Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton
Summary
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung von Spotiton, einem neuartigen Robotersystem, um zwei interessante Proben auf ein selbstableitendes Nanodrahtgitter zu liefern, das sich vor der Vitrifikation in flüssigem Kryogen mindestens 90 ms vermischt.
Abstract
Die Erfassung kurzlebiger molekularer Zustände, die durch die frühe Begegnung von zwei oder mehr wechselwirkenden Teilchen ausgelöst werden, ist nach wie vor eine experimentelle Herausforderung von großem Interesse für das Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM). Es wurden einige methodische Strategien entwickelt, die diese “zeitaufgelösten” Studien unterstützen, von denen eine, Spotiton – ein neuartiges Robotersystem – die Dosierung von Probentröpfchen in Pikolitergröße mit präziser zeitlicher und räumlicher Kontrolle kombiniert. Der zeitaufgelöste Spotiton-Workflow bietet einen einzigartig effizienten Ansatz, um frühe strukturelle Umlagerungen aus minimalem Probenvolumen abzufragen. Von unabhängig kontrollierten piezoelektrischen Spendern abgefeuert, landen zwei Proben und mischen sich schnell auf einem Nanodraht-EM-Gitter, während es in Richtung des Kryogens stürzt. Potenziell können Hunderte von Gittern in schneller Folge aus nur wenigen Mikrolitern einer Probe hergestellt werden. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll des Betriebs des Spotiton-Systems vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Behebung spezifischer Probleme liegt, die während der Netzvorbereitung auftreten.
Introduction
Das Potenzial für Kryo-EM, transiente Konformationszustände von Proteinen auf der Zeitskala unter einer Sekunde (zeitaufgelöste Kryo-EM) zu erfassen und aufzudecken, wurde von mehreren Gruppen realisiert, beginnend mit Berriman und Unwin1, deren Technik auf der von Dubochet entwickelten Standard-Tauchgefriermethode zur Herstellung von Kryo-EM-Gittern2aufbaute. Sie fügten einen Zerstäuber direkt über dem Kryogenbecher hinzu, der komprimiertes Stickstoffgas verwendete, um einen feinen Nebel einer zweiten Probe auf ein eintauchendes EM-Gitter zu sprühen, das eine erste Probe enthielt, die aufgetragen und auf eine dünne wässrige Schicht gelöscht worden war. Obwohl dieses System Mischzeiten von nur 1 ms erreichen konnte, erforderte es dennoch das manuelle Löschen der ersten Probe durch den Benutzer – eine technisch anspruchsvolle Aufgabe – und ein relativ hohes Volumen der zweiten Probe. Darüber hinaus war es in der Praxis schwierig zu wissen, wo eine Vermischung der beiden Proben stattgefunden hatte, was die Verwendung von Ferritin-Nanopartikeln als treuhänderischen Marker in der gemischten Probe erforderte. Nachfolgende Bemühungen von Howard White und Mitarbeitern verbesserten die Kontrolle und Reproduzierbarkeit dieses Sprüh-Misch-Ansatzes durch die Einbeziehung der Computersteuerung der Lösch- undSprühschritte 3,4. Um zu untersuchen, wie gut und wo sich die Proben mischen, sind die gleiche Gruppe5 und andere6,7,8,9,10 zu einem Misch-Sprühansatz11 übergegangen, bei dem zwei Proben entweder in schmalen Kapillarröhrchen unter dem Druck von Spritzenpumpen oder in mikrofabrizierten, mikrofluidischen Chips, die mit Stickstoffgas angetrieben werden, gemischt werden. Diese Vormischsysteme sorgen nicht nur für eine vollständige Durchmischung, sondern ermöglichen auch die Feinabstimmung der Mischzeiten, um die Auflösung zeitaufgelöser Studien zu erhöhen.
