Создание высокопроизводительной системы эпидермальных сфероидных культур для моделирования пластичности стволовых клеток кератиноцитов
Summary
Здесь мы описываем протокол систематического культивирования эпидермальных сфероидов в 3D суспензии культуры. Этот протокол имеет широкий спектр применений для использования в различных типах эпителиальных тканей и для моделирования нескольких заболеваний и состояний человека.
Abstract
Дисрегуляция эпителия является узлом для различных состояний и заболеваний человека, включая хронические раны, воспаление и более 80% всех видов рака человека. Как подкладочная ткань, эпителий кожи часто подвергается повреждению и эволюционно адаптируется, приобретая клеточную пластичность, необходимую для восстановления поврежденной ткани. На протяжении многих лет было предпринято несколько усилий по изучению эпителиальной пластичности с использованием моделей на основе клеток in vitro и ex vivo. Однако эти усилия были ограничены в их способности рекапитулировать различные фазы пластичности эпителиальных клеток. Здесь мы описываем протокол для генерации 3D-эпидермальных сфероидов и эпидермальных сфероидных клеток из первичных неонатальных кератиноцитов человека. Этот протокол описывает способность эпидермальных сфероидных культур функционально моделировать различные стадии генеративной пластичности кератиноцитов и демонстрирует, что эпидермальное сфероидное повторное покрытие может обогащать гетерогенные культуры нормальных кератиноцитов человека (NHKc) для интегринα6hi/ EGFRlo кератиноцитарных субпопуляций с улучшенными стволовыми характеристиками. В нашем отчете описывается разработка и поддержание высокопроизводительной системы для исследования пластичности кератиноцитов кожи и регенерации эпидермиса.
Introduction
Стратифицированный эпителий млекопитающих является наиболее сложной эпителиальной архитектурой во всех живых системах и чаще всего подвержен повреждениям и травмам. Как защитная ткань, стратифицированный эпителий эволюционировал, чтобы генерировать сложную и эффективную реакцию на повреждение тканей. При травме эти клетки должны активировать программы пластичности линии, которые позволяют им мигрировать в поврежденный участок и проводить ремонт1,2,3. Эта многогранная реакция происходит в несколько последовательных шагов, которые остаются плохо изученными.
Основное препятствие в изучении сложного процесса регенерации эпителия заключается в нехватке высокопроизводительных модельных систем, которые могут захватывать динамическую клеточную активность на определенных этапах регенерации клеток. В то время как мышиные модели in vivo предлагают соответствующее понимание заживления ран и наиболее точно повторяют регенеративный процесс человека, их разработка требует трудоемких усилий и значительных затрат, ограничивая их пропускную способность. Поэтому существует острая необходимость в создании систем, позволяющих проводить функциональное исследование регенерации эпителиальной ткани человека в масштабе высокой пропускной способности.
В последние годы было предпринято несколько попыток решить проблему масштабируемости. Это видно через значительное расширение инновационных моделей на основе клеток in vitro и ex vivo, которые близко имитируют регенеративный контекст in vivo. Это включает в себя достижения в области органа на чипе4,сфероида5,органоида6и органотипических культур7. Каждая из этих 3D-систем на основе ячеек предлагает уникальные преимущества и представляет собой явные экспериментальные ограничения. На сегодняшний день сфероидная культура остается наиболее экономически эффективной и широко используемой моделью 3D-культуры клеток. И хотя в нескольких отчетах указывалось, что сфероидные культуры могут быть использованы для изучения характеристик стволовых клеток кожи, эти исследования в основном проводились с тканями животных8,9или с дермальными фибробластами10,практически без отчетов, полностью характеризующих регенеративные свойства эпидермальных сфероидных культур человека. В этом протоколе мы подробно описываем функциональное развитие, культуру и поддержание эпидермальных сфероидных культур из нормальных кератиноцитов человека (NHKc). Мы также описываем полезность этой системы для моделирования последовательных фаз регенерации эпидермиса и пластичности стволовых клеток кератиноцитов in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование систем 3D-сфероидных культур имело широкую полезность при оценке стволовой анемии. Было продемонстрировано, что эти системы улучшают обогащение тканевых стволовых клеток13,но их полезность для изучения эпидермальных стволовых клеток человека была ограничен…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ресурсный центр UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) предоставил доступ к оборудованию для визуализации и сортировки клеток и технической помощи. Эта работа была частично поддержана грантом 1R21CA201853. MCF и IRF получают частичную поддержку от гранта NIH P20GM103499, SC INBRE. MCF также получает поддержку от гранта NIH P20GM109091. Ивон Воаппи был частично поддержан грантами NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) и R25GM076277 (IMSD), а также стипендией Программы профессоров Грейс Джордан Макфадден в UofSC. Джеральдин Эзека и Джастин Верчеллино были поддержаны грантами NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) в UofSC. Шон М. Блус был поддержан премией Magellan Scholar Award 2016 года в UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Riferimenti
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
