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Biochimica

Un pipeline de préparation d’échantillons pour les microcristaux à la ligne de faisceau VMXm

Published: June 17, 2021
doi:
10.3791/62306
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1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council,Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute,Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Le rapport signal/bruit des données est l’une des considérations les plus importantes lors de la réalisation de mesures de diffraction des rayons X à partir de microcristaux. La ligne de faisceau VMXm fournit un environnement à faible bruit et un microfaisme pour de telles expériences. Ici, nous décrivons les méthodes de préparation des échantillons pour le montage et le refroidissement des microcristaux pour VMXm et d’autres lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire microfocus.

Abstract

Le montage de microcristaux (10 μm <) pour la cryocristallographie monocristalline présente un défi non négligeable. Des améliorations de la qualité des données ont été observées pour les microcristaux avec le développement de l’optique de la ligne de faisceau, la stabilité du faisceau et la focalisation de la taille variable du faisceau de submicrons à microns, comme à la ligne de faisceau VMXm à Diamond Light Source1. D’autres améliorations de la qualité des données seront obtenues grâce à des améliorations de l’environnement des échantillons et de la préparation des échantillons. Les microcristaux génèrent intrinsèquement une diffraction plus faible, donc l’amélioration du signal au bruit est essentielle pour collecter des données de diffraction des rayons X de qualité et provient principalement de la réduction du bruit de fond. Les principales sources de bruit de fond des rayons X dans une expérience de diffraction proviennent de leur interaction avec le trajet de l’air avant et après l’échantillon, de l’excès de solution de cristallisation entourant l’échantillon, de la présence de glace cristalline et de la diffusion de toute autre instrumentation de ligne de faisceau ou de fenêtres à rayons X. La ligne de faisceau VMXm comprend une instrumentation et un protocole de préparation des échantillons pour réduire toutes ces sources de bruit.

Tout d’abord, un environnement d’échantillon sous vide chez VMXm supprime le chemin de l’air entre la source de rayons X et l’échantillon. Ensuite, les protocoles de préparation d’échantillons pour la cristallographie macromoléculaire chez VMXm utilisent un certain nombre de processus et d’outils adaptés de cryoTEM. Il s’agit notamment de grilles de cuivre avec des films de support en carbone troués, d’un buvard automatisé et d’une robotique de refroidissement par plongée utilisant de l’éthane liquide. Ces outils permettent la préparation de centaines de microcristaux sur une seule grille cryoTEM avec un minimum de liquide environnant sur un support à faible bruit. Ils minimisent également la formation de glace cristalline à partir de tout liquide restant entourant les cristaux.
Nous présentons le processus de préparation et d’évaluation de la qualité des microcristaux de protéines solubles à l’aide de la lumière visible et de la microscopie électronique à balayage avant de monter les échantillons sur la ligne de faisceau VMXm pour des expériences de diffraction des rayons X. Nous fournirons également des exemples d’échantillons de bonne qualité ainsi que ceux qui nécessitent une optimisation et des stratégies supplémentaires pour le faire.

Introduction

Un obstacle majeur pour la détermination des structures à haute résolution des molécules biologiques par cristallographie macromoléculaire (MX) reste la production de cristaux bien diffractants à une taille acceptable. Il existe de nombreuses stratégies pour atteindre cet objectif, de la conception de la construction de gènes protéiques recombinants à la recherche de grandes matrices clairsemées pour des cocktails chimiques pouvant générer des cristaux initiaux2. Pour ces derniers, il arrive souvent que le cristallographe ait besoin d’optimiser les premiers coups pour obtenir des cristaux avec une qualité et une taille de diffraction suffisantes pour les études de détermination de la structure3. Malgré ces options, certaines molécules cibles peuvent ne jamais générer de cristaux gros (>10 μm) et bien diffractants et, par conséquent, le cristallographe doit persévérer avec leurs microcristaux et les défis que ces échantillons présentent. Il s’agit notamment du montage et de la cryoprotection appropriés des cristaux, de la gestion d’une diffraction intrinsèquement plus faible et d’une sensibilité accrue aux rayonnements. Les microcristaux sont formés à partir de moins de cellules unitaires et de molécules que de cristaux plus gros et, en tant que tels, la diffraction n’est pas amplifiée dans la même mesure que les cristaux plus gros, ce qui entraîne des intensités de diffraction intrinsèquement plus faibles. Il est important que le signal de fond ne masque pas ces réflexions, en particulier à une résolution plus élevée où de faibles intensités de réflexion peuvent être perdues4. En outre, les microcristaux sont plus sensibles aux dommages causés par les radiations et malgré l’enregistrement de la diffraction à des températures d’azote liquide5, il peut ne pas être possible de collecter des données complètes à partir d’un seul cristal, ce qui rend nécessaire la collecte de données à partir d’un très grand nombre de cristaux pour produire un seul ensemble de données complet6.

La disponibilité croissante des lasers à électrons libres à rayons X (XFEL) et l’évolution des méthodes de cristallographie en série (SFX)7 ont fourni des voies pour collecter des données à partir de microcristaux plus petits. Cependant, il s’agit de méthodes de livraison d’échantillons sur mesure, qui nécessitent une quantité importante d’expertise matérielle et logicielle, où les expériences sont limitées à la température ambiante et où la consommation d’échantillons est généralement élevée (des centaines de microlitres) et peut encore nécessiter une optimisation supplémentaire8. En tant que tels, les projets où seule une quantité limitée de microcristaux peut être réalisée ne sont pas appropriés pour SFX.

Pendant ce temps, la technologie des lignes de faisceau synchrotron au cours des dernières décennies a progressé pour produire des faisceaux plus petits et plus stables9 avec une brillance qui a permis la collecte de données à partir de cristaux de plus en plus petits10,11. Les lignes de faisceau microfocus telles que FMX à NSLS-II et I24 à Diamond Light Source ont été en mesure de déterminer de nouvelles structures à partir de cristaux de dimensions maximales d’environ 3 μm12 et de démontrer la capacité de collecter des données utilisables à partir de cristaux encore plus petits mesurant ~ 1 μm13. La ligne de faisceau doit être configurée avec précision, avec une excellente optique de visualisation sur axe à haute résolution, une sphère de confusion minimale pour la rotation de l’échantillon et un axe de rotation aligné avec précision qui coïncide avec le faisceau de rayons X. Il est important de faire correspondre étroitement le profil du faisceau de rayons X au volume du cristal et de s’assurer que le cristal est aligné avec précision dans le faisceau de rayons X – un défi pour les cristaux <5 μm14. Le respect de ces conditions expérimentales à la ligne de faisceau est essentiel pour enregistrer les données de la meilleure qualité à partir de microcristaux.