Die Einführung piezoelektrischer Dispenser als alternative Möglichkeit, Proben auf EM-Gitter im Spotiton-System aufzutragen, ermöglichte sowohl das präzise Targeting der Probenabscheidung als auch die Anforderung eines viel kleineren Probenvolumens, um ein Gitter12herzustellen. Später entfallen durch die Verwendung von Nanodrahtgittern und die Anwendung von Proben auf dem Weg (“On-the-fly” Spotting) die Notwendigkeit eines Löschschritts und die Anwendungs-zu-Vitrifizierungszeiten13,14. Für den hier beschriebenen neuen Ansatz zur zeitaufgelösten Kryo-EM wurde dem Spotiton-System ein zweiter Dispenser sowie die notwendigen Steuerungshardware- und Software-Upgrades hinzugefügt, um die Lieferung einer zweiten Probe auf ein sich bewegendes Nanodrahtgitter fast unmittelbar nach der Abscheidung der ersten15zu ermöglichen. Die beiden überlappenden Proben vermischen sich auf dem Gitter, da sie vor der Vitrifikation von den Nanodrähten zu einer dünnen wässrigen Schicht geleitet werden. Mischzeiten von bis zu 90 ms können erreicht werden. Dieses Protokoll soll praktische Informationen darüber liefern, wie zeitaufgelöste Experimente mit piezoelektrischen Dosier- und Nanodrahtgittern durchgeführt werden können. Da die Hardware und Software modifiziert werden, um benutzerfreundliche, Konsistenz und Durchsatz zu verbessern, dient dieses Protokoll auch als aktuelle Beschreibung der zuvor gemeldeten Methode15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Spotiton-Robotersystems zur Vorbereitung von Gittern für die Kryo-EM-Bildgebung, die zwei Proben tragen, im Allgemeinen ein Protein von Interesse und einen aktivierenden Liganden, die für 90-500 ms gemischt wurden. Obwohl der Workflow einfach ist, gibt es einige Überlegungen, die der Benutzer beachten muss, um eine produktive Grid-Making-Sitzung sicherzustellen. Erstens ist es nicht ungewöhnlich, dass eine der piezoelektrischen Spenderspitzen verstopft oder blockiert wird, um das Feuern zu verhindern. Ein solcher Fehler führt zu einem Flüssigkeitsstreifen, der auf Bildaufnahmen der oberen oder unteren Kamera zu sehen ist, der sichtbar schmaler ist als der, der nach dem Abfeuern beider Spitzen zu sehen ist. Eine Blockade könnte durch eine Luftblase in der Spitze entstehen, die die Tröpfchenbildung stört, oder durch eine Proteinprobe, die ausgetrocknet und die schmale Spitzenöffnung versiegelt hat. Obwohl die Aspirierte dabei verloren geht, können beide Probleme durch eine Ultraschallwäsche der Spitzen und eine erneute Atmung der Probe gelöst werden. Um nachfolgende Verstopfungen und Probenabfälle zu vermeiden, ist es wichtig, die Flüssigkeitsleitungen vor der Probenabsaugung gründlich zu grundieren (zu spülen) und eine hohe und konstante Luftfeuchtigkeit in der Kammer und dem Mantel aufrechtzuerhalten. Zusätzlich kann eine Proteinprobe mit einer besonders hohen Konzentration trotz gut erhaltener Luftfeuchtigkeit das Spitzenfeuern beeinflussen. Obwohl eine Erhöhung der Feueramplitude auf der Inspect-Lasche das schwache Brennen aufgrund hoher Proteinkonzentration teilweise ausgleichen kann, verbessert eine Verdünnung der Probe mindestens 1:2 das Spitzenfeuern und vermeidet Verstopfungen.
