Мониторинг активности нейтрофильной эластазы и катепсина G в образцах мокроты человека

Следующие протоколы описывают анализ, выполненный на мокроте человека. Обработка образцов человека была одобрена комитетом по этике Гейдельбергского университета, и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов или их родителей / законных опекунов (S-370/2011) и здоровых контрольных (S-046/2009). ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие протоколы описывают пробоподготовку и количественную оценку активности нейтрофильных сериновых протеаз (NSP). Экспериментальные процедуры, представленные в настоящем описании, сосредоточены на измерении активности мокроты человека и нейтрофильной эластазы14,20,21 (NE) или катепсина G15 (CG). Однако незначительные изменения в протоколе пробоподготовки делают возможным анализ клеток крови и гомогенатов опухоли. Кроме того, активность матриксной металлопротеиназы 12 и катепсина S может быть исследована аналогичным образом с помощью специализированных зондов FRET22,23,24,25,26. 1. Пробоподготовка: изоляция клеток и разделение супернатантов ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности обработку мокроты следует проводить в течение 120 мин после отхаркивания и хранить мокроту на льду до дальнейшей обработки. Если спонтанное отхаркивание мокроты невозможно, индуцируйте мокроту, как описаноранее 19. Кратко вдохните 200 мкг β-2-рецептор-антагониста сальбутамола перед началом процедуры индукции мокроты. После этого вдыхайте гипертонический (6%) физиологический раствор в течение 15 мин с помощью небулайзера. Соберите отхаркившую мокроту в чашку Петри. Отделите сгустки слизи из слюны в чашку Петри с помощью кончика пипетки. Взвесьте слизь.ПРИМЕЧАНИЕ: Средний вес образцов слизи составляет 0,8 г (варьируется от 0,1 г до 5 г); 0,1 г обычно достаточно для выполнения указанных процедур. Добавьте в мокроту 4 части (v/w) 10% Спутолизина (в PBS) (например: 4 мл 10% Спутолизина на каждый грамм мокроты).ВНИМАНИЕ: Спутолизин состоит из концентрированного дитиотрейтола в фосфатном буфере, поэтому относитесь к нему с осторожностью. Инкубировать смесь при комнатной температуре (RT) на качающей шейкере в течение 15 мин до растворения слизи. По соображениям безопасности поместите шейкер в вытяжной капюшон. Утвеняют реакцию добавлением такого же объема холодного PBS (например: 1 мл холодного PBS на каждый мл 10% Sputolysin). Перемешать путем пипетки до получения однородного раствора. Отфильтруйте смесь через сетчатый фильтр нейлоновых клеток 100 мкм в пробирку с 50 мл. Повторите этап фильтрации через сетчатый фильтр нейлоновых клеток 40 мкм. Центрифугировать раствор в течение 10 мин при 300 х г при 4 °С. Осторожно переложите фракцию надменителя в свежую трубку и храните на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Фракции супернатантов могут храниться при -20 °C или -80 °C до дальнейшего анализа. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу клетки в 500 мкл холодного PBS и поместите ее на лед.ПРИМЕЧАНИЕ: Фракция клеток должна быть немедленно обработана. 2. Измерение активности нейтрофильной сериновой протеазы ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлены различные методы количественной оценки активности НСП с помощью репортеров FRET. Выбор технологии продиктован конкретным биомедицинским вопросом и целью эксперимента. Представленные зонды были тщательно протестированы на их специфичность по отношению к набору легочных соответствующих ферментов14,15. Хотя зонды специфичны для их целевого фермента, всегда проверяйте специфичность зонда на интересуемом клиническом образце. Это может быть достигнуто путем инкубации образца со специфическим ингибитором протеазы перед добавлением зонда, что должно отменить любое увеличение соотношения D/A. Количественная оценка активности растворимых НСП с помощью флуориметра или анализа считывателя пластинПРИМЕЧАНИЕ: Активность протеазы в растворимых фракциях образца может быть обнаружена с помощью любого прибора, способного к флуоресцентной детекции.