一种微流体方法，用于控制体力生成的信号振荡的功能研究

这里介绍的研究已获得EMBL伦理委员会10 和荷兰动物研究委员会（dierenexperimentencommissie，DEC）的批准，并遵循Hubrecht动物护理指南。 使用液体PDMS时戴上手套。覆盖表面和设备。立即清除任何溢出物，因为一旦硬化，清洁就会变得困难。 1. 芯片的产生 注：微流控芯片是通过在模具中铸造PDMS（聚二甲基硅氧烷）而产生的。可以使用CAD软件（例如uFlow或3DμF30）设计模具。麻省理工学院（Metafluidics.org）提供了免费设计库。模具要么用3D打印机打印，要么可以使用包含所需设计的光掩模通过软光刻生成（有关更多信息，请参见，例如，Qin等人，201031）。在这里，提供了一种模具设计，该模具可以用3D打印机打印，用于小鼠胚胎组织的片上培养（图1B，C，补充文件1和2）。为了允许使用较低分辨率的3D打印机进行打印，与之前发布的one10相比，该设计已经过修改。提供没有气泡捕集器的模具和带气泡捕集器的模具（分别为补充文件1和2 ）。由于打印过程取决于可用的打印机，因此不会描述打印的详细信息。但是，必须确保完全去除所有未聚合的树脂。通常需要用溶剂进行额外的洗涤，以从微流体室内的小<200μm孔中除去未聚合的树脂。这些孔将形成PDMS柱，以在实验过程中将胚胎组织捕获在芯片内。PDMS通常用于微流体，因为它便宜，生物相容性，透明，并且具有低自发荧光。固化后，PDMS芯片从模具中切出并粘合到载玻片上。玻璃和PDMS芯片的等离子体处理激活表面，并在接触时形成共价键。 通过将单体与催化剂以9：1的比例（w：w）混合以诱导聚合来制备所需量的PDMS。使用一次性工具进行混合，例如塑料杯和叉子。确保正确实现混合。 将PDMS混合物置于干燥器中，并真空约30分钟，以从PDMS混合物中除去空气。由于干燥器内的真空，空气将从PDMS混合物中除去。注意：用纸巾覆盖干燥器的内部，以防PDMS流过。 将PDMS混合物倒入芯片模具中（约3-5毫米的PDMS层就足够了）。 将充满PDMS的模具放回干燥器中，并施加真空以除去任何剩余的气泡。确保从模具的所有较小结构中除去空气。 通过将模具置于65°C（或更低的温度取决于模具材料）烤箱中过夜来固化模具。使用手术刀将芯片从模具中切出。将硬化的PDMS从模具中切割出来，在设计周围留出足够的空间（1-2厘米），以便以后粘合。确保完全切断PDMS，以防止取出时芯片破裂。小心地抬起PDMS芯片，首先用手术刀的钝端，如果可能的话，用手。 打孔和出气孔，从微流体室内部开始，使用1 mm活检冲头。 用压缩空气短暂清洁PDMS芯片，并在两侧贴上胶带，以清除任何卡住的PDMS碎片和灰尘，并保持清洁，直到进一步使用。注意：芯片可以保持如下，直到进一步使用。 用压缩空气清洁载玻片。注意不要损坏。从 PDMS 芯片上取下胶带。 使用等离子烤箱将芯片粘合到载玻片上。以下说明针对空气等离子体进行了优化。注意：请参阅实验室等离子烘箱的手册，并针对特定实验优化程序。 将芯片和载玻片放入等离子烤箱中，其两侧朝上粘合。 将盖子放在等离子烤箱上，并在施加真空的同时将其固定到位，然后等待真空建立。 按下 Gas 按钮打开 气体 ，等待约 1 分钟（压力应在 0.37 mbar 左右）。 通过压制 发电机 产生等离子体（功率：9.0，时间：1分钟）。 完成后，关闭泵和气体;通风并打开门。 通过将激活的表面相互放置并均匀施加压力，将芯片粘合到玻璃上。小心玻璃不会破裂。注意：可以进行水测试以确认等离子体处理是否有效。在玻璃表面上滴一滴水。如果等离子体处理有效，水应立即扩散而不是形成液滴。 将粘合的芯片置于65°C的烘箱中5分钟。 用胶带密封芯片的外露面，以防止灰尘进入入口。注：芯片可以保留直至使用。在此之前，应用胶带封闭开口。 2. 准备微流体实验 注意：进行微流体实验需要以下准备步骤：首先，在执行微流体实验时，从入口到出口产生流体流动。由于入口的压力积聚，芯片中的任何孔都将用作出口。因此，必须关闭所有未使用的孔;例如，用于将组织加载到芯片上的孔。如果这些没有闭合，组织可能会随液体流出。为了关闭这些孔，使用PDMS填充的管子。PDMS填充的管子可以无限期保存，因此不需要为每个微流体实验单独制备，而是可以大批量生产。