Zweitens kann es schwierig sein, die ideale Dochtgeschwindigkeit zu erreichen, die erforderlich ist, um Eis mit optimaler Dicke für die angestrebte Mischdauer zu erzeugen. Im Allgemeinen erfordern schnellere Mischzeiten einen schnelleren Docht, langsamere Mischzeiten erfordern einen langsameren Docht. Für das idealerweise böse Gitter ist im oberen Kamerabild ein flüssiger Streifen deutlich erkennbar, während bei der unteren Kamera nur eine sehr leichte Verdickung der Gitterstäbe an der Stelle des Streifens sichtbar bleibt. Langsamer Docht, der durch einen dunklen Streifen auf dem unteren Kamerabild angezeigt wird, hinterlässt im Allgemeinen Eis, das für die Bildgebung zu dick ist. Das Fehlen eines Streifens auf beiden Bildern deutet auf einen schnellen Docht hin, der möglicherweise kein Wasser in den Löchern hinterlassen hat (Abbildung S5). Mehrere Faktoren wie Nanodrahtdichte, Plasmareinigungseinstellungen und -dauer sowie Die Zeit der Exposition gegenüber und die eingestellte Kammerfeuchtigkeit können die Dochtgeschwindigkeit beeinflussen. Ein schlechter (langsamer) Docht kann das Ergebnis einer spärlichen Beschichtung von Nanodrähten auf dem Gitter sein. Durch leichte Verdünnung und Erhöhung der Expositionszeit gegenüber der Nanodrahtlösung16erhöht sich die Dichte und Abdeckung von Nanodrähten auf den Gitterstäben, was eine schnellere Wicking ermöglicht. Wenn die Nanodrahtdichte ausreichend ist, verbessert eine Erhöhung der Wattzahleinstellung oder der Dauer der Plasmareinigung auch den Docht. Die hier empfohlenen Einstellungen sind relativ geringer Stromverbrauch und lange Dauer, können aber bei Bedarf geändert werden.
Wenn jedoch sowohl die spezifische Charge von Gittern als auch die Plasmareinigungseinstellungen in einer früheren Sitzung gut funktioniert haben, kann eine langsame Dochtleistung durch übermäßige Exposition der Nanodrähte gegenüber hoher Luftfeuchtigkeit in der Kammer entstehen, was zu ihrer Sättigung mit Feuchtigkeit und einer verringerten Flüssigkeitshaltekapazität führt. Der gittersättigende Effekt der Kammerfeuchtigkeit kann reduziert werden, indem entweder die verstrichene Zeit zwischen der Pinzettenmontage und dem Gittereintauchen minimiert oder die Systemfeuchtigkeit vor einem Sturz verringert wird. Zu beachten ist allerdings, dass letzteres das damit verbundene Risiko birgt, dass die mit Proteinprobe beladene Spitze verstopft. Um dieses Risiko auszugleichen, kann das Halten der Spitzen in der Hülle, in der eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechterhalten wird, die zulässige Zeit für die Montage einer Pinzette mit einem neuen Gitter erhöhen. Schließlich ist zu beachten, dass eine reduzierte Tauchzeit (erreicht durch Erhöhung der Netzbeschleunigung und / oder der maximalen Geschwindigkeit) zu Gittern mit dünnerem Eis führen kann, ohne die Dochteigenschaften des Gitters tatsächlich zu verändern. Da jedoch auch die Mischzeit der beiden Proben reduziert wird, ist die Tauchzeit kein Faktor, der typischerweise geändert wird, um den langsamen Docht zu beheben. Um zu schnelle Dochte zu beheben, die zu Eis führen, das entweder zu dünn ist oder in den Gitterlöchern fehlt, kann das Gegenteil der oben beschriebenen Maßnahmen ergriffen werden.
