Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.
Abstract
Epitheliale Dysregulation ist ein Knoten für eine Vielzahl von menschlichen Zuständen und Beschwerden, einschließlich chronischer Wunden, Entzündungen und über 80% aller menschlichen Krebsarten. Als Auskleidungsgewebe ist das Hautepithel oft Verletzungen ausgesetzt und hat sich evolutionär angepasst, indem es die zelluläre Plastizität erworben hat, die zur Reparatur von geschädigtem Gewebe erforderlich ist. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um die epitheliale Plastizität mit in vitro und ex vivo zellbasierten Modellen zu untersuchen. Diese Bemühungen waren jedoch in ihrer Fähigkeit, die verschiedenen Phasen der Plastizität von Epithelzellen zu rekapitulieren, begrenzt. Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von 3D-epidermalen Sphäroiden und epidermalen Sphäroidzellen aus primären neonatalen menschlichen Keratinozyten. Dieses Protokoll beschreibt die Fähigkeit epidermaler Sphäroidkulturen, verschiedene Stadien der generativen Plastizität von Keratinozytenfunktionalität funktionell zu modellieren, und zeigt, dass die epidermale Sphäroid-Neubeschichtung heterogene normale menschliche Keratinozytenkulturen (NHKc) für integrinα6hi/EGFRlo Keratinozyten-Subpopulationen mit verbesserten stammähnlichen Eigenschaften anreichern kann. Unser Bericht beschreibt die Entwicklung und Aufrechterhaltung eines Hochdurchsatzsystems zur Untersuchung der Plastizität der Hautkeratinozyten und der epidermalen Regeneration.
Introduction
Das geschichtete Epithel von Säugetieren ist die komplexeste Epithelarchitektur in allen lebenden Systemen und ist am häufigsten Schäden und Verletzungen ausgesetzt. Als Schutzgewebe hat sich das geschichtete Epithel entwickelt, um eine komplexe und effektive Gewebeschadensreaktion zu erzeugen. Bei Verletzungen müssen diese Zellen Linienplastizitätsprogramme aktivieren, die es ihnen ermöglichen, an die verletzte Stelle zu wandern und die Reparatur1,2,3durchzuführen . Diese facettenreiche Reaktion erfolgt in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die noch wenig verstanden werden.
Ein großes Hindernis bei der Untersuchung des komplizierten Prozesses der epithelialen Regeneration liegt im Mangel an Hochdurchsatzmodellsystemen, die dynamische zelluläre Aktivitäten in definierten Stadien der Zellregeneration erfassen können. Während In-vivo-Mausmodelle relevante Einblicke in die Wundheilung bieten und den menschlichen Regenerationsprozess am ehesten rekapitulieren, erfordert ihre Entwicklung mühsame Anstrengungen und erhebliche Kosten, was ihre Durchsatzkapazität einschränkt. Es besteht daher ein kritischer Bedarf an der Etablierung von Systemen, die eine funktionelle Untersuchung der Regeneration von menschlichem Epithelgewebe im Hochdurchsatzbereich ermöglichen.
In den letzten Jahren wurden mehrere Versuche unternommen, die Herausforderung der Skalierbarkeit zu meistern. Dies zeigt sich in der großen Ausweitung innovativer zellbasierter In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, die den regenerativen In-vivo-Kontext genau nachahmen. Dazu gehören Fortschritte bei Organ-on-Chip4, Sphäroid5, Organoid6und organotypischen Kulturen7. Diese zellbasierten 3D-Systeme bieten jeweils einzigartige Vorteile und stellen unterschiedliche experimentelle Einschränkungen dar. Bis heute ist die Sphäroidkultur das kostengünstigste und am weitesten verbreitete 3D-Zellkulturmodell. Und während mehrere Berichte darauf hingewiesen haben, dass Sphäroidkulturen verwendet werden können, um Hautstammzelleigenschaften zu untersuchen, wurden diese Studien größtenteils mit tierischem Gewebe8,9oder mit dermalen Fibroblasten10durchgeführt, wobei praktisch keine Berichte die regenerativen Eigenschaften menschlicher epidermaler Sphäroidkulturen gründlich charakterisieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die funktionelle Entwicklung, Kultur und Aufrechterhaltung epidermaler Sphäroidkulturen aus normalen menschlichen Keratinozyten (NHKc). Wir beschreiben auch den Nutzen dieses Systems, um die sequentiellen Phasen der epidermalen Regeneration und der Plastizität von Keratinozytenstammzellen in vitro zu modellieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von 3D-Sphäroidkultursystemen hat einen breiten Nutzen bei der Beurteilung der Zellstammhaftigkeit. Es wurde gezeigt, dass diese Systeme die Anreicherung von Gewebestammzellenverbessern 13, aber ihr Nutzen für die Untersuchung menschlicher epidermaler Stammzellen wurde nur begrenzt untersucht. Hier beschreiben wir eine Strategie zur Anreicherung menschlicher Keratinozyten-Stammzellen mittels 3D-Kulturtechniken. In diesem System werden NHKc als selbstorganisierende mehrzellige Sph?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bot Zugang zu Bildgebungs- und Zellsortiergeräten sowie technischer Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Förderung 1R21CA201853 unterstützt. Das MCF und das IRF erhalten teilweise Unterstützung durch den NIH-Zuschuss P20GM103499, SC INBRE. Das MCF erhält auch Unterstützung durch den NIH-Zuschuss P20GM109091. Yvon Woappi wurde teilweise durch NIH-Stipendien 2R25GM066526-06A1 (PREP) und R25GM076277 (IMSD) sowie durch ein Stipendium des Grace Jordan McFadden Professors Program an der UofSC unterstützt. Geraldine Ezeka und Justin Vercellino wurden durch NIH-Zuschüsse 2R25GM066526-10A1 (PREP) an der UofSC unterstützt. Sean M. Bloos wurde mit dem Magellan Scholar Award 2016 an der UofSC unterstützt.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Riferimenti
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