Etablering av et epidermalt sfæroidkultursystem med høy gjennomstrømning for å modellere keratinocytt stamcelleplastisitet
Summary
Her beskriver vi en protokoll for systematisk dyrking av epidermale sfæroider i 3D-suspensjonskultur. Denne protokollen har omfattende applikasjoner for bruk i en rekke epitelvevstyper og for modellering av flere menneskelige sykdommer og forhold.
Abstract
Epitelial dysregulering er en node for en rekke menneskelige tilstander og plager, inkludert kronisk såring, betennelse og over 80% av alle menneskelige kreftformer. Som fôrvev er hudepitelet ofte utsatt for skade og har evolusjonært tilpasset seg ved å skaffe seg den cellulære plastisiteten som er nødvendig for å reparere skadet vev. Gjennom årene har det blitt gjort flere anstrengelser for å studere epitel plastisitet ved hjelp av in vitro og ex vivo cellebaserte modeller. Imidlertid har disse anstrengelsene vært begrenset i deres evne til å rekapitulere de ulike fasene av epitelcelleplastisitet. Vi beskriver her en protokoll for generering av 3D epidermale sfæroider og epidermale sfæroid-avledede celler fra primære neonatale humane keratinocytter. Denne protokollen skisserer kapasiteten til epidermale sfæroidkulturer for å funksjonelt modellere distinkte stadier av keratinocyttisk generativ plastisitet og viser at epidermal sfæroid re-plating kan berike heterogene normale menneskelige keratinocytter (NHKc) kulturer for integrinα6hi/ EGFRlo keratinocytt subpopulations med forbedrede stammelignende egenskaper. Vår rapport beskriver utvikling og vedlikehold av et høyt gjennomstrømningssystem for studiet av hud keratinocyttplastisitet og epidermal regenerering.
Introduction
Pattedyret stratifisert epitel er den mest komplekse epitelarkitekturen i alle levende systemer og er oftest utsatt for skade og skade. Som et beskyttende vev har stratifisert epitel utviklet seg for å generere en kompleks og effektiv vevsskaderespons. Ved skade må disse cellene aktivere plastisitetsprogrammer for avledning, noe som gjør dem i stand til å migrere til det skadede stedet og utføre reparasjon1,2,3. Denne mangefasetterte responsen forekommer i flere sekvensielle trinn som forblir dårlig forstått.
Et stort hinder for å studere den intrikate prosessen med epitelregenerering ligger i den kjære av høy gjennomstrømningsmodellsystemer som kan fange dynamiske cellulære aktiviteter på definerte stadier av celleregenerering. Mens in vivo musemodeller gir relevant innsikt i sårheling og mest rekapitulerer den menneskelige regenerative prosessen, krever deres utvikling arbeidskrevende innsats og betydelige kostnader, noe som begrenser deres gjennomstrømningskapasitet. Det finnes derfor et kritisk behov for å etablere systemer som muliggjør funksjonell undersøkelse av human epitelial vevregenerering i høy gjennomstrømningsskala.
De siste årene har det blitt gjort flere forsøk på å møte skalerbarhetsutfordringen. Dette ses gjennom stor utvidelse av innovative in vitro- og ex vivo-cellebaserte modeller som etterligner den in vivo regenerative konteksten tett. Dette inkluderer fremskritt i organ-on-chip4, sfæroid5, organoid6og organotypiske kulturer7. Disse 3D-cellebaserte systemene tilbyr hver unike fordeler og presenterer tydelige eksperimentelle begrensninger. Til dags dato er sfæroidkultur fortsatt den mest kostnadseffektive og mye brukte 3D-cellekulturmodellen. Og mens flere rapporter har indikert at sfæroidkulturer kan brukes til å studere hudstammecelleegenskaper, har disse studiene i stor grad blitt utført med dyrevev8,9, eller med dermale fibroblaster10, med nesten ingen rapporter som grundig karakteriserer de regenerative egenskapene til menneskelige epidermale sfæroidkulturer. I denne protokollen beskriver vi funksjonell utvikling, kultur og vedlikehold av epidermale sfæroidkulturer fra normale menneskelige keratinocytter (NHKc). Vi beskriver også nytten av dette systemet for å modellere de sekvensielle fasene av epidermal regenerering og keratinocytt stamcelleplastisitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruken av 3D sfæroide kultursystemer har hatt bred nytte for å vurdere cellestamme. Disse systemene har vist seg å forbedre berikelsen av vevsstammeceller13, men deres nytte for studiet av menneskelige epidermale stamceller har blitt begrenset utforsket. Her beskriver vi en strategi for å berike humane keratinocytt stamceller ved hjelp av 3D-kulturteknikker. I dette systemet dyrkes NHKc som selvmontering av multicellulære sfæroidfjæringer, bestående av flere keratinocyttundertyper suspende…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) ga tilgang til bilde- og cellesorteringsutstyr og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd 1R21CA201853. MCF og IRF får delvis støtte fra NIH grant P20GM103499, SC INBRE. MCF får også støtte fra NIH grant P20GM109091. Yvon Woappi ble delvis støttet av NIH grants 2R25GM066526-06A1 (PREP) og R25GM076277 (IMSD), og av et stipend av Grace Jordan McFadden Professors Program ved UofSC. Geraldine Ezeka og Justin Vercellino ble støttet av NIH-tilskudd 2R25GM066526-10A1 (PREP) ved UofSC. Sean M. Bloos ble støttet av Magellan Scholar Award 2016 ved UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Riferimenti
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