其次，在微流体实验开始之前，准备并进行UV灭菌的管子，PDMS填充的管子和实验所需的芯片。最后，芯片必须涂覆纤连蛋白，以便胚胎组织可以附着在玻璃上25。 制作充满PDMS的卡套管。 取±1米的油管。通过采用多块卡套管，可以用PDMS填充更多的管子。 通过将单体与催化剂以9：1的比例（w：w）混合以诱导聚合来制备所需量的PDMS。注意：使用一次性工具混合，如塑料杯和叉子。正确混合。 将PDMS混合物置于干燥器中，并真空约30分钟，以从PDMS混合物中除去空气。注意：用纸巾覆盖干燥器的内部，以防PDMS流过。 在 3 mL 注射器中加入 PDMS。小心填充以防止混合物中形成气泡。 使用镊子将22 G针的尖端插入管子。注意：注意不要用针刺穿管子或手指。 通过针头将管子连接到PDMS填充的注射器上。使用注射泵填充管道，流速约为500μL / h。注意不要施加太高的压力，以防止泵破裂。 一旦管道完全充满PDMS，将其放入15厘米的培养皿中并在室温下固化（至少过夜）。 为实验准备管材和芯片。注意：实验需要以下管道：首先，每个出口约50厘米的管道，其次，每个入口约2-3米（确切尺寸取决于稍后使用的泵，培养箱或显微镜的空间组织）。入口管需要很长，以使培养基在实验过程中与CO2 平衡以进行胚胎培养。 以45°角切割管子，以形成尖头;这将使将管子插入芯片的孔中变得更加容易。将一根针连接到每个进气管。请参阅步骤 2.1.5。 将充满 PDMS 的管道切成 ±1 cm 的插头。以45°角切割，以创建尖头;这将使将管子插入芯片的孔中变得更加容易。需要足够的塞子来填充未连接到任何管道的每个孔。 从芯片上取下胶带。 将所有连接有针头的管子，芯片和插头放入培养皿中，并通过暴露在紫外线下±15分钟进行灭菌。可以使用任何具有紫外线杀菌可能性的细胞培养罩。 用纤连蛋白涂覆芯片。注意：对于后PSM的2D 离体 培养物，用纤连蛋白涂覆芯片。 将芯片放入室温下含有PBS + 1%青霉素/链霉素的烧杯中。确保芯片完全被PBS覆盖。用PBS冲洗芯片，用P200移液器除去空气。注意：在实验开始之前，芯片的所有进一步处理都将在此烧杯中完成，以防止空气进入芯片。小心不要破坏芯片的载玻片。 在PBS中准备2毫升1：20纤连蛋白，然后放入烧杯中。 为芯片的每个腔室装入3 mL注射器。使用镊子，将22 G针插入出口管中。将针头连接到含有纤连蛋白的注射器上。 将注射器连接到注射器泵。冲洗管子，直到管子里没有空气。 将出口管连接到芯片的出口。确保将管子一直推到底部。设置低流速以涂覆芯片。所有其他开口都可以保持打开状态。让注射泵运行至少2小时，也可以运行一夜。 停止泵。在针头之后立即切断管子。其余的管道将在以后的实验中用作出口。 3. 微流体实验 注意：这里，提出了一种通过应用Notch信号抑制剂DAPT的脉冲在2D 离体 培养物中夹带小鼠分割时钟的方案。应用周期为130分钟的脉冲，接近小鼠分割时钟的自然周期（137 min25），可以有效地夹带。施加100分钟培养基和30分钟2μM DAPT的脉冲（图2A）。使用荧光染料监测芯片内药物的存在。这种染料和荧光信号报告基因的激发光谱和发射光谱必须足够不同，以防止在荧光实时成像过程中渗漏。当黄色荧光蛋白用作信号报告时，例如Notch信号报告器LuVeLu5 （Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe），可以应用Cascade Blue染料。为了鉴定荧光染料和报告者的其他可能组合，可以使用免费提供的光谱查看器。夹带效应可以通过动态信令报告者的实时成像来检测5，10，32。每个芯片有两个孵育室。这允许直接比较药物脉冲（DAPT）以控制脉冲（DMSO）。 制作介质和脱气。 在实验当天，准备50mL培养基（DMEM-F12补充0.5mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺和1%BSA，以进一步了解小鼠尾芫培养物的信息，请参阅25）。 准备充满培养基的注射器进行实验。在烧杯中制备培养基：为了夹带Notch信号振荡，准备6mL培养基与1.2μLDMSO + 10μM级联蓝;6 mL培养基，2 μM DAPT + 10 μM级联蓝;两个试管，每个试管含有 6 mL 培养基。