Difracción de electrones de microcristales de moléculas pequeñas
Summary
Aquí, describimos los procedimientos desarrollados en nuestro laboratorio para preparar polvos de cristales de moléculas pequeñas para experimentos de difracción de electrones de microcristales (MicroED).
Abstract
Se describe un protocolo detallado para preparar muestras de moléculas pequeñas para experimentos de difracción de electrones de microcristales (MicroED). MicroED se ha desarrollado para resolver estructuras de proteínas y moléculas pequeñas utilizando equipos de criomicroscopía electrónica estándar (crio-EM). De esta manera, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas solubles y proteínas de membrana se han determinado recientemente a altas resoluciones. Aquí se presentan protocolos para preparar cuadrículas de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas utilizando el medicamento carbamazepina como ejemplo. Se presentan protocolos para la selección y recopilación de datos. Los pasos adicionales en el proceso general, como la integración de datos, la determinación de la estructura y el refinamiento, se presentan en otra parte. El tiempo requerido para preparar las rejillas de moléculas pequeñas se estima en menos de 30 minutos.
Introduction
La difracción electrónica de microcristales (MicroED) es un método de criomicroscopía electrónica (crio-EM) para determinar estructuras de resolución atómica a partir de cristales de tamaño submicrométrico 1,2. Los cristales se aplican a las rejillas estándar del microscopio electrónico de transmisión (TEM) y se congelan sumergiéndolos en etano líquido o nitrógeno líquido. Luego, las rejillas se cargan en un TEM que opera a temperaturas criogénicas. Los cristales se ubican en la rejilla y se criban para la calidad de difracción inicial. Los datos MicroED de rotación continua se recopilan de un subconjunto de los cristales apantallados, donde los datos se guardan utilizando una cámara rápida como una película3. Estas películas se convierten a un formato cristalográfico estándar y se procesan casi idénticamente como un experimento de cristalografía de rayos X4.
MicroED fue desarrollado originalmente para investigar microcristales de proteínas 1,2. Un cuello de botella en la cristalografía de proteínas está creciendo cristales grandes y bien ordenados para experimentos tradicionales de difracción de rayos X de sincrotrón. Como los electrones interactúan con órdenes de magnitud de materia más fuertes que los rayos X, las limitaciones del tamaño del cristal necesario para producir difracción detectable son considerablemente menores5. Además, la relación de eventos de dispersión elástica a inelástica es más favorable para los electrones, lo que sugiere que se pueden recopilar datos más útiles con una exposición general más pequeña5. Los desarrollos constantes han permitido que los datos de MicroED se recopilen de los microcristales más desafiantes 6,7,8,9.
Recientemente, MicroED ha demostrado ser una herramienta poderosa para determinar las estructuras de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas a partir de materiales aparentemente amorfos10,11,12,13. Estos polvos pueden provenir directamente de una botella de reactivo comprado, una columna de purificación o incluso de triturar una píldora en un polvo fino10. Estos polvos parecen amorfos a simple vista, pero pueden estar compuestos completamente de nanocristales o simplemente contener trazas de depósitos nanocristalinos en una fracción amorfa no cristalina mayor. La aplicación del material a la cuadrícula es fácil, y los pasos posteriores de identificación de cristales, cribado y recopilación de datos podrían incluso automatizarse en un futuro próximo14. Mientras que otros pueden utilizar diferentes métodos para la preparación de muestras y la recolección de datos, aquí se detallan los protocolos desarrollados y utilizados en el laboratorio de Gonen para preparar muestras de moléculas pequeñas para MicroED y para la recolección de datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación de muestras suele ser un proceso iterativo, donde las optimizaciones se realizan después de sesiones de selección y recopilación de datos. Para muestras de moléculas pequeñas, a menudo es prudente intentar primero la preparación de la rejilla sin descargar las rejillas con resplandor, ya que muchos productos farmacéuticos tienden a ser hidrófobos10,11. Si las rejillas tienen muy pocos depósitos nanocristalinos, es una buena idea volver a …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El laboratorio Gonen cuenta con el apoyo de fondos del Instituto Médico Howard Hughes. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
Riferimenti
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