여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.
단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포생성은 심혈관 질환에 대한 정밀 의학에 엄청난 관심을 끌고 있습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 심장 분화는 배아 심장 발달에 필수적인 정의된 신호 경로에 의해 변조됩니다. 2D 및 3D 플랫폼에 대한 수많은 심장 분화 방법은 다양한 효율성과 심근세포 수율로 개발되었습니다. 이러한 방법의 다양성은 따라하기 어려울 수 있기 때문에 이것은 필드 외부 의아해 수사관이있다. 여기서 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 환자 특정 심근 세포의 견고한 생성 및 확장을 정교하게 하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 먼저 비통합 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 고효율 iPSC 재프로그래밍 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 대부분의 인간 iPSC 라인에서 박동하는 심근세포를 강력하게 생성할 수 있는 작은 분자 매개 단층 분화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 확장 가능한 심근세포 팽창 프로토콜은 산업 및 임상 등급 응용을 위해 환자 유래 심근세포를 빠르게 확장할 수 있는 작은 분자(CHIR99021)를 사용하여 도입된다. 결국, 이러한 iPSC-CM의 분자 식별 및 전기 생리학적 특성화를 위한 상세한 프로토콜이 묘사된다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 발달과 줄기 세포 생물학에 대한 제한된 지식을 가진 초보자를 위한 실용적일 것으로 기대합니다.
인간 유도 만능 줄기 세포의 발견은 현대 심장 혈관 의학1,2에혁명을 일으켰습니다. 인간 iPSCs는 심근세포, 내피 세포, 매끄러운 근육 세포 및 심장 섬유아세포를 포함하여 심장에 있는 모든 세포 모형을 자기 갱신하고 생성할 수 있습니다. 환자 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)는 유전적으로 상속가능한 심혈관 질환(CVDs)을 모델링하고 신약에 대한 심장 안전성 검사를 위한 무기한 자원역할을 할 수있다. 특히, 환자 iPSC-CM은 긴 QT 증후군4 및 확장된 심근병증(DCM)5와같은 심근세포의 결함에서 파생된 CVD의 유전적 및 분자 병각을 잘 조사할 태세입니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집과 결합된 환자 iPSC-CM은 선천성 심장 결함(CHDs)6,7,8을포함한 CVD의 복잡한 유전적 기초를 이해하는 전례 없는 길을 열었습니다. 인간 iPSC-CM은 또한 심장 마비 도중 손상된 심근을 보충하기 위한 자가 세포 근원역할을 하는 잠재력을 전시했습니다9. 최근에는 심장 재생 및 약물 검사를 위한 정의된 하위 형(심방, 심실 및 노달)을 가진 고품질 인간 iPSC-CM을 생성하는 것이 가장중요해졌습니다.
인간 iPSC에서 심장 분화는 지난 10 년 동안 크게 진보되었습니다. 분화 방법은 배아 체(EB)기반의 자발적 분화에서 화학적으로 정의되고 지시된 심장분화(11)로갔다. Wnt, BMP, Nodal 및 FGF와 같은 배아 심장 발달에 필수적인 주요 신호 분자는 인간 iPSC10,12로부터심근구 분화를 향상시키기 위해 조작된다. 중요한 진보는 인간 iPSCs13,14에서심근세포의 견고한 생성을 위한 Wnt 신호 (억제 에 선행된 활성화)의 순차적변조를포함한다. 화학적으로 정의된 심장 분화 레시피는 산업 및 임상 수준의 생산으로 업그레이드될 가능성이 있는 심근세포15,16을치는 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 탐구되었습니다. 더욱이, 초기 인간 iPSC-CM의 강력한 확장은 작은 화학물질(CHIR99021)17을이용하여 구성적인 Wnt 활성화에 노출함으로써 달성된다. 가장 최근에는, 아류형 특이적 심근세포는 인간 iPSC18,19,20,21,22의심근세포 계보 약정 동안 특정 분화 창에서 망막산(RA) 및 Wnt 신호 경로의 조작을 통해 생성된다.
이 프로토콜에서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 유래하는 인간 적인 CM의 견고한 생성 그리고 증식을 위한 작동 절차를 상세히 설명합니다. 우리는 1) 인간 PBMC를 iPSC로 재프로그래밍하는 프로토콜, 2) 인간 iPSC에서 심근세포를 치고, 3) 초기 iPSC-CM의 급속한 확장, 4) 인간 iPSC-CM의 분자 특성화, 및 5) 단일 세포 수준에서 인간 iPSC-CM의 전기 생리학적 측정을 패치 에 의해 제시한다. 이 프로토콜은 환자 혈액 세포를 심장 구균세포를 구타로 변환하는 방법에 대한 상세한 실험 절차를 다룹니다.
iPSC 재프로그래밍 하는 동안, 그들은 명확한 핵과 세포질로 확대 될 때까지 1 주일 동안 PBMC를 배양하는 것이 중요합니다. PBMC가 증식하지 않기 때문에 바이러스 성 트랜스듀션에 적합한 세포 수는 성공적인 iPSC 재프로그래밍에 중요합니다. PBMC의 세포 수, 감염의 복합성 (MOI) 및 바이러스의 titer는 최적의 트랜스유도 결과에 도달하기 위하여 고려되고 조정되어야 합니다. 심장 분화의 경우 초기 시?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 미국 심장 협회 (AHA) 경력 개발 상 18CDA34110293 (M-T.Z.), 추가 벤처 AVIF 및 SVRF 상 (M-T.Z.), 국립 보건원 (NIH /NHLBI) 보조금 1R01HL1HL13225 (1R01HL132520)에 의해 지원되었다. 밍타오 자오 박사는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 스타트업 기금으로도 지원받았습니다.
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |