Etablering af en høj gennemløb Epidermal Spheroid Kultur System til Model Keratinocyte Stamcelle Plasticitet
Summary
Her beskriver vi en protokol til systematisk dyrkning af epidermale sfæroider i 3D-suspensionskultur. Denne protokol har vidtrækkende anvendelser til brug i en række epitelvævstyper og til modellering af flere menneskelige sygdomme og tilstande.
Abstract
Epitel dysregulering er en node for en række menneskelige tilstande og lidelser, herunder kronisk sår, betændelse, og over 80% af alle humane kræftformer. Som en foring væv, huden epitel er ofte udsat for skade og har evolutionært tilpasset ved at erhverve den cellulære plasticitet er nødvendige for at reparere beskadiget væv. I årenes løb er der gjort en stor indsats for at studere epitelisk plasticitet ved hjælp af in vitro- og ex vivo-cellebaserede modeller. Disse bestræbelser har imidlertid været begrænsede i deres evne til at sammenfatte de forskellige faser af epitelcelleplastik. Vi beskriver her en protokol til generering af 3D epidermale sfæroider og epidermale sfæroide-afledte celler fra primære neonatal menneskelige keratinocytter. Denne protokol skitserer kapaciteten af epidermale sfæroid kulturer til funktionelt model forskellige stadier af keratinocyt generative plasticitet og viser, at epidermal sfæroid re-plating kan berige heterogene normale menneskelige keratinocytter (NHKc) kulturer for integrinα6hi/ EGFRlo keratinocyte subpopulationer med forbedret stilk-lignende egenskaber. Vores rapport beskriver udviklingen og vedligeholdelsen af et høj gennemløbssystem til undersøgelse af hudens keratinocyt plasticitet og epidermal regenerering.
Introduction
Det stratificerede epitel fra pattedyr er den mest komplekse epitelarkitektur i alle levende systemer og er oftest udsat for skader og skader. Som et beskyttende væv, stratificeret epitel har udviklet sig til at generere en kompleks og effektiv vævsskade respons. Ved skade skal disse celler aktivere afstamningsplastikprogrammer, som gør det muligt for dem at migrere til det skadede sted og udføre reparation1,2,3. Denne mangefacetterede reaktion forekommer i flere sekventielle trin, som forbliver dårligt forstået.
En væsentlig hindring i at studere den indviklede proces med epitel regenerering ligger i manglen på høj gennemløb modelsystemer, der kan fange dynamiske cellulære aktiviteter på definerede stadier af celle regenerering. Mens in vivo musemodeller giver relevant indsigt i sårheling og bedst opsummerer den menneskelige regenerative proces, kræver deres udvikling en møjsommelig indsats og betydelige omkostninger, hvilket begrænser deres gennemløbskapacitet. Der er derfor et kritisk behov for at etablere systemer, der muliggør funktionel undersøgelse af regenerering af humant epitelvæv ved høj gennemstrømningsskala.
I de senere år er der gjort adskillige forsøg på at tage udfordringen med skalerbarhed op. Dette ses gennem en stor udvidelse af innovative in vitro- og ex vivo-cellebaserede modeller, der nøje efterligner den in vivo-regenerative kontekst. Dette omfatter fremskridt inden for organ-on-chip4, sfæroid5, organoid6og organotypiske kulturer7. Disse 3D cellebaserede systemer tilbyder hver især unikke fordele og præsenterer forskellige eksperimentelle begrænsninger. Til dato er sfæroidkultur fortsat den mest omkostningseffektive og udbredte 3D-cellekulturmodel. Og mens flere rapporter har indikeret, at sfæroidkulturer kan bruges til at studere hudstamcelleegenskaber, er disse undersøgelser stort set blevet udført med dyrevæv8,9, eller med dermale fibroblaster10, med næsten ingen rapporter, der grundigt karakteriserer de regenerative egenskaber hos menneskelige epidermale sfæroidkulturer. I denne protokol beskriver vi den funktionelle udvikling, kultur og vedligeholdelse af epidermale sfæroide kulturer fra normale menneskelige keratinocytter (NHKc). Vi beskriver ligeledes nytten af dette system til at modellere de sekventielle faser af epidermal regenerering og keratinocyt stamcelle plasticitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af 3D-sfæroidkultursystemer har haft bred nytte ved vurderingen af cellestamme. Disse systemer har vist sig at øge berigelsen af vævsstamceller13, men deres nytteværdi for studiet af humane epidermale stamceller er blevet begrænset undersøgt. Her beskriver vi en strategi for berigelse af menneskelige keratinocyt stamceller ved hjælp af 3D-kulturteknikker. I dette system dyrkes NHKc som selvsamlende multicellulære sfæroidaffjedringer, der består af flere keratinocytundertyper suspe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) gav adgang til billedbehandlings- og cellesorteringsudstyr og teknisk bistand. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud 1R21CA201853. MCF og IRF modtager delvis støtte fra NIH-tilskuddet P20GM103499, SC INBRE. MCF modtager også støtte fra NIH-tilskud P20GM109091. Yvon Woappi blev delvist støttet af NIH-tilskud 2R25GM066526-06A1 (PREP) og R25GM076277 (IMSD) og af et stipendium af Grace Jordan McFadden Professors Program på UofSC. Geraldine Ezeka og Justin Vercellino blev støttet af NIH tilskud 2R25GM066526-10A1 (PREP) på UofSC. Sean M. Bloos blev støttet af Magellan Scholar Award 2016 på UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Riferimenti
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
