Monitoreo De La ElastasA NeutrófiloS Y La Actividad De La Catepsina G En Muestras De Esputo Humano

Los siguientes protocolos describen el análisis realizado en esputo humano. El manejo de muestras en humanos fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Heidelberg y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o de sus padres/tutores legales (S-370/2011) y controles sanos (S-046/2009). NOTA: Los siguientes protocolos describen la preparación de la muestra y la cuantificación de la actividad de las proteasas de serina de neutrófilos (NSP). Los procedimientos experimentales presentados aquí se centran en el esputo humano y la elastasa14,20,21 (NE) o la medición de la actividad de la catepsina G15 (CG). Sin embargo, las adaptaciones leves en el protocolo de la preparación de la muestra hacen el análisis de las células sangre-derivadas y de los homogenados del tumor posibles. Además, las actividades de la metaloproteinasa 12 y de la catepsina S de la matriz se pueden investigar semejantemente por medio de las puntas de prueba dedicadas22,23,24,25,26. 1. Preparación de la muestra: aislamiento celular y separación de sobrenadantes NOTA: Si es posible, el tratamiento del esputo debe llevarse a cabo dentro de los 120 minutos después de la expectoración y el esputo debe almacenarse en el hielo hasta su posterior procesamiento. Si la expectoración espontánea del esputo no es posible, induzca el esputo como se describió anteriormente19. Brevemente, inhale 200 μg del salbutamol β-2-receptor-antagonista antes de comenzar el procedimiento de inducción del esputo. Después, inhale una solución salina hipertónica (6%) durante 15 min usando un nebulizador. Recoger el esputo expectorado en una placa de Petri. Separe los grupos de moco de la saliva en una placa de Petri con la ayuda de una punta de pipeta. Pesar el moco.NOTA: El peso promedio de una muestra de moco es de 0.8 g (variando entre 0.1 g y 5 g); 0,1 g suelen ser suficientes para realizar los procedimientos mencionados. Añadir 4 partes (v/p) de Sputolysin al 10% (en PBS) al esputo (por ejemplo: 4 mL de Sputolysin al 10% por cada gramo de esputo).PRECAUCIÓN: Sputolysin se compone de ditiothreitol concentrado en tampón de fosfato, por lo tanto, manejarlo con cuidado. Incubar la mezcla a temperatura ambiente (RT) en una coctelera oscilante durante 15 min para disolver el moco. Por razones de seguridad, coloque la coctelera en una campana extractora de humos. Apaje la reacción añadiendo el mismo volumen de PBS frío (por ejemplo: 1 mL de PBS frío por cada mL de Sputolysin del 10%). Mezclar mediante pipeteo para obtener una solución homogénea. Filtre la mezcla a través de un colador de células de nylon de 100 μm en un tubo de 50 mL. Repita el paso de filtración a través de un colador de células de nylon de 40 μm. Centrifugar la solución durante 10 min a 300 x g a 4 °C. Transfiera la fracción sobrenadante cuidadosamente a un tubo fresco y guárdelo en el hielo.NOTA: Las fracciones sobrenadantes se pueden almacenar a -20 °C o -80 °C hasta su posterior análisis. Resuspend suavemente el pellet celular en 500 μL de PBS frío y colóquelo sobre hielo.Nota : la fracción de celda debe procesarse inmediatamente. 2. Medición de la actividad de la proteasa de la serina de neutrófilos NOTA: Aquí, se introducen diferentes métodos para cuantificar la actividad de los NSP por medio de reporteros FRET. La elección de la tecnología está dictada por la pregunta biomédica específica y el propósito del experimento. Las sondas presentadas fueron ampliamente probadas para su especificidad contra un conjunto de enzimas pulmonares relevantes14,15. Aunque las sondas son específicas hacia su enzima diana, compruebe siempre la especificidad de la sonda en la muestra clínica de interés. Esto se puede lograr incubando la muestra con un inhibidor específico de la proteasa antes de la adición de la sonda, que debe abolir cualquier aumento en la relación D/A. Cuantificación de la actividad de los NSP solubles mediante fluorímetro o ensayo de lector de placasNOTA: La actividad de la proteasa en fracciones solubles de la muestra se puede detectar con cualquier instrumento capaz de detección de fluorescencia.Descongelar las enzimas en el hielo. Hasta su uso, mantenga ne y CG en tampón de