielzahl von Prozessen zu regulieren, können Informationen in der Dynamik eines Signalweges kodiert werden, die Änderung eines Weges im Laufe der Zeit, wie die Frequenz oder Dauer eines Signals1,2.

Während der Somitogenese wird das somitische Gewebe periodisch vom präsomitischen Mesoderm (PSM) abgetrennt3. Das PSM ist räumlich durch Gradienten von Wnt, Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und Retinsäuresignalisierung organisiert. Im anterioren PSM an der Bestimmungsfront, wo Wnt- und FGF-Signale niedrig sind, werden die Zellen für die Differenzierung in Somiten vorbereitet. Differenzierung tritt auf, wenn eine Welle der transkriptionellen Aktivierung diese Bestimmungsfront erreicht. Innerhalb des PSM oszillieren Wnt-, FGF- und Notch-Signale. Benachbarte Zellen oszillieren leicht aus der Phase, was zu Wellen oszillatorischer transkriptioneller Aktivierung stromabwärts der Wnt-, FGF- und Notch-Signalwege führt, die sich vom hinteren zum vorderen PSM bewegen. Bei Mausembryonen erreicht etwa alle 2 h eine Transkriptionswelle die Bestimmungsfront und leitet die Somitbildung ein. Die Untersuchung der Somitogenese durch Störung oder Aktivierung von Signalwegen kann die Bedeutung dieser Signalwege veranschaulichen4,5,6,7,8,9. Um jedoch die Funktion der Signaldynamik bei der Steuerung des zellulären Verhaltens untersuchen zu können, ist es unerlässlich, Signalwege subtil zu modulieren, anstatt sie dauerhaft zu aktivieren oder zu hemmen.

Um die Signalwegaktivität innerhalb des segmentierenden Mausembryos zeitlich zu modulieren, haben Sonnen et al. ein mikrofluidisches System entwickelt10. Dieses System ermöglicht die enge Kontrolle der Flüssigkeitsströme innerhalb von Mikrokanälen eines Chips, der die biologische Probe enthält11. Um die Bedeutung der Signaldynamik für die korrekte Segmentierung von PSM zu untersuchen, wird dieses Mikrofluidik-Setup verwendet, um die Signaldynamik der Maussegmentierungsuhr ex vivo zu modulieren. Durch sequentiell pulsierende Signalwegaktivatoren oder Inhibitoren in die Kulturkammer wird eine externe Kontrolle der Dynamik von Wnt-, FGF- und Notch-Signalen erreicht10. So ist es beispielsweise möglich, die Periode einzelner Signalwege und die Phasenbeziehung zwischen mehreren oszillierenden Signalwegen zu modifizieren. Mit Hilfe der gleichzeitigen Echtzeitbildgebung dynamischer Signalreporter kann der Einfluss der Mitnahme auf die Pfade selbst, auf die Differenzierung und die Somitbildung analysiert werden. Unter Verwendung dieses Maßes an Kontrolle über die Signaldynamik wurde die Bedeutung der Phasenbeziehung zwischen Wnt- und Notch-Signalwegen während der Somitogenese hervorgehoben10.

Personalisierte Chipdesigns ermöglichen eine Vielzahl von Optionen für raumzeitliche Störungen innerhalb der lokalen Umgebung, z. B. stabile Gradientenbildung12,13,14,15, pulsierende Aktivierung/Hemmung10,16,17,18 oder lokalisierte Störungen19,20 . Die Mikrofluidik kann aufgrund der Automatisierung der experimentellen Handhabung auch ein reproduzierbareres Auslesen und einen höheren Durchsatz ermöglichen21,22,23. Das vorliegende Protokoll soll die Mikrofluidik und die Mitnahme endogener Signalschwingungen innerhalb von Geweben in jedes Standardlabor der Biowissenschaften bringen. Auch wenn keine ausgeklügelten Geräte für die Chiperzeugung wie Reinraum und Geräte für die Softlithographie vorhanden sind, können mikrofluidische Chips hergestellt und zur Beantwortung biologischer Fragestellungen eingesetzt werden. Formen können mit einer frei verfügbaren CAD-Software (Computer Aided Design) entworfen werden. Ein Werkzeug zur Herstellung von mikrofluidischen Chips, in der Regel bestehend aus Polydimethylsiloxan (PDMS), kann mit einem 3D-Drucker gedruckt oder bei Druckereien bestellt werden. Auf diese Weise können mikrofluidische Chips innerhalb eines Tages hergestellt werden, ohne dass teure Geräte erforderlich sind24. Hier ist ein Chip-Design vorgesehen, mit dem eine Form zur Mitnahme der Maus-Segmentierungsuhr in zweidimensionalen (2D) ex vivo Kulturen25 mit einem 3D-Drucker gedruckt werden kann.

On-Chip-Kulturen und präzise Störungen, die durch Mikrofluidik ermöglicht werden, haben ein hervorragendes Potenzial, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, wie Signalwege das multizelluläre Verhalten steuern. Signaldynamik und morphogene Gradienten sind für viele Prozesse in der Entwicklung erforderlich. Zuvor hatten Labore kultivierte Zellen, Gewebe und ganze Organismen in mikrofluidischen Chips und Protokolle für die raumzeitliche Störung von hauptsächlich 2D-Zellkulturen werden an anderer Stelle zur Verfügung gestellt12,26,27,28,29. Die Anwendung der Mikrofluidik zur Modulation lokaler Umgebungen in multizellulären Systemen eröffnet neue Perspektiven für Hochdurchsatz- und präzise raumzeitliche Störungen. Das Gebiet der Mikrofluidik hat nun einen Punkt erreicht, an dem es zu einem nicht-spezialisierten, kostengünstigen und leicht anwendbaren Werkzeug für Entwicklungsbiologen geworden ist.

Hier wird ein Protokoll für die Mitnahme der Maussegmentierungsuhr zu Impulsen eines Notch-Signalinhibitors bereitgestellt. Ein solches Experiment besteht aus den folgenden Schritten: (1) Erzeugung des mikrofluidischen Chips, (2) Vorbereitung der Schläuche und Beschichtung des Chips und (3) dem mikrofluidischen Experiment selbst (Abbildung 1A). Die Forschung an Wirbeltiermodellsystemen bedarf der vorherigen ethischen Genehmigung durch das zuständige Gremium.

Protocol

Die hier vorgestellte Forschung wurde von der Ethikkommission des EMBL10 und der niederländischen Kommission für Tierversuche (dierenexperimentencommissie, DEC) genehmigt und folgt den Hubrecht-Richtlinien für die Tierpflege. Tragen Sie Handschuhe, während Sie mit flüssigem PDMS arbeiten. Decken Sie Oberflächen und Geräte ab. Entfernen Sie verschüttete Flüssigkeiten sofort, da die Reinigung nach dem Aushärten schwierig wird. 1. Generierung des Chips HINWEIS: Mikrofluidische Chips werden durch Gießen von PDMS (Polydimethylsiloxan) in einer Form erzeugt. Formen können mit CAD-Software (z.B. uFlow oder 3DμF30) konstruiert werden. Ein Repository freier Designs wird vom MIT (Metafluidics.org) zur Verfügung gestellt. Formen werden entweder mit einem 3D-Drucker gedruckt oder können durch Softlithografie mit einer Fotomaske erzeugt werden, die das gewünschte Design enthält (für weitere Informationen siehe z.B. Qin et al., 201031). Hier wird ein Design für eine Form bereitgestellt, die mit einem 3D-Drucker für die On-Chip-Kultur von Mausembryogewebe gedruckt werden kann (Abbildung 1B, C, Ergänzende Dateien 1 und 2). Um das Drucken mit 3D-Druckern mit niedrigerer Auflösung zu ermöglichen, wurde das Design im Vergleich zu dem zuvor veröffentlichten10 geändert. Eine Form ohne Luftblasenfallen und eine mit Luftblasenfallen ist vorhanden (Zusatzdateien 1 bzw. 2). Da das Druckverfahren vom verfügbaren Drucker abhängt, werden die Details zum Drucken nicht beschrieben. Man muss jedoch sicherstellen, dass das gesamte unpolymerisierte Harz vollständig entfernt wird. Es ist oft erforderlich, zusätzliches Waschen mit Lösungsmitteln durchzuführen, um unpolymerisiertes Harz aus den kleinen <200 μm-Löchern in der Mikrofluidikkammer zu entfernen. Diese Löcher bilden PDMS-Säulen, um das embryonale Gewebe innerhalb des Chips während des Experiments einzufangen. PDMS wird im Allgemeinen für die Mikrofluidik verwendet, da es billig, biokompatibel und transparent ist und eine geringe Autofluoreszenz aufweist. Nach dem Aushärten wird der PDMS-Chip aus der Form geschnitten und auf einen Glasschieber geklebt. Die Plasmabehandlung sowohl des Glases als auch des PDMS-Chips aktiviert die Oberflächen und ermöglicht die Bildung kovalenter Bindungen, wenn sie in Kontakt gebracht werden. Bereiten Sie die erforderliche Menge an PDMS vor, indem Sie das Monomer mit dem Katalysator in einem Verhältnis von 9:1 (w:w) mischen, um eine Polymerisation zu induzieren. Verwenden Sie Einwegwerkzeuge zum Mischen, z. B. Plastikbecher und Gabeln. Stellen Sie sicher, dass die Mischung ordnungsgemäß erreicht wird. Legen Sie das PDMS-Gemisch in einen Exsikkator und legen Sie etwa 30 Minuten lang Vakuum auf, um Luft aus dem PDMS-Gemisch zu entfernen. Aufgrund des Vakuums im Exsikkator wird Luft aus dem PDMS-Gemisch entfernt.HINWEIS: Bedecken Sie die Innenseite des Exsikkators mit Geweben, falls PDMS überfließt. Gießen Sie die PDMS-Mischung in die Chipform (eine PDMS-Schicht von ca. 3-5 mm reicht aus). Legen Sie die mit PDMS gefüllte Form wieder in den Exsikkator und wenden Sie Vakuum an, um verbleibende Blasen zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Luft aus allen kleineren Strukturen der Form entfernt wird. Härten Sie die Form aus, indem Sie sie über Nacht in einen 65 °C (oder je nach Formmaterial) Ofen legen. Schneiden Sie den Chip mit einem Skalpell aus der Form. Schneiden Sie das gehärtete PDMS aus der Form mit ausreichend Platz (1-2 cm) um das Design herum, um eine spätere Verklebung zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass Sie das PDMS vollständig schneiden, um ein Brechen des Chips beim Entfernen zu verhindern. Heben Sie den PDMS-Chip vorsichtig ab, zuerst mit dem stumpfen Ende des Skalpells und wenn möglich mit den Händen. Stanzen Sie Einlass- und Auslasslöcher, beginnend im Inneren der mikrofluidischen Kammer mit einem 1-mm-Biopsiestempel. Reinigen Sie den PDMS-Chip kurz mit Druckluft und kleben Sie beidseitig Klebeband an, um festsitzende PDMS- und Staubstücke zu entfernen und bis zum weiteren Gebrauch sauber zu halten.HINWEIS: Der Chip kann bis zur weiteren Verwendung so aufbewahrt werden. Reinigen Sie den Glasschieber mit Druckluft. Achten Sie darauf, dass es nicht kaputt geht. Entfernen Sie das Klebeband vom PDMS-Chip. Verkleben Sie den Chip mit einem Plasmaofen mit dem Glasobjektträger. Die folgenden Anweisungen sind für Luftplasma optimiert.HINWEIS: Konsultieren Sie das Handbuch des Plasmaofens des Labors und optimieren Sie das Verfahren für das spezifische Experiment. Legen Sie den Chip und den Glasschieber mit den zu verklebenden Seiten nach oben in den Plasmaofen. Legen Sie den Deckel auf den Plasmaofen und halten Sie ihn fest, während Sie Vakuum auftragen, und warten Sie, bis sich das Vakuum etabliert hat. Schalten Sie das Gas durch Drücken der Gastaste ein und warten Sie ca. 1 min (der Druck sollte bei etwa 0,37 mbar liegen). Erzeugen Sie Plasma durch Drücken des Generators (Leistung: 9.0, Zeit: 1 min). Wenn Sie fertig sind, schalten Sie die Pumpe und das Gas aus; Lüften und öffnen Sie die Tür. Verkleben Sie den Chip mit dem Glas, indem Sie die aktivierten Oberflächen aufeinander legen und gleichmäßig Druck ausüben. Achten Sie darauf, dass das Glas nicht bricht.HINWEIS: Ein Wassertest kann durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die Plasmabehandlung funktioniert hat. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf die Glasoberfläche. Wenn die Plasmabehandlung funktioniert hat, sollte sich das Wasser sofort ausbreiten, anstatt einen Tröpfchen zu bilden. Den geklebten Chip 5 min bei 65 °C in einen Ofen stellen. Versiegeln Sie die freiliegende Seite des Chips mit Klebeband, um zu verhindern, dass Staub in die Einlässe gelangt.HINWEIS: Der Chip kann bis zur Verwendung aufbewahrt werden. Öffnungen sollten bis dahin mit Klebeband verschlossen werden. 2. Vorbereitung des Mikrofluidik-Experiments HINWEIS: Die folgenden vorbereitenden Schritte sind notwendig, um das Mikrofluidik-Experiment durchzuführen: Erstens wird bei der Durchführung des Mikrofluidik-Experiments ein Flüssigkeitsstrom von den Einlässen zu den Auslässen erzeugt. Alle Löcher im Chip fungieren aufgrund des Druckaufbaus von den Einlässen als Auslässe. Daher müssen alle Löcher, die nicht verwendet werden, geschlossen werden; Zum Beispiel Löcher, die verwendet werden, um Gewebe auf den Chip zu laden. Wenn diese nicht geschlossen sind, kann das Gewebe mit der Flüssigkeit abfließen. Um diese Löcher zu schließen, werden PDMS-gefüllte Schläuche verwendet. Der mit PDMS gefüllte Schlauch kann unbegrenzt aufbewahrt werden und muss daher nicht für jedes Mikrofluidik-Experiment separat vorbereitet werden, sondern kann in größeren Chargen hergestellt werden. Zweitens werden vor Beginn des mikrofluidischen Experiments Schläuche, PDMS-gefüllte Schläuche und der für das Experiment erforderliche Chip vorbereitet und UV-sterilisiert. Schließlich muss der Chip mit Fibronektin beschichtet werden, damit sich das embryonale Gewebe an das Glas anlagern kann25. Herstellung von PDMS-gefüllten Schläuchen. Nehmen Sie ±1 m Schläuch. Mehr Schläuche können mit PDMS gefüllt werden, indem mehrere Schlauchstücke genommen werden. Bereiten Sie die erforderliche Menge an PDMS vor, indem Sie das Monomer mit dem Katalysator in einem Verhältnis von 9:1 (w:w) mischen, um eine Polymerisation zu induzieren.HINWEIS: Verwenden Sie zum Mischen Einwegwerkzeuge wie Plastikbecher und Gabeln. Richtig mischen. Legen Sie das PDMS-Gemisch in einen Exsikkator und legen Sie etwa 30 Minuten lang Vakuum auf, um Luft aus dem PDMS-Gemisch zu entfernen.HINWEIS: Bedecken Sie die Innenseite des Exsikkators mit Geweben, falls PDMS überfließt. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit PDMS. Füllen Sie vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen in der Mischung zu verhindern. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze einer 22-G-Nadel in den Schlauch einzuführen.HINWEIS: Achten Sie darauf, den Schlauch oder Ihre Finger nicht mit der Nadel zu durchstechen. Befestigen Sie den Schlauch über die Nadel an der PDMS-gefüllten Spritze. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um den Schlauch mit einer Durchflussrate von ca. 500 μL / h zu füllen. Achten Sie darauf, keinen zu hohen Druck auszuüben, um ein Brechen der Pumpe zu verhindern. Sobald der Schlauch vollständig mit PDMS gefüllt ist, legen Sie ihn in eine 15 cm große Schale und härten Sie ihn bei Raumtemperatur (mindestens über Nacht) aus. Bereiten Sie den Schlauch und den Chip für das Experiment vor.HINWEIS: Für das Experiment werden folgende Schläuche benötigt: erstens ca. 50 cm Schlauch pro Auslass und zweitens ca. 2-3 m pro Einlass (die genaue Größe hängt von der räumlichen Organisation der später verwendeten Pumpen, des Inkubators oder des Mikroskops ab). Der Einlassschlauch muss lang sein, damit sich das Kulturmedium während des Experiments mit CO2 für die Embryonenkultur ausgleichen kann. Schneiden Sie den Schlauch in einem Winkel von 45° ab, so dass spitze Enden entstehen. Dies erleichtert das Einführen des Schlauches in die Löcher des Chips. Befestigen Sie eine Nadel an jedem der Einlassschläuche. Siehe Schritt 2.1.5. Schneiden Sie PDMS-gefüllte Schläuche in ±1 cm Stecker. In einem Winkel von 45° geschnitten, so dass spitze Enden erzeugt werden; Dies erleichtert das Einführen des Schlauches in die Löcher des Chips. Es werden genügend Stecker benötigt, um jedes Loch zu füllen, das nicht an einem Schlauch befestigt ist. Entfernen Sie das Klebeband vom Chip. Legen Sie alle Schläuche mit Nadeln, den Chip und die Stöpsel in eine Schale und sterilisieren Sie, indem Sie sie ±15 Minuten lang UV-Licht aussetzen. Es kann jede Zellkulturhaube mit der Möglichkeit zur UV-Sterilisation verwendet werden. Beschichtung des Chips mit Fibronektin.HINWEIS: Für die Kultur von 2D-Ex-vivo-Kulturen des hinteren PSM beschichten Sie den Chip mit Fibronektin. Legen Sie den Chip in ein Becherglas, das PBS + 1% Penicillin/Streptomycin bei Raumtemperatur enthält. Stellen Sie sicher, dass der Chip vollständig mit PBS bedeckt ist. Spülen Sie den Chip mit PBS, um Luft mit einer P200-Pipette zu entfernen.HINWEIS: Die gesamte weitere Handhabung des Chips erfolgt in diesem Becherglas bis zum Beginn des Experiments, um das Eindringen von Luft in den Chip zu verhindern. Achten Sie darauf, den Glasschieber des Chips nicht zu zerbrechen. Bereiten Sie 2 ml 1:20 Fibronectin in PBS vor und füllen Sie es in ein Becherglas. Laden Sie eine 3-ml-Spritze für jede Kammer des Chips. Führen Sie mit einer Pinzette eine 22 G Nadel in den Auslassschlauch ein. Befestigen Sie die Nadel an der Spritze, die Fibronektin enthält. Schließen Sie die Spritze an die Spritzenpumpe an. Spülen Sie den Schlauch, bis keine Luft mehr im Schlauch ist. Befestigen Sie den Auslassschlauch am Auslass des Chips. Stellen Sie sicher, dass Sie den Schlauch ganz nach unten drücken. Stellen Sie eine niedrige Durchflussrate ein, um den Chip zu beschichten. Alle anderen Öffnungen können offen bleiben. Lassen Sie die Spritzenpumpe mindestens 2 h laufen, kann auch über Nacht laufen. Stoppen Sie die Pumpe. Schneiden Sie den Schlauch direkt nach der Nadel ab. Der verbleibende Schlauch wird später während des Experiments als Auslass dienen. 3. Mikrofluidik-Experiment HINWEIS: Hier wird ein Protokoll für die Mitnahme der Maussegmentierungsuhr in 2D-Ex-vivo-Kulturen durch Anwendung von Impulsen des Notch-Signalinhibitors DAPT vorgestellt. Die Anwendung von Impulsen mit einer Periode von 130 min, nahe der natürlichen Periode der Maussegmentierungsuhr (137 min25), ermöglicht eine effiziente Mitnahme. Es werden Impulse von 100 min Medium und 30 min 2 μM DAPT angelegt (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von Arzneimitteln im Chip wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff überwacht. Die Anregungs- und Emissionsspektren dieses Farbstoffs und des fluoreszierenden Signalreporters müssen unterschiedlich genug sein, um ein Durchbluten während der Fluoreszenz-Echtzeitbildgebung zu verhindern. Wenn gelbe fluoreszierende Proteine als Signalreporter verwendet werden, wie der Notch-Signalreporter LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), kann der Farbstoff Cascade Blue angewendet werden. Um andere mögliche Kombinationen von Fluoreszenzfarbstoff und Reporter zu identifizieren, kann ein frei verfügbarer Spektrenbetrachter verwendet werden. Der Effekt der Mitnahme kann durch Echtzeit-Bildgebung von dynamischen Signalmeldern erfasst werden5,10,32. Jeder Chip verfügt über zwei Inkubationskammern. Dies ermöglicht den direkten Vergleich von Medikamentenpulsen (DAPT) zu Kontrollimpulsen (DMSO). Machen Sie mittel und degas. Am Tag des Experiments stellen Sie 50 ml Kulturmedium vor (DMEM-F12 ergänzt mit 0,5 mM Glukose, 2 mM Glutamin und 1% BSA, für weitere Informationen über die Schwanzknospenkultur der Maus siehe25). Bereiten Sie mit dem Medium gefüllte Spritzen für das Experiment vor. Kulturmedium in Bechergläsern vorbereiten: Um Notch-Signalisierungsschwingungen zu erfassen, bereiten Sie 6 ml Medium mit 1,2 μL DMSO + 10 μM Cascade Blue vor; 6 ml Kulturmedium mit 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; zwei Röhren mit je 6 ml Medium. Verwenden Sie mindestens 6 ml Medium pro Spritze. Spritzen mit dem Medium beladen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Spritzen mit Arzneimitteln und DMSO kennzeichnen. Entgasen Sie den Chip in PBS und die Spritzen, die Medium in einem Exsikkator enthalten. Legen Sie die Spritzen mit der Spitze nach oben in ein Becherglas, damit die Luft oben entweichen kann. Es kann vorkommen, dass der Chip schwimmt und noch mit Blasen gefüllt ist. Diese werden anschließend entfernt. Versuchen Sie, die meisten Luftblasen aus dem Chip mit einer P200-Pipette auszuspülen / aufzusaugen. Wenn etwas Luft übrig bleibt, wird diese während des folgenden Experiments entfernt. Installieren Sie Spritzen in den Pumpen und befestigen Sie Einlassschläuche an den Spritzen. Um die Notch-Signalisierung zu unterstützen, verwenden Sie zwei Spritzenpumpen, von denen eine die mittleren Spritzen und eine die Arzneimittel- / DMSO-Spritzen trägt. Lassen Sie dies mit einer höheren Durchflussrate (0,5 ml / h) bis zum Beginn des Experiments laufen, um Luftblasen aus dem Schlauch zu entfernen. Achten Sie darauf, die Spritzendetails (Durchmesser) in der Pumpe richtig einzustellen. Laden von Gewebe auf den Chip. Sezieren Sie das Embryogewebe der Maus. Sezieren Sie die hinterste Spitze des Schwanzes (Schwanzknospen). Legen Sie das sezierte Gewebe in das Kulturmedium + 25 μM HEPES. Spülen Sie den Chip mit Kulturmedium + 25 μM HEPES mit einem P200, um PBS zu entfernen. Legen Sie das Gewebe mit einer P200-Pipette in den Chip (Abbildung 1C). Achten Sie darauf, keine Luftblasen in den Chip einzuführen.HINWEIS: Effizientes Laden erfordert etwas Übung. Wenn das Gewebe nicht richtig ausgerichtet ist, kann es möglich sein, es durch vorsichtiges Aussaugen und erneutes Einspülen zu drehen. Dies führt jedoch oft zu einem schnellen Zelltod. Schließen Sie nach jedem Tissue-Loading-Schritt den entsprechenden Tissue-Loading-Einlass mit einem Stück PDMS-gefülltem Schlauch. Stellen Sie sicher, dass die Stecker mit einer stumpfen Pinzette ausreichend an die Unterseite des Chips gedrückt werden. Nachdem alle Proben geladen wurden, schließen Sie alle nicht verwendeten Ein- und Auslässe mit PDMS-gefüllten Schläuchen mit stumpfen Pinzetten. Montage des mikrofluidischen Aufbaus. Senken Sie den Durchfluss der Mikrofluidikpumpen. 60-100 μL / h funktioniert gut für Schwanzknospen von Mausembryonen. Bei höheren Durchflussraten wurde der Zelltod beobachtet – vermutlich aufgrund einer zu hohen Zellscherung. Der kumulative Durchfluss mehrerer Pumpen sollte diese 60-100 μL/h pro mikrofluidischer Kammer zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht überschreiten. Befestigen Sie den Schlauch am Mikrofluidik-Chip. Tun Sie dies, ohne Luftblasen im Chip zu bekommen (dies kann erreicht werden, indem sichergestellt wird, dass am Ende des Schlauches ein Tropfen Medium vorhanden ist). Aus der Fibronektinbeschichtung sind noch Auslässe vorhanden (siehe 2.3). Sobald alle Schläuche am Chip befestigt sind, nehmen Sie ihn aus dem Becherglas, trocknen Sie ihn richtig, legen Sie ihn in eine Schale und legen Sie ihn zusammen mit ca. 1,5 m Einlassschlauch in einen Inkubator (37 °C, 20% O2, 5% CO2) für die Nachtkultur. Der Schlauch ist gasdurchlässig; Dies ermöglicht das Gleichgewicht von O2 und CO2 im Medium. Alternativ werden für die simultane Fluoreszenz-Echtzeit-Bildgebung der Chip und der ca. 1,5 m lange Einlassschlauch direkt in das Mikroskop gelegt. Ein Halter für den Chip, der in Standard-96-Well-Plattenhalter passt, ist in der Zusatzakte 3 enthalten.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit während der Inkubation hoch genug ist. Falls erforderlich, fügen Sie der Bildgebungskammer oder dem Inkubator ein feuchtes Gewebe hinzu, um eine Verdunstung im Mikrofluidik-Setup zu verhindern. Wenn die Luftfeuchtigkeit im Mikroskop-Inkubator zu niedrig ist, führt dies zur Bildung von Luftblasen im Schlauch und im Mikrofluidik-Chip. Anschließend kann eine geschlossene Imaging-Box verwendet werden, in der Chip und Schlauch platziert werden. Die einfachste Möglichkeit, eine solche Bildgebungsbox herzustellen, besteht darin, einen großen Deckel über den Chip zu legen und ein nasses Gewebe hinzuzufügen, das nicht vollständig verschlossen werden muss. Achten Sie darauf, dass der Höhenunterschied zwischen Pumpe und Splitter nicht zu groß ist und ändern Sie gegebenenfalls langsam die Höhe, um die Bildung von Luftblasen aufgrund der Schwerkraft zu verhindern. Lassen Sie alle Pumpen 20 Minuten lang mit einer Durchflussrate von 20 μL/h fließen, nachdem der Aufbau an seinen endgültigen Standort gebracht wurde. Da sich die Kammer und die Pumpe höchstwahrscheinlich in die Höhe bewegt haben, ist dies notwendig, um den korrekten Druck im Schlauch wiederherzustellen. Schalten Sie die Medikamentenpumpe aus, lassen Sie nur die mittlere Pumpe mit 60 μL / h bis zum Beginn des Experiments / der Echtzeit-Bildgebung laufen. Beginn des Experiments. Starten Sie das geplante Pumpprogramm für das Experiment. Um die Notch-Signalisierung zu unterstützen, verwenden Sie ein Pumpprogramm von 100 min Medium und 30 min Medikamentenpulsen, das bis zum Ende des Experiments wiederholt wird, typischerweise für 24 h.HINWEIS: Jede programmierbare mikrofluidische Pumpe kann verwendet werden. Im einfachsten Format können die Pumpen manuell programmiert und gestartet werden. Alternativ können die Pumpen von einer Computersoftware gesteuert werden. Falls eine Echtzeitbildgebung durchgeführt wird, beginnen Sie mit der Bildgebung nach einem Zeitraum von mindestens 30 Minuten. Dadurch kann sich die Temperatur des Chips an die Temperatur im Inkubator anpassen und eine zu starke Drift während der Bildgebung verhindern. Der Autofokus ist immer noch von Vorteil. Führen Sie eine konfokale Standardbildgebung über den Glasobjektträger des Chips mit einem inversen Mikroskop durch. Verwenden Sie ein Bildgebungsintervall von 10 Minuten, um Signalschwingungen mit einer Periode von 130 min ausreichend zu erkennen. Verkürzen Sie bei kürzeren Zeiträumen das Intervall für eine ausreichende Probenahme. Fügen Sie eine niedrig aufgelöste Bildspur zur Erkennung von Cascade Blue hinzu, um das Vorhandensein von Arzneimitteln auf dem Chip zu visualisieren. Zur Anregung eines Venusreporters verwenden Sie einen 515-nm-Laser oder einen 2-Photonen-Laser bei einer Wellenlänge von 960 nm. Erfassen Sie einen Z-Stack von 6-8 Ebenen mit einem Abstand von 8 μm durch ein 20-faches Planobjektiv (Auflösung 512 x 512 Pixel, 1,38 μm/Pixel). Verwenden Sie eine motorisierte Stufe, um mehrere Proben innerhalb eines Experiments abzubilden. Excite Cascade Blue mit einem 405-nm-Laser und erfassen Sie alle 10 min eine einzelne Z-Ebene (Auflösung 32 x 32 Pixel, 22,14 μm/Pixel).HINWEIS: Weitere Informationen zur Bildgebung und Bildanalyse finden Sie in den Repräsentativen Ergebnissen und finden Sie in Referenz10.