Spotiton bietet bestimmte Vor- und Nachteile im Vergleich zu anderen Techniken, die für zeitaufgelöste Studien im Subsekundenbereich entwickelt wurden. Da der gemischte Probenstreifen nur 2-4 nL Flüssigkeit aus jedem Spender enthält, reicht ein einziges Aliquot von 3 μL jeder Probe aus, um viele Gitter vorzubereiten – ein entscheidender Vorteil, wenn die Probe begrenzt ist. Darüber hinaus ist die Beobachtung der Probenablagerung mit integrierten Kameras, obwohl nicht ganz einzigartig für Spotiton17,kein Merkmal anderer Mischgeräte und ermöglicht es, getauchte Gitter einer groben Pass/Fail-Bewertung zu unterziehen, wodurch die Screening-Zeit erheblich verkürzt wird. Ein wesentlicher Nachteil des Systems ist eine minimale Mischzeit von 90 ms, begrenzt durch die physikalischen Einschränkungen der mechanischen Komponenten, die die Abfrage schnellerer biologischer Reaktionen außer Reichweite bringt. Zum Vergleich: Auf bestehenden mikrofluidischen Systemen werden routinemäßig Zeiten von weniger als 10 ms erreicht. Auf dem Spotiton-basierten, kommerziell erhältlichen Chamäleonsystem haben Design- und Konstruktionsverbesserungen die minimale Tauchzeit auf 54 ms reduziert und die Möglichkeit erhöht, dass die Zugabe eines zweiten Spenders schnellere Mischzeiten ermöglichen könnte, als Spotiton derzeit anbieten kann.
Bis heute wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um frühe, kurzlebige molekulare Zustände mit Spotiton zu untersuchen, einschließlich der Montage des 70S-Ribosoms, kalziumgesteuerter Konformationsänderungen in einem Transmembranionenkanal und der Verengung von Dynamin als Reaktion auf die GTP-Hydrolyse15. Seit der Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden mehrere Änderungen in das System integriert, um den Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die Berichterstattung von Spotiton-Grid-Making-Sitzungen zu verbessern. Dazu gehören unter anderem das Zweizonen-, automatische Feuchtigkeitsüberwachungs- und -steuerungssystem, die Experiment-Viewer-Funktion, die Side-by-Side-Spitzeninspektionsfunktion und mehrere kleinere Upgrades der Benutzeroberfläche. Das verbesserte System wird zukünftige Zwei-Proben-Mischexperimente, ähnlich den zuvor berichteten, sowie schnelle Bindungsassays wie zwischen einem niedermolekularen Therapeutikum und seinem Proteinziel oder sogar die Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen besser unterstützen. Während aktuelle und zukünftige zeitaufgelöste Experimente mit zwei interagierenden Partnern sicherlich fortgesetzt werden, könnte die Hinzufügung eines dritten piezoelektrischen Dispensers und der zugehörigen Hardware das Spektrum der möglichen Experimente weiter erweitern. Zum Beispiel könnte die anfängliche Ablagerung eines Reinigungsmittels, gefolgt von dem interessierenden Protein, gefolgt vom interagierenden oder aktivierenden Liganden, alle potenziellen negativen Auswirkungen einer längeren Exposition gegenüber dem Waschmittel beseitigen, die oft notwendig sind, um häufige suboptimale Bildgebungsergebnisse wie bevorzugte Orientierung zu verhindern. Angesichts der bereits veröffentlichten Arbeiten und potenzieller zukünftiger Anwendungen stellt Spotiton ein wichtiges Werkzeug für die Kryo-EM-Community dar, um die Durchführung von zeitaufgelösten Studien im Subsekundenbereich zu erleichtern.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Peter A. Kahn und Terry Rohde von Engineering Arts LLC (Arizona, USA) für das erste Design und die anschließende Entwicklung des Spotiton-Systems. Wir danken den Mitarbeitern des Simons Electron Microscopy Center am New York Structural Biology Center für Hilfe und technische Unterstützung. Die hier vorgestellten Arbeiten wurden an der National Resource for Automated Molecular Microscopy am New York Structural Biology Center durchgeführt, unterstützt durch Zuschüsse des NIH (GM103310) und der Simons Foundation (SF349247).
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Riferimenti
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