Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi
Summary
Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Duyusal sistemler davranışları yönlendirmek için gerekli ipuçlarını toplar, ancak hayvanlar hangi bilgilerin biyolojik olarak ilgili olduğunu deşifre etmelidir. Locomotion, hayvanların çevredeki çevrenin ilgili duyusal ipuçlarından ayrılmaları gereken farklı ipuçları üretir. Örneğin, bir balık yüzdüğünde, vücut dalgalanmalarından oluşan akış, yanal çizgi sistemini oluşturan saç hücrelerinden oluşan mekanoresptif nöromstlar tarafından tespit edilir. Saç hücreleri daha sonra duyusal afferent nöronlar aracılığıyla sensörden beyne sıvı hareket bilgilerini iletir. Eş zamanlı olarak, sensörlü aşırı yüklemeyi önlemek için motor komutunun corollary deşarjı saç hücrelerine aktarılır. Bu nedenle, yanal hat sisteminin hassasiyetini değerlendirirken, locomotion sırasında tahmine dayalı motor sinyallerinin inhibitör etkisinin muhasebesi kritik öneme sahiptir. Zebra balığı larvalarında (döllenme sonrası 4-7 gün) posterior lateral çizgi afferent nöron ve ventral motor kök aktivitesini aynı anda izlemek için birkaç saat sürebilen in vivo elektrofizyolojik bir yaklaşım geliştirdik. Afferent nöronların hücre dışı kayıtları, tek veya birden fazla nörondan aktiviteyi algılayabilen gevşek yama kelepçe tekniği kullanılarak elde edilir. Motor nöron aktivitesini tespit etmek için cam elektrotlarla deriden ventral kök kayıtları yapılır. Deneysel protokolümüz, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlarda duyusal girişteki endojen veya çağrıştırılan değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar.
Introduction
Mekanosensory sistemlerinin afferent nöronları işitme ve denge sırasında saç hücrelerinden beyne bilgi aktarır. Elektrofizyoloji, afferent nöronların hassasiyetini doğrudan kayıtlarla ortaya alabilir. Saç hücrelerinden tüm hücre yamalama zor olsa da, aşağı akış afferent nöronlardan kayıt yapmak daha kolaydır ve kontrollü stimülasyonlara yanıt olarak eylem potansiyellerinin değerlendirilmesine izin verir1,2,3. Saç hücrelerini uyarmak, mekanosensör yapıları değiştiren sapmalarına yol açar, böylece afferent nöronlarda eylem potansiyellerinde (sivri) bir artışı tetikler4,5,6. Dış uyaranların yokluğunda, afferent nöronlar da saç hücrelerinden7,8sonrası afferent post-sinaptik terminallere glutamat sızıntısı nedeniyle kendiliğinden yükselir ve duyarlılığın korunmasına katkıda bulunduğu gösterilmiştir9,10. Afferent aktivitenin yama kelepçesi kaydı, mikrofonikler 11 , 12 veya fonksiyonelkalsiyum görüntüleme13, 14,15 gibi daha düşük zamansal çözünürlüğe sahip teknikler kullanılarak mümkün olmayan saç hücresi hassasiyetinin ve sinyal dinamiklerinin gözlemlenmesine olanak tanır. Aşağıdaki protokol, saç hücresi duyarlılığındaki anlık değişiklikleri ortaya çıkarmak için motor komutlarla eşzamanlı afferent aktivitenin kaydedilmasına izin verecektir.
Zebra balığı (Danio rerio) vücutlarına göre su hareketini tespit etmek için yanal çizgi sistemini oluşturan nöromistiklerde bulunan saç hücrelerini kullanır, bu da navigasyon için gerekli sinir sinyallerine çevrilir16,17,18, avcı kaçınma, av yakalama19,20ve okul21. Su akışı ayrıca yüzme hareketleri ile kendi kendine üretilebilir22 , 23,24, solunum22,25,26ve besleme27. Bu davranışlar saç hücrelerini yorabilen ve algılamayı bozabilen tekrarlayan hareketlerden oluşur. Bu nedenle, yanal çizgi sisteminin dış (exafferent) ve kendi kendine oluşturulan (reafferent) akış uyaranları arasında ayrım yaptığı kritik öneme sahiptir. Bir corollary deşarjı, zebra balıklarında hareket sırasında kendi kendine oluşturulan akış sinyallerini hafifletir. Bu inhibitör tahmine dayalı motor sinyal, girişi değiştirmek veya reafferent geri bildirimin işlenmesini kesmek için azalan nöronlar aracılığıyla duyu reseptörlerine aktarılır28,29. Bu besleme sistemini erken anlamamıza katkıda bulunan ufuk açıcı çalışma, nöral devrenin bağlantı ve endojen aktivitesinin korunmadığı in vitro preparatlara dayanıyordu28, 30,31,32,33,34,35. Bu protokol, endojen geri bildirim dinamiklerinin korunduğu bozulmamış bir sinir devresini korumaya yönelik bir yaklaşımı açıklar, böylece corollary deşarj in vivo’nun daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Burada özetlenen protokol, larva zebra balıklarında posterior lateral çizgi afferent nöron ve motor nöron aktivitesinin aynı anda nasıl izleneceğini açıklar. Motor komutlarından önce, sırasında ve sonrasında farklı sinyal dinamiklerini karakterize etmek, merkezi sinir sisteminden gelen ve hareket sırasında saç hücresi hassasiyetini modüle eden gerçek zamanlı, endojen geri bildirimler hakkında içgörüler sağlar. Bu protokol, deneylerden önce hangi malzemelerin hazırlanması gerektiğini özetler ve daha sonra zebra balığı larvalarının nasıl felç edileceğini ve hazırlanacağını açıklar. Protokol, afferent nöronların ve motor nöronların hücre dışı ventral kök (VR) kayıtlarının istikrarlı bir gevşek yama kaydının nasıl oluşturulacağını açıklayacaktır. Bu protokol kullanılarak elde edilebilen temsili veriler örnek bir bireyden sunulur ve deneysel protokolün birden fazla çoğaltması üzerinde analiz yapılır. Verilerin önceden işlenmesi MATLAB’da özel yazılı komut dosyaları kullanılarak gerçekleştirilir. Genel olarak, bu in vivo deneysel paradigma, model omurgalı saç hücresi sistemindeki hareket sırasında duyusal geri bildirimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamaya hazırdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan deneysel protokol, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlar arasında duyusal girişteki endojen değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar. Özellikle, larva zebra balıklarında yanal çizgi afferent nöronların ve ventral motor köklerinin eşzamanlı hücre dışı kayıtlarını gerçekleştirmeye yönelik in vivo bir yaklaşımı detaylandırıyor. Spontan afferent aktivite daha önce zebra balıklarında potansiyel eşzamanlı motoraktivitesi 1,2 ,<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Sağlık Enstitüsü (DC010809), Ulusal Bilim Vakfı (IOS1257150, 1856237) ve Whitney Deniz Biyobilimleri Laboratuvarı’ndan J.C.L.’ye desteklerini minnetle kabul ediyoruz. Liao Lab’ın geçmiş ve şimdiki üyelerine tartışmaları teşvik eden için teşekkür ederiz.
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
Riferimenti
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish’s lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell’s afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat’s auditory nerve. , (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator’s strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal’s own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