Оттаивать ферменты на льду. До использования храните NE и CG в кислом буфере хранения (50 мМ ацетата натрия, 200 мМ NaCl, рН 5,5) для предотвращения саморасщепления. Чтобы установить стандартную кривую фермента, подготовьте последовательное разбавление фермента 1:2 (33,9 – 0,271 нМ для NE; 42,6 – 0,333 нМ для CG) в буфере активации (10 мМ Tris-HCl, 500 мМ NaCl при рН 7,5). Буфер активации имеет нейтральный рН и, следовательно, позволяет эффективно протекать ферментативный катализ. Для приготовления наивысшей стандартной концентрации (концентрация NE: 33,9 нМ) разбавляют 1 мкл NE (33,9 мкМ) в 999 мкл буфера активации. Для приготовления второго стандарта (концентрация NE: 16,95 нМ) смешайте 200 мкл первого разбавления с 200 мкл буфера активации. Приступайте соответственно к приготовлению оставшихся разведений 1:2. Последний стандарт, который является пустым, состоит из чистого буфера активации. Рекомендуется измерение технических дубликатов или тройных размеров. Во время стандартной и пробоподготовки старайтесь держать флаконы на льду. Параллельно со стандартным препаратом разводят образцы мокроты в буфер активации. Разбавляют образцы человека перед оценкой их протеазной активности, чтобы они оставались в линейном диапазоне увеличения репортерного сигнала (соотношение донор/акцептор). Если бы образцы пациентов оставались неразбавленными, расщепление происходило бы слишком быстро для надежной подгонки. Поскольку здоровая донорская мокрота содержит меньше активных протеаз по сравнению с образцами от пациентов с муковисцидозом и ХОБЛ, обычно проводятся различные разведения (1:10 для здорового супернатанта мокроты, 1:20-500 для супернатанта мокроты пациентов с ХОБЛ или МУКОВ).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы количественно измерить активность протеазы в образцах, где их концентрация неизвестна, стандартная кривая с известными концентрациями ферментов должна измеряться параллельно, в идеале на одной и той же пластине. Концентрация активного фермента в мокроте человека рассчитывается путем интерполяции склонов, измеренных в образцах мокроты человека, с теми, которые измеряются стандартными кривыми. Перед подготовкой образцов к измерению настройте прибор. Установите длину волны возбуждения для зонда NE FRET (NEmo-114)на 354 нм, а длину волны обнаружения на 400 нм для донора и 490 нм для акцептора. Установите длину волны возбуждения для зонда CG FRET (sSAM15)на 405 нм, а излучение установите на 485 (донор) и 580 нм (акцептор). Добавьте 40 мкл образцов, стандартных или заготовок, в скважины черной пластины с половиной площади 96 скважин. Чтобы приготовить мастер-микс, содержащий репортеры (концентрация репортера в мастер-миксе: 10 мкМ), разбавляют запас зонда (1 мМ в ДМСО) 1:100 в буфере активации. Подготовьте необходимый объем основной смеси, умножив 10 мкл на количество требуемых пластинчатых скважин. Чтобы достичь оптимальной конечной концентрации (2 мкМ) для измерения флуоресценции репортеров NEmo-1 и sSAM, добавьте 10 мкл главной смеси в каждую скважину (содержащую 40 мкл образца, стандартного или пустого) и начните считывание. Поэтому репортеры NEmo-1 и sSAM будут контролировать активность растворимой нейтрофильной эластазы и катепсина G соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Если инжектор реагента недоступен, обязательно запустите считывание как можно скорее после репортерного добавления к образцам. Начинают измерение пластинчатого считывателя и регистрируют увеличение соотношения донор/акцептор каждые 60-90 секунд в течение не менее 20 мин или до тех пор, пока увеличение сигнала не достигнет плато. После экспорта данных рассчитайте соотношение донор/акцептор (отношение D/A), разделив единицы относительной флуоресценции донора (RFU) на акцептор RFU для каждой точки времени и образца. Рассчитайте среднее значение коэффициента D/A и стандартное отклонение каждого образца. Определите наклон в пределах линейного роста изменения отношения D/A. Наклон является индикатором скорости расщепления ферментов для зонда FRET. Рассчитайте концентрацию активного фермента в мокроте, установив склоны линейной регрессии, полученные из образцов человека, с теми, которые рассчитаны по стандарту фермента. Количественная оценка активности NSP с мембраной с помощью флуориметра или анализа считывателя пластин Изолируйте клетки мокроты, как описано выше. Повторное суспенд 3 х10 4 ячейки в объеме 40 мкл PBS. Добавьте ячейки в считыватель пластин хорошо. Настройте инструмент. Установите длину волны возбуждения для мембранно-связанного зонда NE FRET (NEmo-214)на 405 нм, а длину волны обнаружения на 485 нм для донора и 580 нм для акцептора. Установите длину волны возбуждения для мембранно-связанного зонда CG FRET (mSAM15)на 405 нм, а излучение на 485 (донор) и 580 нм (акцептор). Чтобы приготовить мастер-микс, содержащий репортеры, разбавьте запас зонда в буфере активации до концентрации 10 мкМ. Подготовьте необходимый объем основной смеси, умножив на 10 мкл X количество требуемых пластинчатых скважин. Для достижения оптимальной конечной концентрации (2 мкМ) для измерения флуоресценции репортеров NEmo-2 и mSAM добавьте 10 мкл основной смеси в каждую скважину (содержащую 40 мкл образца, стандартного или пустого) и начните считывание. Поэтому репортеры NEmo-2 и mSAM будут контролировать активность нейтрофильной эластазы и катепсина G, связанных с мембраной, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточный отрицательный контроль может быть использован, например, клетками, которые активно не секретируют НСП. Например, инкубация репортеров с 3 х 104 лейкоцитарными прародителями HL-60 промиелоцитарных клеток представляет собой действительный отрицательный контроль расщепления. Регистрировать изменение соотношения донор/акцептор в течение не менее 20 мин или до тех пор, пока увеличение сигнала не достигнет плато. Проанализируйте данные, как описано выше. Измерение активности NSP с мембранной связкой с помощью флуоресцентной микроскопииОпределите количество условий, которые необходимо проанализировать.ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого измерения образца мокроты рекомендуется подготовка и анализ дополнительного положительного (ПК) и отрицательного (NC) контроля. Для каждого измерения повторно суспендирует 3 х10 4 клетки мокроты в объеме 50 мкл PBS в трубке 1,5 мл. В качестве отрицательного контроля инкубируют клетки мокроты со специфическим ингибитором (Sivelestat, специфический ингибитор NE, или ингибитор катепсина G I, специфический ингибитор CG, в конечной концентрации 100 мкМ). Инкубировать в течение 10 мин на РТ. В качестве положительного контроля инкубируют клетки мокроты соответствующим ферментом (NE или CG при 340 нМ или 200 нМ соответственно) в течение 10 мин при РТ. Добавьте 50 мкл PBS, содержащего репортер FRET и ядерное пятно (в конечном разведении 1:1000) в каждую трубку (положительные контрольные обработанные клетки, отрицательные контрольные обработанные клетки и необработанные клетки), чтобы достичь конечной концентрации зонда 2 мкМ. Инкубировать в течение 10-20 мин при RT.ВАЖНО: Добавление ядерного пятна облегчает флуоресцентную микроскопию, поскольку позволяет искать интересующие клетки мокроты без использования зондовых каналов FRET и, следовательно, избежать репортерного отбеливания. Кроме того, пятно ДНК позволяет сегментировать клетки мокроты в соответствии с формой их ядра. Например, нейтрофилы можно легко идентифицировать по их многодольковых ядрам. Также может быть получена дополнительная информация о жизнеспособности клеток (нейтрофилы с более сегментоядерным ядром с большей вероятностью будут живыми).ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к мембраносвязанному, активность ДНК-связанного NE или CG в мокроте человека может быть измерена таким же образом с помощью H-NE и H-CG, внеклеточных ДНК-ассоциирующих зондовFRET 27. При приготовлении мастер-микса H-NE и H-CG могут быть добавлены в концентрации 10 мкМ и инкубированы с мротой перед цитоспином и горкой приготовления. Количественное измерение соотношения D/A на внеклеточной ДНК протекает идентично NEmo-2 и mSAM, с той лишь разницей, что внеклеточные агрегаты ДНК сегментированы вместо одиночных клеток27. Погасите реакцию, добавив 100 мкл ледяного PBS, и перенесите образцы на лед. Цитоспин смеси на микроскопических слайдах, сушка на воздухе, фиксируется ледяным холодным метанолом 10% в течение 10 мин, воздухом сухой и монтируется с соответствующей монтажной средой.ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды микроскопии могут храниться при 4 °C в темноте до одного месяца до дальнейшего анализа. Получение микроскопических изображений с помощью конфокального микроскопа с масляным объективом PL APO 40x или 63x. Для повышения качества изображения и сокращения времени получения рекомендуется использовать режим последовательной получения изображения. Сначала визуйте ядерное пятно через возбуждение 633 нм с помощью гелий-неоново-лазерной линии и запишите его излучение между 650 и 715 нм. Запишите донора (кумарин 343) репортера FRET между 470 и 510 нм при возбуждении на 458 нм с помощью аргонового лазера. Приобретите сенсибилизированное акцепторное (5,6-TAMRA) излучение между 570 и 610 нм после возбуждения единственного донора. Регистрировать прямое акцепторное излучение в отдельном канале между 470 и 510 нм при оптимальном возбуждении акцептора при 561 нм с помощью твердотельного лазера с диодной накачкой (DPSS). Установите точечный отверстие в начале эксперимента и поддерживайте его в течение сеанса визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за их небольшого размера для правильной визуализации нейтрофилов рекомендуется использовать объектив микроскопа 40x или 63x. Обычно изображения получаются в нескольких последовательных каналах, начиная с более длинной длины волны возбуждения, чтобы предотвратить фотоотбеливание репортера во время захвата. Изображение не менее 100 ячеек на условие для окончательной статистики. Для микроскопического анализа изображений используют соответствующее программное обеспечение: сегментируйте ячейки и вычисляйте соотношение D/A на попиксельной основе, после чего вычисляйте среднее или медиану заданной области интереса, которая выбирается пользователем вручную. Репрезентативные результаты см. на рисунке 1. Рисунок 1:Репрезентативные изображения и количественная оценка мембранно-связанной NE-активности на нейтрофилах, выделенных из мокроты пациента с муковисцидозом. a) Репрезентативные конфокальные микроскопические изображения нейтрофилов, предварительно инкубированных (верхняя панель) в течение 10 мин со 100 мкМ Сивелестата (ж/) или оставленных без обработки (без/о) (нижняя панель) перед добавлением репортера NEmo-2 (2 мкМ). В первом столбце слева показано ядерное пятно, во втором — донорский канал, в третьем — акцепторный канал и в последнем — расчетное соотношение D/A, полученное путем деления донорского и акцепторного каналов на попиксельной основе. Границы интересуемой области (одиночный нейтрофил) изображены пунктирной линией. Указаны шкала (10 мкм) и калибровочные стержни (отношение D/A). b)Коробочные и точечные графики, показывающие соотношение D/A нейтрофилов мокроты у репрезентативного пациента с муковисцидозом. Клетки, инкубированные с ингибиторными и необработанными клетками, показаны серым и синим цветом соответственно. Каждая точка представляет одну клетку (N: w/ ингибитор = 113 и без ингибитора = 96). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Измерение активности NSP с мембраной с помощью проточной цитометрии Повторно суспендирует 1 х 106 ячеек в 100 мкл PBS в 5 мл полистирольной трубки FACS с круглым дном и поместите трубку на лед. Для защиты нейтрофилов мокроты используйте следующие антитела: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) и CD66b (1:50). Подготовьте достаточное количество мастер-микса для всех образцов. Поместите мастер-микс на лед в темное время суток. Настройте стратегию гайинга, как описано на рисунке 2. Нейтрофилы закрыты как 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ события. Затем закрытые события будут проанализированы на их мембранно-связанную протеазную активность для их донора (λexc = 405 нм, λem = 450/50 нм) и акцепторной (λexc = 405 нм, λem = 585/42 нм) средней интенсивности флуоресцентной активности (MFIs). Добавьте 2 мкл FcBlock к каждому образцу и инкубируйте в течение 5 минут на RT. Добавьте выбранные антитела в каждую трубку, и высиживая в течение 30 мин на льду в темноте. Промыть клетки, добавив 2 мл холодного PBS, и центрифугу в течение 5 мин при 300 х г и 