L’aspect restant et peut-être le plus important de la collecte de données à partir de microcristaux est la présentation du cristal au faisceau de rayons X. Les microcristaux ont souvent été montés sur des supports d’échantillons de micromesh, fabriqués à partir de polyimide, un matériau à faible diffusion des rayons X avec des ouvertures aussi petites que 10μm 15,16. Le maillage en polyimide est monté sur une broche standard qui est réglée dans une base magnétique SPINE, ce qui le rend compatible avec la plupart des lignes de faisceau MX17. Le support en maille est utilisé pour pêcher les cristaux de la chute de cristallisation en suivant souvent la même procédure que le montage d’un cristal de 100 μm à l’aide d’un support de type boucle standard. Bien que les cristaux puissent être répartis sur le maillage, un inconvénient majeur est qu’un volume relativement important de liquide peut être transporté par le maillage et la broche pendant la récolte (Figure 1C, D). Ce volume de liquide, qui peut être beaucoup plus grand que les cristaux eux-mêmes, contribuera au bruit de fond lorsqu’il est éclairé par des rayons X. Cette dispersion de fond peut être encore plus forte si le liquide forme de la glace cristalline pendant le refroidissement flash, diminuant le rapport signal/bruit d’intensités déjà faibles dans les résolutions de diffraction de la glace. Par conséquent, il est essentiel que l’excès de liquide soit retiré de l’échantillon, afin de s’assurer que tous les signaux possibles peuvent être enregistrés. Ce défi est encore plus grand dans le cas des cristaux de protéines membranaires formés dans la phase cubique lipidique (LCP), où le LCP génère une forte dispersion de fond et est également difficile à éliminer autour des cristaux 18.

La nouvelle ligne de faisceau VMXm (Versatile Macromolecular Crystallography Micromoleography Microfocus) à Diamond Light Source fournit les conditions pour collecter des données à partir de cristaux mesurant potentiellement moins d’un micron. La ligne de faisceau a été conçue pour fournir un profil de faisceau mesurant 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1,un goniomètre avec une sphère de confusion ne dépassant pas 60 nm et un environnement d’échantillon in vacuo. Ces caractéristiques de conception de la station d’extrémité VMXm minimisent la génération de bruit de rayons X de fond par l’appareil de ligne de faisceau lors de la collecte de données avec la plus grande source restante d’arrière-plan générée par l’échantillon14.

Des méthodes spécifiques de préparation des échantillons conçues pour la ligne de faisceau VMXm offrent la possibilité de réduire ce fond et d’améliorer encore le rapport signal-bruit des données de diffraction, maximisant ainsi la qualité des données pouvant être enregistrées à partir de microcristaux mesurant < 10 μm. Bon nombre des exigences décrites ici pour la diffraction à faible fond des microcristaux sont également courantes à la microscopie électronique à transmission cryogénique (cryoTEM)19 et à la diffraction électronique microcristallin (microED)20. En conséquence, de nombreux outils qui ont déjà été développés pour la préparation d’échantillons cryoTEM conviennent, avec quelques adaptations, à la préparation de microcristaux. Lors de la préparation d’échantillons pour le cryoTEM à particule unique, les particules étudiées sont incorporées dans des couches très minces (généralement <100 nm) de glace vitrée de sorte que les électrons sont capables de transmettre à travers l’échantillon. La fine couche uniforme est obtenue en effiant l’excès de liquide et la vitrification de l’échantillon est obtenue par refroidissement rapide de l’échantillon (~104 K s-1)21 en plongeant dans de l’éthane liquide maintenu à ~93 K22. En revanche, l’azote liquide, tel qu’il est couramment utilisé pour la préparation des échantillons MX, est un cryogène moins efficace que l’éthane et a une plus grande propension à la formation de glace cristalline dans l’échantillon21. La formation de glace cristalline, qui peut dégrader la diffraction et générer un bruit de fond, est normalement atténuée par l’utilisation de composés cryo-protégeants23. Les polymères de faible poids moléculaire tels que le poly-éthylène glycol (PEG) 400 et le méthyl-2,4-pentanediol (MPD), les sucres, les huiles ou les sels saturés peuvent être ajoutés à une aliquote de solution de cristallisation à de faibles concentrations24– il n’existe pas de solution unique pour sélectionner le cryoprotecteur le plus approprié et cela nécessite souvent une optimisation25 . Le cristal subit également de multiples manipulations au cours du processus de récolte et de cryo-protection qui peuvent endommager le cristal, la possibilité d’utiliser de l’éthane liquide permet l’omission de cette étape et aide à protéger l’intégrité du cristal.

Alors que l’éthane liquide est un cryogène efficace pour les microcristaux (<10 μm) en raison de la minceur de l’échantillon, il existe d’autres méthodes pour prévenir la formation de glace cristalline, en particulier dans les cristaux plus gros, y compris la réduction de la teneur en eau du cristal par l’utilisation d’un environnement humide étroitement contrôlé26, ou par l’évacuation de l’excès de liquide loin de la boucle et de la surface du cristal27 , cependant, ceux-ci nécessitent à nouveau une plus grande manipulation de l’échantillon. L’utilisation du buvard automatisé et de la congélation par plongeon avec de l’éthane liquide, comme dans cryoTEM, élimine ensemble l’excès de solution de cristallisation et fournit un moyen de flasher les microcristaux froids de manière contrôlée tout en essayant de minimiser la manipulation.

Ici, nous présentons un protocole qui peut être utilisé non seulement par les utilisateurs de la ligne de faisceau VMXm et à d’autres lignes de faisceau microfocus pour collecter des données de diffraction signal-bruit élevées, mais qui peut également être utile à ceux qui préparent des échantillons de cristaux de protéines solubles et de cristaux de protéines membranaires à base de détergent pour des expériences de microED. Alors que toutes les installations de préparation et d’évaluation des échantillons sont disponibles à VMXm, de nombreux laboratoires de biologie structurale sont de plus en plus équipés pour la préparation d’échantillons cryoTEM. Par conséquent, nous prévoyons que certains utilisateurs pourraient souhaiter utiliser leurs propres installations pour préparer leurs échantillons pour le temps de faisceau à VMXm.