Representative Results

Mit diesem Protokoll wird ein Verfahren zur externen Mitnahme von Signalschwingungen der Maussegmentierungsuhr mittels Mikrofluidik vorgestellt. Durch die Anwendung von Impulsen des Notch-Signalinhibitors werden Signalschwingungen in unabhängigen Embryokulturen miteinander synchronisiert10. Eine Voraussetzung für die Anwendung dieses Systems zur Untersuchung der Funktionalität der Segmentierungsuhr ist, dass Signaldynamik und Segmentierung immer noch auf dem Chip vorhanden sind. Es wurde bereits gezeigt, dass sowohl die Wnt- als auch die Notch-Signaldynamik trotz konstanter mittlerer Strömung aufrechterhalten werden und die physikalische Grenzbildung in peripheren 2D-Kulturen, die anteriore PSM10 darstellen, bestehen bleibt. Um die Mitnahme von Signalschwingungen zu externen Medikamentenpulsen zu bestätigen, wird während des mikrofluidischen Experiments eine Echtzeit-Bildgebung beispielsweise des Notch-Signalreporters LuVeLu5 durchgeführt, der das gelb fluoreszierende Protein Venus exprimiert. Da die Orientierung der 2D-Kulturen auf dem Chip schwer zu kontrollieren ist, werden Signalschwingungen im Vordergewebe analysiert. Die Peripherie der 2D-Kultur kann reproduzierbar detektiert werden. Die Orientierung der Gewebeabschnitte auf dem Chip kann nicht nach Belieben kontrolliert werden und die gesamte innere Oberfläche des Chips wird mit Fibronektin beschichtet. Daher kommt es gelegentlich vor, dass Kulturen an den Seiten oder der Decke des Chips befestigt werden. Wenn sich die Proben aus dem Sichtfeld bewegen (in x-, y- und z-Richtung) oder sie mit dem hinteren Ende des Schwanzes nach unten befestigen, sind diese Proben im Allgemeinen ausgeschlossen. Für weitere Analysen werden mehrere solcher Mitnahmeexperimente kombiniert. Unabhängige Experimente können aufeinander abgestimmt werden, indem das Timing der Arzneimittelimpulse verwendet wird, die durch den Farbstoff Cascade Blue bei etwa 400 nm visualisiert werden. Um die Synchronisation zu analysieren und zu visualisieren, können quantifizierte Schwingungen detrendiert werden (Abbildung 2B,D) und dann entweder als Mittelwert und Standardabweichung angezeigt oder Phasen der Schwingungen berechnet werden. Dies ermöglicht die Analyse der Phasenbeziehung zwischen Schwingungen unabhängiger hinterer Embryokulturen zueinander und zu den externen Wirkstoffpulsen (Abbildung 2C,E). Das Python-basierte Programm pyBOAT33 ist ein einfaches und benutzerfreundliches Werkzeug zur Bestimmung von Periode, Phase und Amplitude solcher Signalschwingungen. Um die Mitnahme zu bestätigen, kann man beispielsweise den Zeitraum der endogenen Signalschwingungen bestimmen. Bei der Anwendung von Impulsen mit einer Periode von 130 min zeigen Notch-Signalschwingungen ebenfalls eine Periode von 130 min (Abbildung 2F)10. Darüber hinaus können mit Hilfe von Cascade Blue-Impulsen unabhängige Experimente mit verschiedenen Signalmeldern aufeinander abgestimmt werden. Auf diese Weise kann die Phasenbeziehung zwischen Schwingungen mehrerer Signalreporter indirekt bestimmt werden10. Somit ermöglicht das vorgestellte mikrofluidische System die Kontrolle von Signalschwingungen in Ex-vivo-Kulturen des sich entwickelnden Mausembryos. In Kombination mit der Abbildung von Markern für die Segmentbildung und -differenzierung kann dieses System nun angewendet werden, um zu analysieren, wie Signalwege der Segmentierungsuhr interagieren und wie sie die Somitbildung steuern. Abbildung 1: Schematische Übersicht des Mikrofluidik-Protokolls. (A) Chipformen können mit CAD-Software (Computer Aided-Design) entworfen werden. Ein Chip-Design zur Aufnahme von Signalschwingungen in Ex-vivo-Modellen der Maussomitogenese wird bereitgestellt. Formen können beispielsweise durch 3D-Druck erzeugt oder bestellt werden. Mikrofluidische Chips werden durch Formen von PDMS hergestellt. Ein gehärteter PDMS-Chip wird ausgeschnitten und mit einem Plasmaofen kovalent mit einem Glasobjektträger verbunden. Die Glasoberfläche innerhalb des Chips ist mit Fibronektin beschichtet, damit sich seziertes Gewebe anlagern kann. Embryonales Gewebe wird über Ladeeinlässe auf den Chip geladen, die anschließend verschlossen werden. An den Einlässen des Chips werden Pumpen mit unterschiedlichen Medienbedingungen angebracht und ein Strömungsprogramm initialisiert. Gewebe kann während des Experiments mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden. (Kymographen nach Sonnen et al., 201810. Nachdruck und Änderung von Cell gemäß Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Schematische Zeichnung eines Formentwurfs für die On-Chip-Kultur von hinterem Mausembryogewebe. Die Höhe der mikrofluidischen Kanäle beträgt 500 μm, ausreichend für die Kultur von hinteren embryonalen Mausschwänzen. Die Datei zum Drucken dieser Form wird in der Zusatzdatei 1 bereitgestellt, und eine Alternative ist in der Zusatzdatei 2 angegeben. (C) Hellfeldbild eines E10.5-ausgeschnittenen Mausschwanzes, der von PDMS-Säulen auf dem Chip umgeben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse eines Mikrofluidik-Experiments. (A) Schematische Darstellung des