4 °C. Выбрасывайте супернатант и повторно суспендировали клетки в 200 мкл холодного PBS. Разделите 200 мкл в двух пробирках по 100 мкл в каждой и добавьте 5 мкл раствора для окрашивания жизнеспособности клеток в каждую пробирку. Поместите трубки на лед. Добавьте соответствующий специфический ингибитор NSP (для применения NE Sivelestat при конечной концентрации 225 мкМ, для CG используют ингибитор катепсина G I при 100 мкМ) в отрицательную контрольную (NC) пробирку. Инкубировать образцы на RT в течение 10 мин в темноте. Добавьте 100 мкл холодного PBS в образец, отфильтруйте его через фильтр 40 мкм в чистой трубке FACS, чтобы предотвратить засорение инструмента. Добавьте репортер (для NE, NEmo-2 при конечной концентрации 4 мкМ, для CG, mSAM при конечной концентрации 2 мкМ) к образцу NC, осторожно вихрев трубку. Начните приобретать клетки, инкубированные со специфическим ингибитором, чтобы немного отрегулировать, при необходимости, затворы, а также напряжения репортерных PMT. Регистрируют не менее 1000 нейтрофилов. Держите образец при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя можно записать больше событий, 1000 ячеек обеспечивают хороший компромисс между правильной статистикой и временем записи. Приступайте к следующим пробиркам (необработанным образцам мокроты) соответственно. Чтобы записать изменения в соотношении D/A из-за мембранно-связанной протеазной активности, регистрируют 1000 нейтрофилов из каждой трубки каждые 5-10 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: После успешного декольте репортера FRET интенсивность МФО донорского канала со временем будет увеличиваться. Интенсивность МФИ акцепторного канала должна уменьшаться или оставаться постоянной с течением времени. Рассчитайте коэффициент FRET, разделив донора на значения акцепторного канала для образцов, измеренных на закрытых жизнеспособных одиночных нейтрофилах. Нормализуйте выборочные измерения, разделив их на соответствующую точку времени 0 мин (репрезентативные результаты и анализ см. на рисунке 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Запись по меньшей мере двух временных точек (т.е. 0 и 10 мин) необходима для динамического измерения изменения отношения D/A. Чтобы нормализовать измерение активности для каждого образца, отношение D/A, измеренное в более поздних временных точках (например, 10 мин), делится на отношение, рассчитанное сразу после добавления зонда (0 мин). Рисунок 2:Стратегия гастировки и репрезентативные графики мембранно-связанной NE активности, измеренные на нейтрофилах, выделенных из мокроты пациента с муковисцидозом. Длязащиты нейтрофилов мокроты используются следующие антитела: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) и CD66b (1:50). Нейтрофилы закрыты как 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ события. Закрытые события анализируются для их донора (λexc= 405 нм, λem= 450/50 нм) и акцептора (λexc= 405 нм, λem= 585/42 нм) средней интенсивности флуоресценции (MFIs). b)Репрезентативные гистограммы нейтрофилов мокроты CF, проанализированные на предмет их мембранно-связанной NE активности. Левый столбец показывает сигнал донора, правый столбец показывает сигнал акцептора. Верхняя строка показывает среднюю интенсивность флуоресценции клеток, обработанных Сивелестатом (w/) в течение 10 мин до добавления репортера. В нижнем ряду показаны необработанные (без) клетки, репортерная флуоресценция которых измеряется сразу (0 мин, серый) и 10 мин (синий) после добавления репортера. Нейтрофилы закрыты в соответствии со стратегией, показанной на панели a. c)В таблице данных показан репрезентативный набор данных, состоящий из необработанных МФУ для донора и акцепторного сигнала о нейтрофилах, измеренных в течение нескольких временных точек (0-3-5-10-15-20 мин), а также расчетное соотношение D/A. Соотношение D/A можно нормализовать, т.е. до 0 мин точки времени (белый шрифт). 0 мин указывает на запись, сделанную как можно скорее после добавления репортера в проточную трубку с окрашенными клетками мокроты. Данные МФО показаны как среднее ± стандартного отклонения для 1000 нейтрофилов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.