Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Cytoskelet eiwit actine is betrokken bij meerdere cellulaire functies, met inbegrip van structurele ondersteuning, cellulair transport, celmotiliteit en deling. Actine komt in evenwicht in twee vormen voor: monomere bolvormige actine (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze actine (F-actine). Snelle veranderingen in de polymerisatiestatus van actine (interconversie tussen de G- en F-vormen) resulteren in snelle filamentassemblage en demontage en liggen ten grondslag aan de regulerende rol in de cellulaire fysiologie. Actine vormt het belangrijkste bestanddeel van de neuronale cytoskeletstructuur en beïnvloedt een breed scala aan neuronale functies^1,2. Opmerkelijk is dat het actinecytoskelet een integraal onderdeel vormt van het structurele platform van de synaptische terminals. Als zodanig is het een belangrijke determinant van synaptische morfogenese en fysiologie en speelt het een fundamentele rol bij de controle van de grootte, het aantal en de morfologie van synapsen^3,4,5. In het bijzonder is dynamische actinepolymerisatie-depolymerisatie een belangrijke determinant van de synaptische remodellering geassocieerd met synaptische plasticiteit die ten grondslag ligt aan het geheugen en leerprocessen. Zowel presynaptische (zoals neurotransmitter release^6,7,8,9,10) als postsynaptische functies (plasticiteit gerelateerde dynamische remodellering^11,12,13,14) vertrouwen kritisch op dynamische veranderingen in de polymerisatiestatus van het actinecytoskelet.

Onder fysiologische omstandigheden worden de F-actinespiegels dynamisch en strak gereguleerd via een multimodaal traject met posttranslationele modificatie^4,15,16 en actinebindende eiwitten (ACP ‘s)^4,17. ABPs kunnen de actinedynamiek op meerdere niveaus beïnvloeden (zoals het initiëren of remmen van polymerisatie, het induceren van filamentvertakking, het afsnijden van filamenten tot kleinere stukken, het bevorderen van depolymerisatie en het beschermen tegen depolymerisatie), en staan op hun beurt onder een strikte modulerende controle die gevoelig is voor verschillende extra- en intracellulaire signalen^18,19,20. Dergelijke regelgevende controles op meerdere niveaus dicteren een strikte regulering van de actinedynamiek in het synaptische cytoskelet, waarbij pre- en postsynaptische aspecten van neuronale fysiologie worden verfijnd, zowel in de basale als activiteitsgeïnduceerde toestanden.

Gezien de belangrijke rol van actine in de neuronale fysiologie, is het niet verwonderlijk dat verschillende studies bewijs hebben geleverd voor veranderingen in de actinedynamiek als kritieke pathogene gebeurtenissen die verband houden met een breed scala aan neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratie, psychologische ziekten en neuroontwikkelingsaandoeningen^{3,21,22,23,24,25,26,27}. Ondanks de schat aan onderzoeksgegevens die wijzen op belangrijke rollen van actine in neuronale fysiologie en pathofysiologie, blijven er echter nog steeds aanzienlijke hiaten in het begrip van actinedynamiek, met name bij het synaptische cytoskelet. Meer onderzoeken zijn nodig om een beter begrip van neuronale actine en de veranderingen ervan onder pathologische omstandigheden te hebben. Een belangrijk aandachtsgebied in deze context is de beoordeling van de actinepolymerisatiestatus. Er zijn westerse blotting-gebaseerde commerciële kits (G-Actin / F-Actin in vivo assay biochemische kit; Cytoskelet SKU BK037^28,29) en zelfgemaakte assays voor de beoordeling van F-actineniveaus⁶. Omdat deze echter biochemische isolatie van F-actine en G-actine vereisen en omdat hun daaropvolgende kwantificering is gebaseerd op immunoblottingprotocollen, kunnen ze tijdrovend zijn. We rapporteren hierin een fluorescentiespectroscopie-gebaseerde assay aangepast aan een eerdere studie³⁰ met wijzigingen die kunnen worden gebruikt om zowel basale niveaus van F-actine te evalueren, als dynamische veranderingen in de assemblage-demontage. Met name hebben we het oorspronkelijke protocol dat monsters vereist die geschikt zijn voor een cuvette van 1 ml efficiënt aangepast aan het huidige 96-put plaatformaat. Het gewijzigde protocol heeft daarom de hoeveelheid weefsel/monster die nodig is voor de test aanzienlijk verminderd. Verder leveren we bewijs dat het protocol niet alleen geschikt is voor homogenaten van hersenweefsel, maar ook voor subcellulaire fracties zoals geïsoleerde synaptische terminals (synafosomen en synaptoneurosomen). Ten slotte kan de test worden gebruikt voor vers ontleed hersenweefsel van knaagdieren en langdurige opgeslagen postmortale menselijke hersenmonsters. Van belang, terwijl de test wordt gepresenteerd in een neuronale context, kan het op passende wijze worden uitgebreid tot andere celtypen en fysiologische processen die ermee verband houden.