Entrainment-Experiments mit Medium und Wirkstoffpumpe. Impulse des Signalwegmodulators werden auf Ex-vivo-Kulturen von Mausembryonen angewendet, und Signalschwingungen können durch Echtzeit-Bildgebung dynamischer Signalreporter (z. B. der Notch-Signalreporter LuVeLu5 und der Wnt-Signalreporter Axin2T2A10) visualisiert werden. Gestrichelte Linien geben den Bereich an, der für Analysen im Zeitverlauf verwendet wird. (B-F) LuVeLu-Reporter-Oszillationen werden durch periodische Impulse des Notch-Signalinhibitors DAPT mitgerissen. (B,D) Quantifizierungen von Notch-Signalisierungsschwingungen im vorderen PSM bei der Mitnahme mit DAPT oder einer DMSO-Steuerung. (C,E) Phasen-Phasen-Beziehung zeichnet zwischen der Phase der Notch-Signalschwingungen und dem Timing externer DAPT/DMSO-Impulse auf. Im Falle einer Mitnahme wird eine stabile Phasenbeziehung hergestellt. (F) Quantifizierung der mittleren Periode und des SEM von Reporteroszillationen beim Vergleich von Proben, die mit DMSO- und DAPT-Impulsen mitgeführt werden. (Abbildung adaptiert von Sonnenet al., 201810. Nachdruck und Änderung von Cell gemäß Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Problem Lösungsvorschlag(e) Das PDMS haftet nicht mit dem Glas. – Stellen Sie sicher, dass sowohl das PDMS als auch das Glas sauber sind. – Stellen Sie sicher, dass genügend PDMS um die Kammer herum zum Verkleben vorhanden sind. – Optimieren Sie die Einstellungen des Plasmaofens. Auf meinem Chip befinden sich Luftblasen. – Überprüfen Sie, ob die Pumpe eingeschaltet war. – Entgasen Sie den Chip, bevor Sie Gewebe auf den Chip laden. – Entgasen Sie das Medium vor Beginn des Experiments. – Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit in der Inkubationskammer hoch genug ist. Das Gewebe stirbt zu Beginn des Experiments ab. – Fügen Sie dem Medium HEPES hinzu, wenn Sie den Chip laden und montieren. – Spülen Sie das Gewebe während des Ladens nicht zu oft ein und aus. – Überprüfen Sie, ob die Durchflussrate nicht zu hoch ist. Das Gewebe stirbt während der Bildgebung ab. – Stellen Sie sicher, dass keine Phototoxizität aus der Bildgebung vorliegt – Stellen Sie sicher, dass keine Kontamination vorliegt. – Die Durchflussmenge sollte nicht zu hoch sein. Der Fokus ändert sich während der Bildgebung. – Verwenden Sie den Autofokus während der Bildgebung, um die Drift des Bildobjektträgers anzupassen. – Lassen Sie den Chip mindestens 30 Minuten lang auf die Temperatur innerhalb des Mikroskops ausgleichen. Steckdosen/Einlässe lösen sich. – Drücken Sie alle Schläuche vollständig nach unten. Das Glas des Chips zerbricht. – Seien Sie vorsichtiger, das Glas ist sehr zerbrechlich. – Das dünne Glas wird nur für die Bildgebung benötigt. Wenn keine Bildgebung durchgeführt wird, kann ein normaler dickerer Glasobjektträger verwendet werden. – Wenn der Bruch außerhalb des Chips liegt, ist dies möglicherweise kein Problem. Wenn die Glasdichtung am Chip gebrochen ist, tritt Flüssigkeit aus und Luft kommt herein. Es gibt eine Kontamination auf meinem Chip. – Fügen Sie dem Kulturmedium Antibiotika hinzu. – Sterilisieren Sie alle Geräte und Schläuche. – Arbeiten Sie schnell und sauber. Tabelle 1: Fehlerbehebung Zusatzakte 1: STL-Datei zum Drucken einer Form mit einem 3D-Drucker. Diese Form wird verwendet, um einen mikrofluidischen Chip für die On-Chip-Kultur des hinteren embryonalen Gewebes zu erzeugen (Design in Abbildung 1). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsakte 2: STL-Datei zum Drucken einer Form mit einem 3D-Drucker, um einen mikrofluidischen Chip für die On-Chip-Kultur des hinteren embryonalen Gewebes zu erzeugen. Im Gegensatz zur Zusatzdatei 1 und der in Abbildung 1 gezeigten Konstruktion enthält diese Konstruktion Blasenfallen an allen Einlässen, um zu verhindern, dass kleine Luftmengen in die Hauptmikrofluidikkammer gelangen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsakte 3: Designdatei für die Generierung eines Halters, um den Chip in das Mikroskop zu legen. Dieser Halter hat die Abmessungen einer 96-Well-Platte und sollte in Standardhalter der meisten Mikroskope passen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Wie die Signaldynamik multizelluläre Systeme steuert, ist seit langem eine Frage in diesem Bereich. Die funktionelle Untersuchung stellt eine zentrale Herausforderung dar, da diese Dynamiken subtil moduliert werden müssen, um dies zu ermöglichen11. Eine solche zeitliche Kontrolle über Bahnstörungen kann prinzipiell mit der Optogenetik erreicht werden, was auch eine hohe räumliche Kontrolle ermöglicht34. Die Optogenetik erfordert jedoch die Etablierung ausgefeilter genetischer Werkzeuge für die Analyse jedes einzelnen Signalwegs. Das hier beschriebene aktuelle Protokoll bietet ein äußerst vielseitiges Werkzeug für die Störung jedes Signalwegs. Das Mikrofluidik-Experiment ermöglicht die Anwendung von zeitlich kontrollierten Wirkstoffpulsen, um die Dynamik von Signalwegen in Gewebekulturen funktionell zu untersuchen. Hier liegt der Fokus auf der Untersuchung der Somitogenese in Ex-vivo-Kulturen , aber das Protokoll kann an alle anderen Modellsysteme angepasst werden.