almacenamiento ácido (50 mM acetato de sodio, 200 mM NaCl, pH 5.5) para evitar la auto-escisión. Para establecer una curva estándar de enzimas, prepare una dilución en serie 1:2 de la enzima (33,9 – 0,271 nM para NE; 42,6 – 0,333 nM para CG) en tampón de activación (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl a pH 7,5). El tampón de activación tiene un pH neutro y, por lo tanto, permite que la catálisis enzimática se produzca de manera eficiente. Para preparar la concentración estándar más alta (concentración de NE: 33,9 nM), diluya 1 μL de NE (33,9 μM) en 999 μL de tampón de activación. Para preparar el segundo estándar (concentración ne: 16,95 nM), mezclar 200 μL de la primera dilución con 200 μL de tampón de activación. Proceda en consecuencia a preparar las diluciones 1:2 restantes. El último estándar, que es el espacio en blanco, se compone de búfer de activación puro. Se recomienda la medición de duplicados técnicos o triplicados. Durante la preparación estándar y de la muestra, trate de mantener los viales en el hielo. En paralelo a la preparación estándar, diluya las muestras de esputo en el búfer de activación. Diluir las muestras humanas antes de evaluar su actividad proteasa para permanecer en el rango lineal de aumento de la señal del reportero (relación donante/aceptor). Si las muestras de los pacientes se dejaron sin diluir, la escisión ocurriría demasiado rápido para un ajuste confiable. Dado que el esputo de donante sano contiene menos proteasas activas en comparación con las muestras de pacientes con FQ y EPOC, generalmente se realizan diferentes diluciones (1:10 para el sobrenadante de esputo sano, 1:20-500 para el sobrenadante de esputo de pacientes con EPOC o FQ).NOTA: Con el fin de medir cuantitativamente la actividad de la proteasa en muestras donde su concentración es desconocida, una curva estándar con concentraciones enzimáticas conocidas debe medirse en paralelo, idealmente en la misma placa. La concentración de enzima activa en el esputo humano se calcula interpolando las pendientes medidas en muestras de esputo humano con las medidas con las curvas estándar. Antes de preparar las muestras para la medición, configure el instrumento. Establezca la longitud de onda de excitación para la sonda NE FRET (NEmo-114)en 354 nm, y establezca la longitud de onda de detección en 400 nm para el donante y 490 nm para el aceptor. Establezca la longitud de onda de excitación para la sonda CG FRET (sSAM15)en 405 nm, y establezca la emisión en 485 (donante) y 580 nm (aceptor). Agregue 40 μL de muestras, estándar o en blanco en los pozos de una placa negra de media área de 96 pozos. Para preparar la mezcla maestra que contiene los reporteros (concentración del reportero en la mezcla maestra: 10 μM), diluya la culata de la sonda (1 mM en DMSO) 1:100 en el tampón de activación. Prepare el volumen de mezcla maestra necesario multiplicando 10 μL x el número de pozos de placa requeridos. Para alcanzar la concentración final óptima (2 μM) para la medición de fluorescencia de los reporteros NEmo-1 y sSAM, agregue 10 μL de la mezcla maestra a cada pozo (que contiene 40 μL de cualquier muestra, estándar o en blanco) e inicie la lectura. Por lo tanto, los reporteros de NEmo-1 y sSAM monitorearán la actividad soluble de la elastasa de neutrófilos y la catepsina G, respectivamente.NOTA: Si un inyector de reactivos no está disponible, asegúrese de iniciar la lectura tan pronto como sea posible después de la adición del informador a las muestras. Inicie la medición del lector de placas y registre el aumento de la relación donante/aceptor cada 60-90 segundos durante al menos 20 minutos o hasta que el aumento de la señal alcance una meseta. Una vez que se exportan los datos, calcule la relación donante/aceptor (relación D/A) dividiendo las unidades de fluorescencia relativa del donante (RFU) con la RFU aceptora para cada punto de tiempo y muestra. Calcular la media de la relación D/A y la desviación estándar de cada muestra. Determine la pendiente dentro del crecimiento lineal del cambio de relación D/A. La pendiente es un indicador de la tasa de escisión enzimática para una sonda FRET. Calcular la concentración de enzima activa en esputo ajustando las pendientes de regresión lineal derivadas de las