Protocol

1. Configuration de l’équipement REMARQUE: Les méthodes décrites ici utilisent un instrument de congélation à piston avec un seul bras de buvard. Certains instruments sont équipés de deux bras de buvard et nous conseillons à l’utilisateur de vérifier les instructions du fabricant pour ajuster l’instrument afin qu’un seul bras de buvard soit utilisé. Assurez-vous qu’un microscope optique est positionné près de l’instrument de congélation à piston, idéalement de manière à ce que le microscope et le congélateur plongeant soient à la portée de l’utilisateur. Installez et refroidissez le congélateur automatique selon les instructions du fabricant.REMARQUE: La température de la chambre d’échantillonnage doit être réglée sur la température à laquelle les cristaux ont été cultivés. Ne placez pas de papier buvard dans la chambre d’échantillonnage.ATTENTION : L’éthane liquide est un explosif hautement inflammable et ne doit être utilisé que dans un endroit bien ventilé, loin des sources d’étincelles potentielles. Étiquetez les boîtes de grille de manière appropriée et refroidissez-les dans un petit dewar à l’aide d’azote liquide. Placez soigneusement les grilles, côté film de carbone vers le haut, sur un support approprié pour la décharge de lueur (comme une lame de microscope en verre enveloppée dans un parafilm). Grilles cryoTEM à décharge luminescente pendant 25 s à 0,39 mBar, en utilisant un courant de 15 mA. Décharge de lueur juste avant que les grilles ne soient utilisées. Gardez les grilles déchargées de lueur dans une boîte de Petri couverte jusqu’à ce qu’elle soit prête; si 30 minutes s’épuissent après la décharge de la lueur, répétez la décharge de la lueur.REMARQUE: Avec le congélateur à piston prêt et les grilles préparées, l’attention peut se tourner vers l’échantillon. 2. Détermination des paramètres de buvard initial Réglez l’humidité relative de la chambre d’échantillonnage à 90 % et le temps de buvardage à 5 s et assurez-vous que le congélateur plongeur est réglé pour plonger automatiquement l’échantillon une fois le buvard terminé.REMARQUE: Ces paramètres de démarrage sont les plus appropriés pour le congélateur plongeur Leica GP, d’autres paramètres tels que la force de buvard sont disponibles sur le FEI Vitrobot. Cependant, d’après notre expérience, l’intégrité cristalline est plus susceptible d’être maintenue par l’utilisation d’un seul bras de buvard. Pour pouvoir sceller le plateau de cristallisation une fois le puits d’intérêt ouvert, coupez une petite bande de ruban adhésif et pliez-la sur une extrémité pour créer une languette pour faciliter l’ouverture du joint et placez-la soigneusement sur un côté. Coupez le joint sur le puits de cristallisation, y compris le réservoir. En travaillant rapidement, appliquez 2 à 5 μL de solution réservoir sur la goutte contenant le cristal pour maintenir le volume liquide dans la goutte. Utilisez la languette de ruban adhésif pour ensuite resceller le puits et vous assurer que la goutte de cristallisation ne se dessèche pas. Tout en maintenant momentanément ouvert le ruban adhésif au-dessus du puits de cristallisation, transférer 10 μL de la solution du réservoir dans un tube de 0,5 mL pour l’utiliser pour les étapes ultérieures. Resécrivent le puits. Placez un morceau de papier buvard prédécoupé sur le bras de buvard de l’instrument de congélation à piston. Placez une seule grille déchargée de lueur dans les pinces de congélation plongeantes et chargez dans l’instrument de manière à ce que le côté carbone soit éloigné du bras de buvard. Assurez-vous que l’humidité relative à l’intérieur de la chambre de buvard est à 90%. Faites pivoter les pinces de sorte que le côté film de carbone fasse face au bras de buvard. À l’aide d’une pipette de 2,5 μL, appliquer 2 μL de solution de réservoir du tube de 0,5 mL sur le côté non support (cuivre brillant) de la grille cryoTEM. Faites pivoter la grille de sorte que le côté support carbone soit orienté vers l’extérieur du bras de buvard et répétez le processus, en appliquant soigneusement le liquide sur le côté support du film carbone de la grille. Évitez de toucher le film de carbone avec l’embout de la pipette afin de ne pas endommager le film de carbone. Le liquide doit se répandre sur le réseau en raison de la charge déposée lors du déchargement de la lueur. Lancez le processus de buvardage tout en observant la grille. Une lunette de visualisation est disponible sur le Leica GP2 à cet effet. Observez si le liquide est tiré de la surface en carbone de la grille pendant ce temps, cela commence par l’aplatissement de la majorité du bolus liquide sur la grille lorsque le liquide est pervers à travers la grille. Au fur et à mesure que le liquide dans chaque carré de grille est réduit davantage, une vague de « popping » à travers la surface de la grille peut être observée. Si cet effet est observé, le buvard peut être arrêté dans les 2-3 s de la fin de l’effet de popping. Il n’est pas nécessaire de plonger la grille d’essai qui peut être jetée. Si l’effet dit de « popping » n’est pas observé, répétez les étapes 2.11-2.14, en prolongeant à chaque fois le temps de buvard de 1 à 2 s jusqu’à ce que l’effet de popping soit observé juste avant que le bras de buvard ne se rétracte de la grille. Notez cette fois pour l’étape 3.REMARQUE: Il est important que le buvard cesse dès que cet effet de popping s’est produit pour s’assurer que pendant le processus, les cristaux ne se déshydratent pas à la suite d’un sur-buvard. Utilisez la solution de cristallisation du réservoir pour le refendage et la dilution de l’échantillon, car elle garantit que les cristaux sont soumis à une solution cohérente, réduisant ainsi le risque de déstabilisation des cristaux. 3. Récolte des cristaux Placez la plaque de cristallisation sous le microscope optique et positionnez bien la cible dans le champ de vision. Placez une grille fraîche et brillante dans les pinces du congélateur plongeant et montez les pinces dans le congélateur plongeant, le côté film de carbone faisant face au bras de buvard. Faites pivoter les pinces de sorte que le côté film de carbone fasse face au bras de buvard. À l’aide d’une pipette de 2,5 μL, appliquer 2 μL de solution de réservoir du tube de 0,5 mL sur le côté non support de la grille cryoTEM et faire pivoter la grille de sorte que le côté support du film de carbone soit orienté vers l’aissiment du congélateur plongeur. Retirez le joint temporaire et, avec la pipette réglée sur 2 μL, aspirez doucement la goutte de cristallisation à plusieurs reprises pour suspendre les microcristaux (il est important de ne pas introduire de bulles d’air dans la goutte).REMARQUE: Il est essentiel d’observer ce processus au microscope optique pour s’assurer que les cristaux sont libérés de toute peau de surface ou de la base du puits. Si les cristaux sont collés et non étirés avec aspiration, la pointe de la pipette ou d’autres outils de cristallisation tels qu’une aiguille d’acupuncture peuvent être utilisés pour déloger doucement les cristaux. Selon la taille des cristaux et la profondeur de champ du microscope optique, il est parfois possible de visualiser, à l’aide du microscope, les cristaux entrant dans la pointe de la pipette. Transférer 2 μL de la boue de microcristaux aspirés dans le congélateur plongeant et appliquer tout l’échantillon du côté carbone de la grille cryoTEM. Épongez pendant le temps déterminé à l’étape 2 et lancez immédiatement le gel. Lors de l’éponge, observez l’apparition d’un effet d’onde éclatante sur la grille et notez si cela s’est produit complètement sur la grille. La présence de cristaux peut affecter le temps d’éponge initial, et cela peut devoir être ajusté pour les grilles suivantes de 1-2 s. En travaillant rapidement, transférez la grille de l’éthane liquide à la boîte de grille immergée dans l’azote liquide. L’éthane résiduel peut se transformer en un solide blanc opaque sur la grille lorsqu’il pénètre dans l’azote liquide. Pour réduire cela, retirez régulièrement la grille de l’éthane liquide, puis transférez-la rapidement dans le réservoir d’azote liquide. Une fois que 4 grilles ont été placées dans la boîte à grille, fixez le couvercle de la boîte avec la vis et transférez-le soit sur un dewar en mousse d’azote liquide pour permettre une évaluation plus approfondie de l’échantillon avec un microscope électronique à balayage (MEB), soit sur un dewar de stockage d’azote liquide à l’aide d’un récipient de stockage approprié. 4. Évaluation de la densité de l’échantillon par microscopie optique ATTENTION : Cette méthode est destructrice. Si la disponibilité de l’échantillon est limitée, par exemple une ou deux gouttelettes de cristallisation, il est recommandé de sauter cette étape. Après la congélation des échantillons (étape 3.7), la distribution des cristaux sur la grille peut être évaluée. Montez une grille cryoTEM sèche à température ambiante dans les pinces plongeantes et placez les pinces sur le côté sur le microscope optique, avec la grille dans le champ de vision. Définissez un grossissement et un focus appropriés afin que toute la grille et les carrés de grille individuels puissent être résolus. Suivez les étapes 3.1 à 3.7. Au lieu de transférer la grille dans la boîte de grille (étape 3.8), rétractez la grille plongée de l’éthane liquide en réinitialisant le congélateur.ATTENTION : La grille et l’échantillon se réchaufferont à la température ambiante et ne pourront pas être utilisés pour d’autres expériences de diffraction. Retirez les pinces de l’instrument de congélation à piston. Tout en tenant la grille dans les pinces, placez la grille sous le microscope optique – la mise au point sera déjà grossièrement réglée. Effectuez une mise au point fine et évaluez la densité des cristaux à travers la grille. Une bonne grille contiendra plusieurs cristaux isolés loin des barres de grille dans chaque carré de grille et l’agglutination des cristaux est minime. Lorsque la densité des cristaux à l’intérieur de la grille entraîne l’agglutination des cristaux avec seulement quelques cristaux isolés, diluez davantage la boue cristalline avec une solution de réservoir et répétez l’étape 3. Faites attention lors de la dilution des échantillons afin que la dilution n’entraîne pas la dissolution des cristaux. Diluer les cristaux par étapes en utilisant de petits volumes de 0,5-1 μL. 5. Évaluation de l’échantillon par microscopie électronique à balayage REMARQUE: La préparation de microcristaux sur des grilles cryoTEM est mieux évaluée avec une microscopie électronique à balayage (MEB) dans des conditions cryogéniques, ce qui peut être réalisé avec un SEM équipé d’un cryo-étage. Chez VMXm, un JEOL JSM-IT100 SEM (source de tungstène) avec un sas Quorum PP3006 et un cryostage sont utilisés. Pour garantir un minimum de dommages causés par le rayonnement lors de la visualisation d’échantillons sur VMXm28,29, les paramètres suivants sont utilisés: tension d’accélération de 5 kV; une taille de spot de 40 (unités arbitraires sur le JEOL JSM-IT100); Distance de travail de 10 mm. Les images sont enregistrées à l’aide du détecteur d’électrons secondaires, pour l’alignement de l’échantillon et la focalisation, un temps de séjour de 0,8 μs est utilisé, tandis que des images haute résolution de monocrisques sont capturées en utilisant un temps de séjour de 16 μs. Avant de charger un échantillon dans le MEB, il est important que le microscope soit aligné conformément aux instructions du fabricant. Il est conseillé qu’une seule grille soit chargée dans le SEM tandis que toutes les grilles restantes préparées avec les mêmes paramètres sont réservées aux expériences de diffraction des rayons X. Préparez le MEB en refroidissant l’étage cryogénique de l’échantillon à -180 °C conformément aux instructions du fabricant. Suivez les instructions pour charger les grilles cryoTEM dans le système spécifique disponible. Une fois l’échantillon chargé dans le MEB, allumez le faisceau d’électrons, alignez l’échantillon et réglez la mise au point en utilisant un grossissement élevé (temps de séjour de 0,8 μs). Tout d’abord, effectuez l’évaluation initiale avec l’ensemble de la grille en vue à faible grossissement (x45). Enregistrez une image à ce grossissement. Augmentez le grossissement pour permettre une inspection plus approfondie des carrés de grille individuels, les cristaux individuels doivent être très clairement observables. Déplacez-vous autour de la grille, en capturant des images fixes (temps de séjour de 16 μs) des cristaux en vous assurant qu’ils répondent aux exigences suivantes avant de continuer: Assurez-vous que les grilles sont plates et que le film de support en carbone est en grande partie intact. Assurez-vous qu’il y a de nombreux monocrisaux avec un halo étroit de liquide vitrifié entourant le cristal. Assurez-vous que les trous dans le film de support en carbone sont visibles. Assurez-vous qu’il n’y a pas de grandes régions de liquide vitrifié telles que définies par un aspect sombre et lisse. Assurez-vous qu’il y a peu ou pas de glace hexagonale ou de glace de surface dispersée sur la grille. Assurez-vous que les cristaux sont répartis uniformément sur le film de support et ne se chevauchent pas. À ce stade, mesurez avec précision les dimensions d’un certain nombre de cristaux pour permettre une corrélation précise de la taille du faisceau de rayons X lors d’expériences de diffraction ultérieures. Les échantillons qui peuvent être récupérés de manière fiable du MEB et maintenus à des températures cryogéniques peuvent être utilisés plus tard pour des expériences de diffraction des rayons X. Si cela n’est pas possible, jetez ces échantillons.REMARQUE: Lors de l’imagerie de la grille entière et des microcristaux individuels (grossissement d’environ x45 et x700 respectivement), une évaluation doit être faite pour savoir s’il faut passer à la ligne de faisceau avec des grilles préparées en utilisant les mêmes paramètres ou si certains paramètres peuvent nécessiter un ajustement au cours de l’étape 3. Les grilles doivent satisfaire aux tests décrits à l’étape 5.5. Si les grilles ne répondent pas à ces critères, une optimisation supplémentaire au cours de l’étape 3 est nécessaire avant de répéter l’étape 5. 6. Préparation de la grille pour les expériences de diffraction chez VMXm Refroidir le nombre requis de porte-échantillons VMXm(Figure 4A)(jusqu’à 5) chargés dans la cartouche d’échantillon (avec couvercle) avec le chargeur d’échantillons dans un grand dewar en mousse(Figure 4B)en utilisant de l’azote liquide – cela peut nécessiter un grand volume d’azote liquide. Le niveau d’azote liquide doit être juste au-dessus de la position de l’échantillon sur le chargeur d’échantillons. Préparez des cercles et des outils. Placez les outils, y compris l’outil d’écrêtage, les pinces et les pinces d’échantillon VMXm, dans des trous dans le chargeur d’échantillons pour refroidir. Il peut être utile d’organiser un projecteur au-dessus du dewar. Transférez rapidement la boîte de grille contenant les grilles chargées en microcristal dans l’encastrement de la boîte de grille sur le chargeur d’échantillon et dévissez le couvercle de manière à ce qu’il soit desserré et rotatif (ne pas retirer). Sous azote liquide, retirez le couvercle de la cartouche d’échantillon avec une grande pince et placez-le sous le chargeur d’échantillons. Utilisez les pinces d’échantillonnage VMXm pour soulever le porte-échantillon sur le chargeur d’échantillons, en vous assurant que le support est orienté vers le haut afin qu’il puisse accepter une grille. Lorsqu’elle est dans la bonne position, une petite broche sur le chargeur d’échantillons s’engagera avec le petit trou au milieu du porte-échantillon. Avec les pinces fines refroidies, soulevez soigneusement la grille de la boîte de grille et transférez-la près de l’ouverture de la grille sur le porte-échantillon. Faites pivoter la grille pour qu’elle repose à plat (peu importe la façon dont le côté du film de support est orienté). Abaissez doucement les pinces pour que la grille soit aussi proche que possible au-dessus de l’ouverture de la grille (veillez à ne pas plier la grille) et relâchez la grille dans l’ouverture. Si la grille ne s’é place pas correctement, utilisez soigneusement les pinces fines pour pousser la grille en position ou tapotez doucement le porte-échantillon avec les pinces plus grandes. Placez rapidement l’outil circlip pré-refroidi sur la grille dans l’ouverture de la grille et asseyez le circlip en appuyant sur le bouton. Il peut être utile d’appliquer 2 dépressions du bouton pour s’assurer que le circlip est correctement assis. Rechargez l’azote liquide de sorte que le niveau soit d’environ 1,5 cm au-dessus du porte-échantillon. À l’aide de la pince d’échantillon VMXm, soulevez délicatement le porte-échantillon chargé vers le haut et au-dessus de la petite broche du chargeur d’échantillon et de nouveau dans la cartouche d’échantillon. Notez le numéro de position du porte-échantillon dans la cartouche d’échantillon. Continuez à charger les grilles dans les porte-échantillons jusqu’à ce que tous les échantillons soient chargés. Retournez les boîtes de grille dans le dewar de stockage si les échantillons restent à l’intérieur et retirez le chargeur d’échantillons du dewar pour créer plus d’espace. Remplacez le couvercle de la cartouche par le couvercle de la cartouche en vous assurant que la broche sur le dessus de la cartouche s’engage avec le trou dans le couvercle. Refroidir et remplir le sas VMXm dewar avec de l’azote liquide et placer à côté du dewar en mousse contenant la cartouche d’échantillon chargée. À l’aide de l’outil de cartouche VMXm, engagez soigneusement l’outil dans les crêtes sur le côté de la cartouche et soulevez rapidement la cartouche dans le sas dewar. Assurez-vous que le niveau d’azote liquide recouvre la cartouche. Placez le couvercle sur le sas dewar et dirigez-vous vers la station d’extrémité VMXm avec la cartouche d’échantillon chargée.REMARQUE: Le chargement de la cartouche d’échantillon dans la station d’extrémité VMXm sera effectué par le personnel de la ligne de faisceau.

Representative Results

L’objectif de ce protocole est d’obtenir des microcristaux vitrifiés avec un volume minimal de liquide entourant le cristal qui permettent des expériences de diffraction des rayons X avec une diffusion de fond minimale pour améliorer le signal de diffraction. Des exemples d’images SEM de microcristaux préparés sur des grilles cryoTEM pour une dispersion minimale de fond sont présentés dans les figures 1A, B et 2. Les grilles avec des monocrissaux répartis uniformément fourniront l’utilisation la plus efficace de la grille, avec un bon signal-bruit. Cependant, cela n’est généralement pas possible sur l’ensemble de la grille et certaines régions peuvent afficher une certaine quantité d’agglutination(Figure 2A, B). Malgré cet agglutination, ces exemples affichent toujours un nombre utile de cristaux isolés uniques qui fourniront une faible diffraction de fond(Figure 5). Le niveau de buvard qui maintient toujours une faible dispersion de fond peut varier. Un fort buvard tel que les trous dans le film de support en carbone soient clairement visibles mais que les cristaux restent hydratés est l’objectif(Figure 2C,D). Cependant, les grilles de bonne qualité peuvent toujours afficher un peu de liquide dans les trous du film de support, bien que la position des trous doive toujours être identifiable (Figure 2A, B). Il est important de se rendre à l’évidence que tous ces exemples montrent des cristaux uniques et isolés avec un halo vitrifié de liquide entourant le cristal pour maintenir l’hydratation entre le buvard et le gel plongeant. De nombreux échantillons peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire(Figure 3),ce qui peut inclure une variation du temps de buvard ou de la concentration des microcristaux. Les grilles surchargées de cristaux démontreront une efficacité de transfert réduite et peuvent entraîner l’enregistrement de plusieurs réseaux dans des images à diffraction unique(Figure 3A, B). Des conditions de cristallisation plus visqueuses, comme celle de la trypsine qui contient 8 % de PEG 4000 et 15 % d’éthylène glycol(Figure 3C),peuvent entraîner la nécessité de temps de transfert plus longs (>10 s). Inversement, les conditions de cristallisation à très faible viscosité qui se tachent très rapidement, peuvent souffrir de problèmes de distribution dus à la gravité provoquant un tassement avant que le buvard ne se produise, entraînant la sédimentation de tous les microcristaux le long d’un côté de la grille (Figure 3D). La préparation optimale des échantillons permet d’exploiter toutes les capacités de VMXm pour collecter des données de diffraction des rayons X de haute qualité à la résolution la plus élevée possible avec un rapport signal-bruit élevé(Figure 5). Ces échantillons bénéficient d’être compatibles avec l’environnement d’échantillon in-vacuo, ce qui se traduit par un nombre d’arrière-plan moyen très faible ou nul dans les images de diffraction. L’utilisation d’éthane liquide, sans cryo-protection, entraîne une absence d’anneaux de glace(Figure 5),bien que là où les cristaux se trouvent près des barres de grille de cuivre, le faisceau de rayons X peut regarder les barres, ce qui donne des anneaux de diffraction de poudre de cuivre à ~ 2,1 Å et ~ 1,8 Å. Figure 1: Comparaison du montage de microcristaux sur des supports micromesh et des grilles cyoTEM. Micrographies électroniques à balayage de microcristaux gelés de polyédriques de virus mesurant 2,5 μm de tension d’accélération(A, B)de 5 kV, une taille de point de 39 (unités arbitraires) et un temps de séjour de 16 μs. La grille est exempte d’excès de liquide (A), un halo étroit de liquide est observé autour des cristaux (B). Les mêmes échantillons montés sur un micromesh (ouvertures de 20 μm) avant refroidissement flash dans de l’azote liquide et observés à l’aide du système de visualisation sur axe à la ligne de faisceau I24 face à face (C) et latéralement (D). Les distorsions optiques (C) lors de la visualisation de face donnent une indication de l’étendue de l’épaisseur du liquide à travers le micromesh, ce qui est plus clair lors de la visualisation du micromesh de côté (D). La cible rouge en C et D représente la position et la taille du faisceau de rayons X. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2: Exemples d’échantillons de bonne qualité. Cristaux de polyèdres (A) observés sur un seul carré de grille d’environ 100 μm. Alors que certains des cristaux sont légèrement agglomérés et montrent une certaine connectivité du liquide environnant, il existe un certain nombre de monocrismes isolés avec un petit halo de liquide entourant le cristal. Des cristaux d’insuline légèrement plus gros(B)mesurant ~ 5 x 5 μm montrent également un certain agglutination, mais encore une fois, il existe des cristaux individuels bien isolés. Les cristaux d’aiguille peuvent avoir une dimension très étroite et nécessiter un microfaisceau, comme ces cristaux de lysozyme en forme d’aiguille (C). Une bande étroite de liquide peut être vue autour de ces cristaux (halo gris clair). Des microcristaux plus grands jusqu’à des dizaines de microns peuvent également être bien montés sur des grilles cryoTEM, telles que ces cristaux K de protéinase ~7 μm (D). Dans les deux (C) et (D) et dans une moindre mesure dans (A), les trous du film de support en carbone sont clairement visibles, démontrant la présence de très peu/pas de liquide. Dans l’exemple B, bien qu’aucun trou vide ne soit observé, la position des trous peut toujours être identifiée, ce qui indique que le liquide ne remplit que les trous du film de support. Dans tous ces exemples, un halo de liquide peut être vu autour du bord du carré de la grille (un carré intérieur arrondi), où les trous ont un aspect gris plus clair. C’est une caractéristique commune des grilles bien préparées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3: Exemples d’échantillons nécessitant une optimisation supplémentaire. Les grilles surchargées de microcristaux(A, B)peuvent augmenter la dispersion de fond car les échantillons bloquent les trous dans le film de support, ce qui réduit l’efficacité du buvard, et avec une tension superficielle plus élevée entre les cristaux, il reste plus de liquide. En plus d’une dégradation du rapport signal-bruit entraînant une perte d’information, il est probable que plusieurs réseaux seront enregistrés. L’utilisation d’un temps de buvardage qui n’est pas assez long, ou d’une solution de cristallisation très visqueuse peut entraîner un échantillon trop humide(C),produisant également un faible rapport signal-bruit. Les conditions de cristallisation sans précipités, comme celles de l’insuline bovine(D),ont une très faible viscosité. Bien que cela se traduise par un temps de buvardage très court, il peut également en résulter le mouvement des cristaux à travers la grille avant et pendant le buvard en raison des effets de la gravité. Il en résulte généralement une grille largement vide avec une forte concentration de cristaux le long d’un bord (D). Il peut être avantageux d’ajouter un agent visqueux tel que l’éthylène glycol à la boue cristalline peu de temps avant de les appliquer sur la grille pour réduire le flux cristallin et améliorer la distribution des cristaux. Cela peut également allonger le temps d’éponge, ce qui facilite l’observation de l’éponge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4: Outils de chargement d’échantillons sur VMXm. Un ensemble d’outils sur mesure a été conçu pour charger les porte-échantillons VMXm (A). Le chargeur d’échantillons (B) dispose d’un espace pour un seul porte-échantillon VMXm, une boîte de grille et un stockage d’outils pendant le travail. Il est également conçu pour permettre de travailler juste en dessous de la surface de l’azote liquide et permettre à la cartouche d’échantillon de tenir en dessous (B). Le sas dewar (C), qui s’adapte à la boîte d’azote gazeux du sas sur la station d’extrémité VMXm, est utilisé pour prélever la cartouche d’échantillon chargée du laboratoire au clapier expérimental de la ligne de faisceau. Pour visualiser les échantillons dans le SEM hors ligne, une navette sur mesure(D)comprenant le porte-échantillon VMXm sans base a été réalisée pour permettre l’évaluation dans le porte-échantillon utilisé sur la ligne de faisceau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5: Exemple de diffraction à partir de microcristaux à VMXm. Image de diffraction unique enregistrée à l’aide d’un détecteur Pilatus 3 6M à VMXm d’un cristal polyédrique de virus d’environ 3 μm monté sur une grille cryoTEM en utilisant la méthode de congélation par plongeon. La diffraction est observée au-delà de 1,7 Å et une réflexion (carré bleu) à 1,74 Å est insérée, démontrant la faible dispersion de fond, avec un nombre élevé de pixels avec zéro compte. L’éthylène glycol à une concentration finale de 50 % v/v a été ajouté à la boue cristalline avant de l’appliquer sur la grille. La faible nature d’arrière-plan de la position de l’échantillon VMXm est démontrée par l’arrière-plan constant sur l’image, comme le montrent les intensités tracées sous la ligne pointillée bleue, même près du centre du faisceau. Les intensités tracées montrent que l’arrière-plan reste inférieur à 3 comptes. Deux anneaux faibles sont observés à 2,15 Å et 1,86 Å qui sont générés par la diffraction de poudre du cuivre de la grille cryoTEM. Il n’y a pas d’anneaux de glace détectables, ce qui démontre l’efficacité du buvard suivi d’un refroidissement avec de l’éthane liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole montre comment les outils de préparation d’échantillons cryoTEM peuvent être utilisés pour la préparation de microcristaux pour des expériences de diffraction des rayons X sur des lignes de faisceau de microfocus. L’instrumentation standard de la ligne de faisceau est centrée autour d’un échantillon monté sur broche et, bien que des efforts aient été déployés pour fournir un support d’échantillon sur ces supports pour les microcristaux, ils sont souvent difficiles à charger avec l’échantillon tout en garantissant que le signal au bruit le plus élevé est atteint(Figure 1C, D). Bon nombre de ces échantillons peuvent également nécessiter une optimisation des conditions de cryoprotection pour s’assurer que l’échantillon est vitré. La méthode de congélation par plongée fournit un moyen reproductible d’éliminer l’excès de liquide et de refroidir l’échantillon par flash dans un cryogène efficace(Figure 1A, B). Alors que la grille peut ensuite être montée sur une ligne de faisceau standard avec un support à broches à base de pince, les porte-échantillons VMXm ont été spécialement conçus pour accepter les grilles et les maintenir en dessous de la température de transition vitreuse dans un environnement sous vide via un refroidissement conducteur. L’environnement d’échantillonnage de VMXm permet une collecte de données d’arrière-plan faible, où l’échantillon est la source restante d’arrière-plan, et fournit un microfaisme qui peut être utilisé pour faire correspondre des cristaux de dimensions inférieures à 10 μm. Cette méthode de préparation d’échantillons peut également être utilisée pour préparer des nanocristaux à la diffraction des électrons où il est également nécessaire de très peu de liquide en excès et un échantillon vitré en raison de la faible pénétration des électrons. Alors que les grilles cryoTEM sont fragiles, celles expérimentées dans la récolte des cristaux en boucles s’adapteront rapidement à la manipulation des grilles. Avec un peu d’expérience, peu de grilles seront perdues pendant les étapes de buvardage, de congélation et de chargement du protocole. Les étapes d’optimisation sont cependant essentielles à ce succès et une préparation minutieuse réduira les risques de perte de cristaux ou de réduction de l’intégrité des cristaux.

Les grilles CryoTEM fournissent un support unique relativement grand qui peut contenir plusieurs centaines de cristaux, améliorant ainsi le débit où il n’est possible d’enregistrer qu’un petit coin de données de diffraction. Une seule grille peut également fournir suffisamment de cristaux pour déterminer la structure des protéines, en particulier dans les cristaux de haute symétrie. Lorsqu’une ou deux gouttes de monocristallisation seulement ont généré des microcristaux, l’essai de transfert de la condition de cristallisation seul peut aider à s’assurer que lorsque les microcristaux sont effacés, les temps utilisés sont aussi proches que possible de ceux nécessaires pour générer des échantillons initiaux de bonne qualité. Les supports en film de carbone sont invisibles aux rayons X et sont disponibles avec différents espacements de trous, qui peuvent être utilisés pour s’adapter à une morphologie particulière. Nous utilisons le plus souvent des films de support avec des trous de 2 μm à un espacement de 2 μm, mais des trous plus petits avec un espacement plus important peuvent être plus appropriés pour les cristaux inférieurs à 2 μm. D’autres films de support tels que ceux avec des trous de 1 μm avec un espacement de 4 μm ainsi que des films de support avec des trous de forme différente sont disponibles, ce qui affectera le temps de buvard. Un maillage carré de grille de 200 (200 carrés par pouce) fournit également suffisamment d’espace (~ 100 μm) entre les barres de grille en cuivre pour que le faisceau de rayons X n’interagisse pas fortement avec le cuivre tout en fournissant un support structurel suffisant pour le film de carbone chargé de cristaux. L’utilisation d’éthane liquide annule le besoin de cryoprotecteurs, ce qui réduit à son tour les besoins en volume d’échantillon qui auraient été utilisés dans l’optimisation des conditions de cryoprotection.