Bestimmte Schritte im Protokoll sind entscheidend für die Durchführung eines erfolgreichen Mikrofluidik-Experiments (zusammengefasst in Tabelle 1). Die wichtigsten Punkte werden wie folgt erörtert. Durch den mittleren Durchfluss im Verlauf des Experiments erfährt die Gewebekultur Scherbeanspruchung. Die Exposition des Modellsystems gegenüber kontinuierlichem Fluss kann zu Zellstress und in extremen Fällen zum Zelltod aufgrund des Schereffekts führen. Für Ex-vivo-Gewebekulturen von Mausschwanzknospen und das aktuelle Chipdesign wurde eine Durchflussrate von 60 μL/h (maximal 100 μL/h) gefunden, die bei minimalem Schereffekt gut funktioniert. Wenn mehrere Pumpen gleichzeitig für denselben Chip eingeschaltet werden, muss die Durchflussrate einzelner Pumpen entsprechend angepasst werden, um keine Erhöhung der Gesamtdurchflussrate zu verursachen. Wenn das aktuelle Protokoll an andere Modellsysteme und Chipdesigns angepasst wird, sollte die Durchflussrate optimiert werden. Alternativ ist es möglich, das Medium nicht kontinuierlich zu spülen, sondern das Medium auf dem Chip35 periodisch zu wechseln. Ein solches Setup kann auch angewendet werden, um Signalschwingungen in der Maussomitogenese zu steuern (unveröffentlicht, Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus kann man sich auch einen Aufbau vorstellen, bei dem Gewebekulturen keinem direkten Flüssigkeitsfluss ausgesetzt sind, sondern Medikamente das Gewebe durch Diffusion aus einem benachbarten Kanal erreichen. Solche Systeme wurden erfolgreich eingesetzt, um Gradienten von Wachstumsfaktoren auf In-vitro-Modelle der ESC-Differenzierung anzuwenden14,36.