muestras humanas con las calculadas a partir de la enzima estándar. Cuantificación de la actividad de los NSP unidos a membranas mediante fluorímetro o ensayo de lector de placas Aísle las células del esputo como se describió arriba. Resuspend 3 x 104 células en un volumen de 40 μL de PBS. Agregue bien las celdas al lector de placas. Configure el instrumento. Establezca la longitud de onda de excitación para la sonda NE FRET unida a la membrana (NEmo-214)en 405 nm, y establezca la longitud de onda de detección en 485 nm para el donante y 580 nm para el aceptor. Establezca la longitud de onda de excitación para la sonda CG FRET unida a membrana (mSAM15)a 405 nm, y establezca la emisión en 485 (donante) y 580 nm (aceptor). Para preparar la mezcla maestra que contiene los reporteros, diluya la culata de la sonda en tampón de activación a una concentración de 10 μM. Prepare el volumen de mezcla maestra necesario multiplicando 10 μL X el número de pozos de placa requeridos. Para alcanzar la concentración final óptima (2 μM) para la medición de fluorescencia de los reporteros NEmo-2 y mSAM, agregue 10 μL de la mezcla maestra a cada pozo (que contiene 40 μL de muestra, estándar o en blanco) e inicie la lectura. Por lo tanto, los reporteros de NEmo-2 y mSAM monitorearán la actividad de la elastasa de neutrophil unida a la membrana y a la catepsina G, respectivamente.NOTA: Un control negativo celular se puede utilizar, por ejemplo, las células que no secretan activamente NSP. Por ejemplo, la incubación de los reporteros con 3 x 104 progenitores leucocitarios HL-60 células promielocíticas representa un control negativo de escisión válida. Cambio récord en la relación donante/aceptor durante al menos 20 min o hasta que el aumento de la señal alcance una meseta. Analice los datos como se describió anteriormente. Medición de la actividad de los NSP unidos a membranas mediante microscopía de fluorescenciaDeterminar el número de condiciones que necesitan ser analizadas.NOTA: Para cada medición de la muestra de esputo, se recomienda la preparación y el análisis de controles adicionales positivos (PC) y negativos (NC). Para cada medición, resuspend 3 x 104 células de esputo en un volumen de 50 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL. Como control negativo, incubar las células de esputo con un inhibidor específico (Sivelestat, inhibidor específico de NE, o inhibidor I de la catepsina G, inhibidor específico de CG, a una concentración final de 100 μM). Incubar durante 10 min en RT. Como control positivo, incubar las células de esputo con la enzima apropiada (NE o CG a 340 nM o 200 nM, respectivamente) durante 10 min en RT. Añadir 50 μL de PBS que contenga el reportero FRET y una mancha nuclear (en una dilución final de 1:1000) a cada tubo (células tratadas con control positivo, células tratadas con control negativo y células no tratadas) para alcanzar una concentración final de sonda de 2 μM. Incubar durante 10-20 min a RT.IMPORTANTE: La adición de una mancha nuclear facilita la proyección de imagen de la microscopia de la fluorescencia pues permite buscar para las células del esputo del interés sin utilizar los canales de la sonda del traste y por lo tanto evitar el blanqueo del reportero. Además, la tinción de ADN permite segmentar las células de esputo de acuerdo con la forma de su núcleo. Por ejemplo, los neutrófilos pueden ser fácilmente identificados por sus núcleos multilobulares. Además, se puede recuperar información adicional sobre la viabilidad de las células (los neutrófilos con un núcleo más segmentado tienen más probabilidades de estar vivos).NOTA: Además de la unida a la membrana, la actividad de NE o CG unido al ADN en el esputo humano se puede medir de la misma manera por medio de H-NE y H-CG, sondas FRET extracelulares asociadas al ADN27. Al preparar la mezcla maestra, se puede añadir H-NE y H-CG a la concentración de 10 μM e incubar con esputo antes de la preparación del citoespino y el portaobjetos. La cuantificación de la relación D/A en el ADN extracelular procede idénticamente a NEmo-2 y mSAM, con la única diferencia de que los agregados de ADN extracelular están segmentados en lugar de las células individuales27. Apaúde la reacción añadiendo 100 μL de PBS helado y transfiera muestras sobre hielo. Cytospin la mezcla en portaobjetos de microscopía, secar al aire, fijar con metanol helado al 10% durante 10 min, secar al aire y montar con un medio de montaje adecuado.NOTA: Los portaobjetos de microscopía se pueden almacenar a 4 °C en la oscuridad durante un mes hasta un análisis adicional. Adquiera imágenes de microscopía utilizando un microscopio confocal con un objetivo de aceite PL APO 40x o 63x. Para aumentar la calidad de la imagen y reducir el tiempo de adquisición, se recomienda un modo de adquisición secuencial de imágenes. Imagen de la mancha nuclear primero a través de la excitación de 633 nm con la línea helio-neón-láser y registrar su emisión entre 650 y 715 nm. Registre el donante (cumarina 343) del reportero del TRASTE entre 470 y 510 nanómetro sobre la excitación en 458 nanómetro con un laser de argón. Adquirir la emisión del aceptor sensibilizado (5,6-TAMRA) entre 570 y 610 nm después de la excitación del único donante. Registre la emisión directa del aceptor en un canal separado entre 470 y 510 nm sobre la excitación óptima del aceptor a 561 nm utilizando el láser de estado sólido bombeado por diodo (DPSS). Fije el agujero de alfiler al principio del experimento y su mantenimiento durante el transcurso de la sesión de imágenes.NOTA: Debido a su pequeño tamaño, se recomienda el uso de un objetivo de microscopio 40x o 63x para visualizar los neutrófilos correctamente. Por lo general, las imágenes se adquieren en varios canales consecutivos, comenzando con la longitud de onda de excitación más larga para evitar el fotoblanqueo del reportero durante la adquisición. Imagen de al menos 100 celdas por condición para obtener estadísticas concluyentes. Para el análisis de imágenes de microscopía utilice un software apropiado: segmente las células y calcule la relación D/A píxel píxel por píxel, luego calcule la media o mediana de una región de interés dada que es seleccionada manualmente por el usuario. Para obtener resultados representativos, consulte la Figura 1. Figura 1:Imágenes representativas y cuantificación de la actividad del NE unido a la membrana en neutrófilos aislados del esputo del paciente con FQ. a)Imágenes representativas de microscopía confocal de neutrófilos preincubados (panel superior) durante 10 min con 100 μM de Sivelestat (w/) o no tratados (sin o) (panel inferior) antes de la adición del reportero NEmo-2 (2 μM). La primera columna de la izquierda muestra la mancha nuclear, la segunda el canal donante, la tercera el canal aceptor y la última la relación D/A calculada obtenida dividiendo los canales donante y aceptor píxel por píxel. Los bordes de la región de interés (neutrófilo único) se representan como una línea discontinua. Se indican la escala (10 μm) y las barras de calibración (relación D/A). b)Diagramas de caja y puntos que muestran la relación D/A de neutrófilos de esputo de un paciente representativo con FQ. Las células incubadas con células inhibidoras y no tratadas se muestran en gris y azul, respectivamente. Cada punto representa una célula (N: con inhibidor = 113 y sin inhibidor = 96). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Medición de la actividad de los NSP unidos a membrana a través de citometría de flujo Resuspend 1 x 106 células en 100 μL de PBS en un tubo de fondo redondo de poliestireno FACS de 5 mL y coloque el tubo sobre hielo. Para bloquear los neutrófilos del esputo, use los siguientes anticuerpos: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) y CD66b (1:50). Prepare suficiente mezcla maestra para todas las muestras. Coloque la mezcla maestra en el hielo en la oscuridad. Configure la estrategia de gating como se describe en la figura 2. Los neutrófilos están bloqueados como 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ eventos. Los eventos cerrados se analizarán para su actividad de proteasa unida a la membrana para su donante (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) y aceptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) intensidades fluorescentes medias (IMF). Agregue 2 μL de FcBlock a cada muestra e incube durante 5 min en RT. Agregue los anticuerpos elegidos a cada tubo e incube durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Lave las células añadiendo 2 mL de PBS frío, y centrífuga durante 5 min a 300 x g y 4 °C. Deseche las células sobrenadantes y resuspentes en 200 μL de PBS frío. Divida los 200 μL en dos tubos con 100 μL cada uno y agregue 5 μL de solución de tinción de viabilidad celular en cada tubo. Coloque tubos sobre hielo. Añadir un inhibidor específico apropiado de NSP (para el uso de NE Sivelestat a 225 μM de concentración final, para el uso de CG catepsina G Inhibidor I a 100 μM) al tubo de ensayo de control negativo (NC). Incubar las muestras en RT durante 10 min en la oscuridad. Agregue 100 μL de PBS frío a la muestra, filtre a través de un filtro de 40 μm en un tubo FACS limpio para evitar la obstrucción del instrumento. Añadir el reportero (para NE, NEmo-2 a una concentración final de 4 μM, para CG, mSAM a una concentración final de 2 μM) a la muestra NC, vórtice suavemente el tubo. Comience a adquirir células incubadas con el inhibidor específico para ajustar ligeramente, si es necesario, las puertas, así como los voltajes de los PMTs reporteros. Registre al menos 1000 neutrófilos. Mantenga la muestra a temperatura ambiente.Nota : aunque se pueden registrar más eventos, 1000 celdas garantizan un buen compromiso entre las estadísticas adecuadas y el tiempo de registro. Proceda con los siguientes tubos (muestras de esputo no tratadas) en consecuencia. Para registrar los cambios en la relación D/A debido a la actividad de la proteasa unida a la membrana, registre 1000 neutrófilos de cada tubo cada 5 a 10 min.NOTA: Después de la escisión exitosa del reportero fret, la intensidad de las IMF del canal donante aumentará con el tiempo. La intensidad de las IMF del canal aceptor debe disminuir o permanecer constante con el tiempo. Calcule la relación FRET dividiendo al donante por los valores del canal aceptor para las muestras medidas en los neutrófilos individuales viables bloqueados. Normalice las mediciones de muestras dividiéndolas con el correspondiente punto de tiempo de 0 min (para obtener resultados y análisis representativos, consulte la Figura 2).NOTA: El registro de al menos dos puntos de tiempo (es decir, 0 y 10 min) es necesario para una medición dinámica del cambio de relación D/A. Para normalizar la medición de la actividad para cada muestra, la relación D/A medida en puntos de tiempo posteriores (por ejemplo, 10 min) se divide por la relación calculada inmediatamente después de la adición de la sonda (0 min). Figura 2:Estrategia de gating y gráficas representativas de la actividad ne unida a la membrana medida en neutrófilos aislados del esputo de los pacientes con FQ. a)Para gatear neutrófilos de esputo se utilizan los siguientes anticuerpos: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) y CD66b (1:50). Los neutrófilos están bloqueados como 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ eventos. Los eventos cerrados se analizan para su donante (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) y aceptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) intensidades medias de fluorescencia (IMF). b)Histogramas representativos de neutrófilos de esputo CF analizados por su actividad ne unida a la membrana. La columna izquierda muestra la señal donante, la columna derecha muestra la señal aceptora. La fila superior muestra las intensidades medias de fluorescencia de las células tratadas con Sivelestat (w/) durante 10 min antes de la adición del reportero. La fila inferior muestra células no tratadas (sin o) cuya fluorescencia del reportero se mide inmediatamente (0 min, gris) y 10 min (azul) después de la adición del reportero. Los neutrófilos están bloqueados de acuerdo con la estrategia mostrada en el panel a. c)La tabla de datos muestra un conjunto de datos representativo que consiste en IMF crudas para el donante y la señal aceptora en neutrófilos medidos en varios puntos de tiempo (0-3-5-10-15-20 min), así como la relación D/A calculada. La relación D/A se puede normalizar, es decir, al punto de tiempo de 0 min (fuente blanca). 0 min indica una grabación realizada tan pronto como sea posible después de la adición del reportero al tubo de flujo con células de esputo teñidas. Los datos de las IMF se muestran como desviación estándar media ± para 1000 neutrófilos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.