每个注射器至少使用6毫升培养基。将注射器与培养基一起加载。确保在含有药物和DMSO的注射器上贴上标签。 在PBS内对芯片和干燥器中含有介质的注射器进行脱气。将注射器放入烧杯中，尖端朝上，以便空气可以在顶部逸出。芯片可能会漂浮并且仍然充满气泡。这些将随后被删除。 尝试使用P200移液器冲洗/吸走芯片中的大部分气泡。如果残留了一些空气，将在以下实验中将其清除。 在泵中安装注射器，并将入口管连接到注射器上。要夹带Notch信号，请使用两个注射器泵，一个携带中等注射器，一个携带药物/ DMSO注射器。让它以更高的流速（0.5 mL / h）运行，直到实验开始，以从管道中除去气泡。小心在泵中正确设置注射器细节（直径）。 将组织加载到芯片上。 解剖小鼠胚胎组织。解剖尾巴（尾花）的最后端。将解剖的组织放入培养基+ 25μM HEPES中。 使用P200用培养基+ 25μMHEPES冲洗芯片以除去PBS。 使用P200移液器将组织加载到芯片中（图1C）。确保不要将气泡引入芯片。注意：高效装载需要一些练习。如果组织的方向不正确，可以通过小心地吸出并再次冲洗来翻转它。然而，这通常会导致细胞快速死亡。 在每个组织加载步骤之后，使用一块PDMS填充的管子关闭相应的组织加载入口。确保使用钝镊子将插头充分推到芯片底部。 装载完所有样品后，使用钝钳用PDMS填充的管子关闭任何未使用的入口/出口。 微流体装置的组装。 降低微流体泵的流速。60-100 μL/h适用于小鼠胚胎尾芽。在较高的流速下，观察到细胞死亡 – 可能是由于细胞剪切过高。在给定时间，多个泵的累积流量不应超过每个微流体室60-100μL / h。 将管子连接到微流控芯片上。这样做不会在芯片内部产生气泡（这可以通过确保管子末端存在一滴介质来实现）。纤连蛋白涂层的出口仍然存在（见2.3）。 一旦所有管子都连接到芯片上，将其从烧杯中取出，适当干燥，将其放入培养皿中，然后将其与约1.5m的入口管一起放入培养箱（37°C，20%O2，5%CO 2）中过夜培养。管道是透气的;这将允许介质中O2 和CO2 的平衡。或者，对于同步荧光实时成像，将芯片和约1.5 m的进气管直接放入显微镜中。该芯片的支架适合标准的 96 孔板支架，在 补充文件 3 中提供。注意：在孵育过程中，请确保湿度足够高。如有必要，将湿组织添加到成像室或培养箱中，以防止微流体设置中的蒸发。如果显微镜培养箱中的湿度过低，则会导致管道和微流控芯片中形成气泡。然后可以使用封闭的成像盒，其中放置芯片和管子。制作这种成像盒的最简单方法是在芯片上放置一个大盖子并添加湿纸巾，而不必完全关闭。确保泵和切屑之间的高度差不会太大，如有必要，请缓慢改变高度，以防止由于重力作用而形成气泡。 让所有泵以20μL/h的流速流动20分钟，在设置放置到其最终位置后。由于腔室和泵的高度很可能已经移动，因此这对于在管道中重新建立正确的压力是必要的。 关闭药物泵，仅让培养基泵以60μL / h的速度运行，直到实验/实时成像开始。 实验开始。 启动实验的计划泵送计划。为了夹带Notch信号传导，使用100分钟培养基和30分钟药物脉冲的泵送程序，重复直到实验结束，通常持续24小时。注：可以使用任何可编程微流体泵。在最简单的格式中，泵可以手动编程和启动。或者，泵可以通过计算机软件进行控制。 如果执行实时成像，请在至少30分钟后开始成像。这将允许芯片的温度调整到培养箱内的温度，并防止成像过程中出现过强的漂移。自动对焦仍然是有益的。 使用倒置显微镜通过芯片的载玻片执行标准共聚焦成像。使用10分钟的成像间隔来充分检测130分钟周期的信号振荡。 对于较短的时间段，请缩短间隔以获得足够的采样。包括用于检测Cascade Blue的低分辨率成像轨迹，以可视化芯片上是否存在药物。 对于Venus报告者的激发，请使用波长为960nm的515nm激光或2光子激光。 通过 20 倍平面物镜（分辨率 512 x 512 像素，1.38 μm/像素）获取距离为 8 μm 的 6-8 个平面的 z 堆栈。使用电动载物台对一个实验中的多个样品进行成像。 用405 nm激光激发级联蓝，每10分钟采集一个z平面（分辨率32 x 32像素，22.14μm/像素）。注：有关成像和图像分析的更多信息在代表性结果中提供，可在参考文献中找到10。