Ein Hauptproblem mikrofluidischer Experimente ist das Auftreten von Luftblasen auf dem Chip während des Experiments. Luftblasen im Chip oder Schlauch können den gleichmäßigen Flüssigkeitsfluss auf dem Chip stören und dazu führen, dass die Embryokultur von ihrem Standort entfernt wird. Um das Vorhandensein von Luftblasen zu verhindern, sind verschiedene Schritte des Protokolls unerlässlich. Zunächst muss das Kulturmedium in Spritzen und der mikrofluidische Chip selbst mit einem Exsikkator entgast werden (Schritt 3.1.3). Zweitens muss beim Laden von Proben in die Ladeeinlässe darauf geachtet werden, dass keine Luft zusammen mit der Probe in den Chip pipettiert wird (Schritt 3.2.3). Drittens müssen beim Befüllen des Schlauches mit Medium alle Luftblasen abgepumpt werden, bevor der Chip angebracht wird (Schritt 3.3.2). Andernfalls werden diese Blasen während des Experiments in den Hauptchip gedrückt. Schließlich wird das Medium während des Experiments aufgrund des semipermeablen Schlauches in der Bildgebungskammer oder im Inkubator ausgeglichen. Die Durchlässigkeit des Schlauches ermöglicht auch die Verdunstung des Mediums, also stellen Sie sicher, dass die Feuchtigkeit während des Experiments reguliert wird, um die Bildung neuer Blasen im Schlauch zu verhindern.

Im Allgemeinen ist die Mikrofluidik ein sehr vielseitiges Werkzeug, das an die spezifische Fragestellung des Forschers angepasst werden kann. Der aktuelle Designansatz ermöglicht die parallele Abbildung von bis zu 12 Ex-vivo-Kulturen pro Chip. Diese Anzahl ist hauptsächlich durch die Anzahl der Embryonen pro Experiment und die Zeit begrenzt, die benötigt wird, um jede Embryokultur mit ausreichender Auflösung abzubilden. Wenn mehrere Bedingungen in einem einzigen Experiment verglichen werden müssen, können mehrere Chips auf einem einzigen Glasobjektträger montiert werden. Es wird ein Chip-Design bereitgestellt, das ideal für die parallele Abbildung mehrerer Gewebeexplantationen ist, aber personalisierte Designs können Einschränkungen in der Probenanzahl überwinden, um eine Analyse mit hohem Durchsatz zu ermöglichen und die Kombination von mehr Bedingungen innerhalb eines einzigen Experiments zu erhöhen16,17. Die Mikrofluidik beschränkt sich auf Modelle, die auf einem Chip kultiviert werden können, und die On-Chip-Kultur muss für jedes Modellsystem einzeln optimiert werden27,37,38.

In den letzten 5-10 Jahren wurde die Mikrofluidik aufgrund ihres Potenzials für Hochdurchsatzansätze und subtile Modulationen von Signaldynamiken und Gradienten zur Lösung verschiedener biologischer Fragen eingesetzt. Heutzutage ist die Mikrofluidik zu einem leicht anwendbaren, billigen und vielseitigen Werkzeug geworden, das Labore mit Leichtigkeit etablieren können. Hier ist das aktuelle Protokoll für eine bestimmte Anwendung optimiert, nämlich die Untersuchung der Signaldynamik, die die Somitogenese steuert. Es ist einfach, dieses Protokoll und Design an individuelle Forschungsfragen in der Gewebebiologie anzupassen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Yang Li und Jos Malda von der EMK Utrecht für die Hilfe beim 3D-Druck von Formen, Karen van den Anker von der Sonnen-Gruppe für das sehr nützliche Feedback zum Protokoll und Tjeerd Faase von der mechanischen Werkstatt des Hubrecht-Instituts für den Halter für mikrofluidische Chips im Mikroskop. Wir danken der gesamten Sonnen-Gruppe für die kritische Lektüre des Manuskripts und den Gutachterinnen und Gutachtern für ihr konstruktives Feedback. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen einer ERC Starting Grant Agreement Nr. 850554 an K.F.S. gefördert.

Materials

10 mL syringe Becton, Dickinson and company 300912
184 Silicon Elastomer curing agent SYLGARD 1673921
184 Silicon Elastomer PDMS SYLGARD 1673921
3 ml syringes Becton, Dickinson and company 309657
Adhesive tape Scotch Magic tape or similar
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel Fisher Scientific 10663341
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 Biowest P6154
Compressed air system
Crystallizing dish VWR 10754-7 Sterilized
D-(+)-Glucose 45% Sigma G8769
Desiccator VWR 467-0104
Disposable cups Duni 173 941
Disposable forks Staples 511514
Dissection equipment
DMEM/F12 Cell culture technologies custom DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose
Fibronectin Sigma F1141-5MG
Flow hood BioVanguard Greenline CleanAir by Baker 511514 For UV light source
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm Marienfeld 107999098
HEPES Buffer Gibco 15630-056
L-glutamine Gibco 25030024
Microscope Leica Leica SP8 MP
Needles 22G Becton, dickinson and company z412139-100EA
Oven VWR 390-09
PBS0
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Plasma oven Femto Diener electronic
Punch Ø 1mm Uni-Core WB100073
Scale Sartorius Entris
Syringe pump WPI AL-4000
Tubing Ø 1mm APT AWG24T
Vacuum pump VWR 181-0308
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Riferimenti

  1. Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  2. Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
  3. Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  4. Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
  5. Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  6. Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
  7. Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
  8. Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding – From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
  9. Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
  10. Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
  11. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  12. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
  13. Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
  14. Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
  15. Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
  16. Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  18. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
  19. Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
  20. Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
  21. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  22. Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
  23. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  24. Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
  25. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
  26. Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
  27. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  28. Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
  29. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
  30. Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF – Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  31. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  32. Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
  33. Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data – pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
  34. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  35. Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
  36. Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
  37. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
  38. Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).

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van Oostrom, M. J., Meijer, W. H. M., Sonnen, K. F. A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis. J. Vis. Exp. (169), e62318, doi:10.3791/62318 (2021).
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