Les principaux paramètres à optimiser au cours du processus sont les temps de buvardage et la dilution de l’échantillon. Les temps de buvardage doivent être suffisamment longs pour observer l’effet de « popping » sur l’ensemble de la grille avant de geler. Un sur-buvardage pourrait entraîner la déshydratation des cristaux, cependant, le contrôle de l’humidité dans la chambre d’échantillonnage est utilisé pour minimiser cet effet. Bien qu’il soit suggéré qu’une humidité relative de 90% est utilisée, certains échantillons peuvent bénéficier de l’optimisation de l’humidité. L’humidité peut affecter l’efficacité du buvard du papier buvard qui peut lentement devenir saturé d’eau. De plus, le contrôle de l’humidité dans la chambre d’échantillonnage pourrait être utilisé pour améliorer la qualité de diffraction des cristaux30. Il est recommandé d’apporter de petits changements (<5 %) à l’humidité avant de vérifier l’intégrité de la diffraction pour s’assurer que la qualité de la diffraction n’est pas dégradée.

L’optimisation des échantillons non précieux peut être réalisée à l’aide d’un microscope optique à la place d’un MEB. Bien que destructeur, il est utile pour évaluer la densité des cristaux à travers la grille et pour permettre la prise de décision sur la question de savoir si un échantillon doit être dilué ou concentré pour mieux disperser les cristaux à travers la grille. Cette étape est particulièrement utile lorsqu’il y a un grand nombre de cristaux disponibles et des échantillons particulièrement concentrés. L’agglutination des cristaux doit être évitée (Figure 3), car bien que ce ne soit pas un problème important si deux cristaux sont éclairés en même temps pendant la collecte de données6, il y aura probablement un plus grand volume de liquide entourant l’amas, réduisant ainsi le signal au bruit (Figure 5). Bien qu’il soit possible d’observer de grands excès de liquide à l’échelle mondiale à travers la grille à l’aide d’un microscope optique, l’évaluation du volume de liquide entourant les microcristaux et de la présence de glace cristalline ne peut être effectuée qu’à l’aide d’un microscope électronique équipé d’un système et d’un étage de transfert sous vide cryogénique. Parfois, après l’application des cristaux sur la grille et avant que le buvard ne se produise, des cristaux dans des solutions à faible viscosité peuvent se déposer le long d’un bord de la grille. Nous avons constaté que l’addition d’une concentration finale de 50% d’éthylène glycol peut ralentir le mouvement des cristaux à travers la gouttelette, assurant une meilleure distribution des microcristaux à travers la grille et offrant un meilleur contrôle sur le buvard en augmentant le temps de transfert(Figure 3D).

Certaines solutions de cristallisation contenant des agents précipitants visqueux tels que les EIG de haut poids moléculaire peuvent s’avérer difficiles à éponger, nécessitant des temps de transfert de plus en plus longs (>10 s). Dans de tels cas, il peut être utile de réduire le volume de liquide déposé à l’arrière de la grille ainsi que le volume de la solution contenant le cristal du côté du film de support de la grille. Des stratégies telles que l’utilisation de 2 couches de papier buvard ou de fibres de verre peuvent également aider à éponger dans ces cas difficiles31.

Bien que ce pipeline soit adapté aux cristaux de protéines solubles, ceux qui se forment dans des milieux très visqueux tels que les protéines membranaires dans le LCP présentent un défi différent pour lequel ce protocole n’est pas adapté. Cependant, des stratégies émergent pour préparer des cristaux LCP sur des grilles cryoTEM pour la microED, notamment la réduction de la viscosité des échantillons en induisant un changement de phase du LCP. Cela permet d’appliquer les échantillons aux grilles de la même manière que celle décrite dans cet article. Enfin, l’échantillon peut être fraisé avec un faisceau d’ions focalisé pour éliminer l’excès de matière non cristalline32,33,34.

Dans l’ensemble, ce pipeline prendra généralement 1 à 2 h (y compris le temps de configuration de l’équipement) à suivre de l’échantillon arrivant à VMXm pour fournir des grilles optimisées avec des échantillons bien dispersés et vitrifiés, en fonction de la disponibilité de l’échantillon, de la concentration de cristaux et de la viscosité de la solution de cristallisation. Ces méthodes ont déjà été utilisées avec succès pour la préparation de microcristaux pour des expériences de diffraction des rayons X explorant les dommages causés par les rayonnements sur les microcristaux où un volume minimal de liquide entourant l’échantillon était essentiel28,35. Il convient de noter que le protocole peut être appliqué à tous les échantillons de microcristaux solubles, et pas seulement aux échantillons bien diffractants qui ont déjà été optimisés. Une expérience de cristallisation qui produit du matériel microcristallin serait traditionnellement une cible d’optimisation dans le but d’obtenir des cristaux plus gros, cependant, cette méthode de préparation d’échantillons et les capacités de VMXm peuvent permettre de collecter des données adéquates à partir de ces échantillons sans autre optimisation. Alternativement, si ces échantillons microcristallins diffractent mal, les données recueillies à partir de VMXm en utilisant cette méthode de préparation d’échantillons pourraient toujours servir de guide utile pour une optimisation plus poussée des conditions de cristallisation. Les outils de préparation des grilles, y compris le déchargement de lueur et la congélation par plongeon, sont maintenant largement disponibles dans les instituts de recherche équipés pour les expériences cryoTEM et seront disponibles pour de nombreux utilisateurs leur permettant de préparer des échantillons avant le temps de faisceau à VMXm.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton et Dave Stuart, STRUBI University of Oxford et Rachel Bolton, University of Southampton, pour avoir aimablement fourni des échantillons de microcristaux pour le développement et la démonstration de méthodes de préparation d’échantillons pour la ligne de faisceau VMXm en plus de permettre la mise en service de la ligne de faisceau. Les auteurs tiennent également à remercier iNEXT-Discovery (numéro de projet 871037) pour l’opportunité et le soutien qu’ils ont apporté à la publication de ce manuscrit.

Materials

Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440
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Riferimenti

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).
  15. . MiTeGen Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020)
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

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Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).
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