Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.
Abstract
Las terapias celulares adoptivas que utilizan células T receptoras de antígeno quimérico (células CAR-T) han demostrado una eficacia clínica notable en pacientes con neoplasias hematológicas malignas y actualmente se están investigando para varios tumores sólidos. Las células CAR-T se generan mediante la eliminación de células T de la sangre de un paciente y su ingeniería para expresar un receptor inmune sintético que redirige las células T para reconocer y eliminar las células tumorales objetivo. La edición génica de las células CAR-T tiene el potencial de mejorar la seguridad de las terapias actuales de células CAR-T y aumentar aún más la eficacia de las células CAR-T. Aquí, describimos métodos para la activación, expansión y caracterización de células CAR-T dirigidas por CD19 dirigidas por CRISPR humanos. Esto comprende la transducción del vector lentiviral CAR y el uso de ARN guía único (sgRNA) y endonucleasa Cas9 para dirigirse a genes de interés en las células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar universalmente a otras construcciones CAR y genes diana más allá de los utilizados para este estudio. Además, este protocolo discute estrategias para el diseño de ARNg, la selección de ARNg principal y la validación de knockout de genes objetivo para lograr de manera reproducible una ingeniería CRISPR-Cas9 multiplex de alta eficiencia de células T humanas de grado clínico.
Introduction
La terapia con receptores de antígenos quiméricos (CAR)-células T ha revolucionado el campo de las terapias celulares adoptivas y la inmunoterapia contra el cáncer. Las células CAR-T son células T modificadas que expresan un receptor inmune sintético que combina un fragmento de anticuerpo de cadena única específico del antígeno con dominios de señalización derivados de la cadena TCRzeta y dominios coestimuladores necesarios y suficientes para la activación y coestimulación de las células T1,2,3,4 . La fabricación de células CAR-T comienza por la extracción de las propias células T del paciente, seguida de la transducción viral ex vivo del módulo CAR y la expansión del producto de células CAR-T con perlas magnéticas que funcionan como células presentadoras de antígenos artificiales5. Las células CAR-T expandidas se vuelven a infundir en el paciente donde pueden injertarse, eliminar las células tumorales diana e incluso persistir durante varios años después de la infusión6,7,8. Aunque la terapia con células CAR-T ha dado lugar a tasas de respuesta notables en neoplasias malignas de células B, el éxito clínico de los tumores sólidos ha sido desafiado por múltiples factores, incluida la mala infiltración de células T9,un microambiente tumoral inmunosupresor10,cobertura y especificidad de antígenos, y disfunción de células CAR-T11,12 . Otra limitación de la terapia actual de células CAR-T incluye el uso de células T autólogas. Después de múltiples rondas de quimioterapia y una alta carga tumoral, las células CAR-T pueden ser de mala calidad en comparación con los productos CAR-T alogénicos de donantes sanos, además del tiempo y los gastos asociados con la fabricación de células CAR-T autólogas. La edición genética del producto de células CAR-T por CRISPR/Cas9 representa una nueva estrategia para superar las limitaciones actuales de las células CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 es un sistema de dos componentes que se puede utilizar para la edición dirigida del genoma en células de mamíferos18,19. La endonucleasa asociada a CRISPR Cas9 puede inducir roturas de doble cadena específicas del sitio guiadas por pequeños ARN a través del emparejamiento de bases con la secuencia de ADN objetivo20. En ausencia de una plantilla de reparación, las roturas de doble hebra se reparan mediante la vía de unión final no homóloga propensa a errores (NHEJ), lo que resulta en mutaciones de desplazamiento de marco o codones de parada prematuros a través de mutaciones de inserción y deleción (INDELs)19,20,21. La eficiencia, la facilidad de uso, la rentabilidad y la capacidad de edición del genoma multiplex hacen de CRISPR/Cas9 una poderosa herramienta para mejorar la eficacia y seguridad de las células CAR-T autólogas y alogénicas. Este enfoque también se puede utilizar para editar células T dirigidas por TCR reemplazando la construcción CAR con una TCR. Además, las células CAR-T alogénicas que tienen un potencial limitado para causar la enfermedad de injerto contra huésped también se pueden generar mediante la edición de genes del locus TCR, b2m y HLA.
En este protocolo, mostramos cómo la ingeniería CRISPR de las células T se puede combinar con la entrega mediada por vectores virales del CAR-Transgene para generar productos de células CAR-T editadas por el genoma con mayor eficacia y seguridad. Un diagrama esquemático de todo el proceso se muestra en la Figura 1. Utilizando este enfoque, hemos demostrado la eliminación de genes de alta eficiencia en células CAR-T humanas primarias. La Figura 2A describe en detalle la línea de tiempo de cada paso para editar y fabricar células T. También se discuten estrategias para el diseño de ARN guía y la validación eliminación para aplicar este enfoque a varios genes objetivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos enfoques para editar genes de células CAR-T utilizando la tecnología CRISPR Cas9 y fabricar productos para probar aún más su función y eficacia. El protocolo anterior se ha optimizado para realizar la edición de genes CRIPSR en células T humanas primarias combinadas con células T de ingeniería con receptores de antígenos quiméricos. Este protocolo permite una alta eficiencia de knockout con una variabilidad mínima de donante a donante. La modificación utilizando CRISPR puede mejorar tanto l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos al Núcleo de Inmunología Humana por proporcionar células T de donantes normales y al Núcleo de Citometría de Flujo en la Universidad de Pensilvania.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Riferimenti
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