כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור ולהרחיב בחוזקה קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים.
יצירת קרדיומיוציטים ספציפיים למטופלים מהגרלת דם אחת משכה עניין עצום ברפואה מדויקת על מחלות לב וכלי דם. הבחנה לבבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (iPSCs) מווסתתת על ידי מסלולי איתות מוגדרים החיוניים להתפתחות הלב העוברי. שיטות שונות לבידול לב על פלטפורמות 2-D ו 3-D פותחו עם יעילות שונים ותפוקת cardiomyocyte. זה יש חוקרים תמוהים מחוץ לתחום כמו מגוון של שיטות אלה יכול להיות קשה לעקוב. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף המפרט ייצור חזק והרחבה של קרדיומיוציטים ספציפיים למטופל מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs). ראשית אנו מתארים פרוטוקול תכנות מחדש IPSC יעילות גבוהה מדגימת הדם של המטופל באמצעות וקטורים וירוס סנדאי ללא שילוב. לאחר מכן אנו מפרטים שיטת בידול מונו-שכבתית קטנה בתיווך מולקולה שיכולה לייצר קרדיומיוציטים מכים מרוב קווי ה- iPSC האנושיים. בנוסף, פרוטוקול הרחבת קרדיומיוציטים מדרגי מוצג באמצעות מולקולה קטנה (CHIR99021) שיכולה להרחיב במהירות קרדיומיוציטים שמקורם בחולים עבור יישומים ברמה תעשייתית וקלינית. בסוף, פרוטוקולים מפורטים לזיהוי מולקולרי ואפיון אלקטרופיזיולוגי של iPSC-CMs אלה מתוארים. אנו מצפים פרוטוקול זה להיות פרגמטי למתחילים עם ידע מוגבל על התפתחות הלב וכלי הדם וביולוגיה של תאי גזע.
גילוי תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים על ידי האדם חולל מהפכה ברפואת הלב וכלי הדם המודרנית1,2. IPSCs אנושיים מסוגלים לחדש את עצמם וליצור את כל סוגי התאים בלב, כולל cardiomyocytes, תאי אנדותל, תאי שריר חלקים פיברובלסטים לב. קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC (iPSC-CMs) יכולים לשמש כמשאבים בלתי מוגבלים למידול מחלות לב וכלי דם תורשתיות גנטית (CVDs) ובדיקת בטיחות הלב לתרופות חדשות3. בפרט, iPSC-CMs המטופל צפויים היטב לחקור אטיולוגיות גנטיות ומולקולריות של קורות חיים שמקורם פגמים cardiomyocytes, כגון תסמונת QT ארוכה4 וקרדיומיופתיה המופרדת (DCM)5. בשילוב עם עריכת הגנום בתיווך CRISPR/Cas9, IPSC-CMs המטופל פתחו שדרה חסרת תקדים כדי להבין את הבסיס הגנטי המורכב של תקליטורי CVD כולל מומים מולדים בלב (CHDs)6,7,8. IPSC-CMs אנושיים הציגו גם פוטנציאל לשמש כמקורות תאים אוטולוגיים לחידוש שריר הלב הפגוע במהלך התקף לב9. בשנים האחרונות, זה הפך להיות בעל חשיבות עליונה כדי ליצור iPSC-CMs אנושי באיכות גבוהה עם תת סוגים מוגדרים (פרזדורים, חדרית ונודאל) עבור התחדשות הלב ובדיקות סמים10.
הבחנה לבבית מ- IPSCs אנושית התקדמה מאוד בעשור האחרון. שיטות בידול עברו מהבחנה ספונטנית מבוססת גוף עוברית (EB) לבידול לבבי מוגדר ומכוון כימית11. מולקולות איתות מרכזיות החיוניות להתפתחות הלב העוברי, כגון Wnt, BMP, Nodal ו- FGF מופעלות כדי לשפר את הבידול הקרדיומיוציטים מ- iPSCs אנושי10,12. התקדמות משמעותית כוללת אפנון רציף של איתות Wnt (הפעלה ואחריו עיכוב) עבור דור חזק של cardiomyocytes מ IPSCs אנושי13,14. מתכונים לביולוגיה מוגדרים כימית נחקרו כדי להקל על ייצור בקנה מידה גדול של להכות cardiomyocytes15,16, אשר יש פוטנציאל להיות משודרג לייצור ברמה תעשייתית וקלינית. יתר על כן, הרחבה חזקה של iPSC-CMs אנושי מוקדם מושגת על ידי חשיפה להפעלת Wnt המרכיבה באמצעות כימי קטן (CHIR99021)17. לאחרונה, קרדיומיוציטים ספציפיים תת-סוג נוצרים באמצעות מניפולציה של חומצה רטינואית (RA) ו Wnt איתות מסלולים בחלונות בידול ספציפיים במהלךמחויבות שושלתקרדיומיוציטים מ- iPSCs אנושי 18,19,20,21,22.
בפרוטוקול זה, אנו מפרטים הליך עבודה לייצור חזק והתפשטות של CMs אנושי שמקורו בתאים מונונוקלאריים של דם היקפי של מטופל. אנו מציגים פרוטוקולים עבור 1) תכנות מחדש של מחשבים אישיים אנושיים ל- iPSCs, 2) דור חזק של קרדיומיוציטים מכים מ- iPSCs אנושיים, 3) התרחבות מהירה של IPSC-CMs מוקדמים, 4) אפיון מולקולרי של IPSC-CMs אנושיים, ו -5) מדידה אלקטרופיזיולוגית של iPSC-CMs אנושיים ברמת התא הבודד על ידי מהדק תיקון. פרוטוקול זה מכסה את ההליכים הניסיוניים המפורטים על המרת תאי דם של מטופלים להכות cardiomyocytes.
במהלך תכנות מחדש של IPSC, זה קריטי לתרבות PBMCs במשך שבוע אחד עד שהם מוגדלים עם גרעינים ברורים ציטופלסמה. מאחר שמחשבי PBMCs אינם מתרבים, מספר תא מתאים עבור התמרה ויראלית חשוב לתכנות מחדש מוצלח של iPSC. מספר התא של מחשבים אישיים, ריבוי של זיהום (MOI) ו titer של וירוס צריך להיחשב ולהתאים כדי להגיע לתוצאות הת…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקאית ללב (AHA) קריירה פיתוח פרס 18CDA34110293 (M-T.Z.), מיזמים נוספים AVIF ו- SVRF פרסים (M-T.Z.), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NHLBI) מענקים 1R01HL124245, 1R01HL132520 ו R01HL096962 (I.D.). ד”ר מינג-טאו זאו נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ ממכון המחקר אביגיל וקסנר בבית החולים הלאומי לילדים.
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |