Этот протокол описывает подход к маркировке in toto и многомерной визуализации раннего развития глаз рыбок данио. Мы описываем маркировку, встраивание и четырехмерную (4D) визуализацию с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, а также соображения по оптимизации сбора наборов данных для препарирования механизмов морфогенеза оптической чашки.
Функция зрительной системы требует установления точных тканевых и органных структур. В глазу позвоночных структурные дефекты являются распространенной причиной нарушения зрения, но механизмы морфогенеза глаза все еще плохо изучены. Основная организация эмбрионального глаза сохраняется во всех позвоночных, поэтому живая визуализация эмбрионов рыбок данио стала мощным подходом для непосредственного наблюдения за развитием глаз в режиме реального времени в нормальных и патологических условиях. Динамические клеточные процессы, включая движения, морфологию, взаимодействия, деление и смерть, могут быть визуализированы в эмбрионе. Разработаны методы равномерной маркировки субклеточных структур и конфокальной микроскопии раннего развития глаз у рыбок данио. Этот протокол описывает метод генерации закрытой мРНК для инъекции в 1-клеточный эмбрион рыбки данио, установки эмбрионов на стадии зрительного везикулы (~ 12 часов после оплодотворения, hpf) и выполнения многомерной таймлапсной визуализации морфогенеза оптической чашечки на лазерном сканируемом конфокальном микроскопе, так что несколько наборов данных приобретаются последовательно в одном сеансе визуализации. Такой подход дает данные, которые могут быть использованы для различных целей, включая отслеживание клеток, измерения объема, трехмерный (3D) рендеринг и визуализацию. Наши подходы позволяют нам точно определить клеточные и молекулярные механизмы, стимулирующие развитие оптической чашки, как в условиях дикого типа, так и в условиях генетического мутанта. Эти методы могут быть использованы непосредственно другими группами или адаптированы для визуализации многих дополнительных аспектов развития глаз рыбок данио.
Развитие глаз позвоночных начинается с возникновения или уклонения зрительных везикул из проспективного нейроэпителия мозга. Затем зрительные везикулы претерпевают ряд изменений формы тканей, удлиняются, а затем инвагинируются для создания оптической чашки. В оптической чашке нервная сетчатка и пигментный эпителий сетчатки, полученные из нейроэпителия, обертывают зарождающуюся линзу, которая получена из поверхностной эктодермы. Весь процесс требует сложной серии клеточных и тканевых движений и молекулярной сигнализации, скоординированной между популяциями нейроэпителия, эктодермы и мезенхимальных клеток. Эти первоначальные события устанавливают основную структуру глаза, а более поздние этапы развития глаза, включая формирование радужной оболочки и роговицы, являются разработками ранней организации. Нарушения раннего развития глаз и морфогенеза лежат в основе многочисленных нарушений зрения у людей, включая анофтальмию, микрофтальмию и колобому. Раскрытие клеточных и молекулярных механизмов, управляющих морфогенезом оптической чашечки, имеет решающее значение для дальнейшего понимания развития зрительной системы и патологических состояний, которые возникают, когда эти процессы идут наперекосяк.
Наше понимание развития и морфогенеза глаз позвоночных возникло из огромного количества работ, охватывающих классические гистологические исследования до эмбриологических и генетических подходов в различных модельных организмах, включая мышь, цыпленка, лягушку ирыбу 1,2,3,4,5. В то время как эта работа установила молекулярные механизмы, которые регулируют раннее развитие глаз, исторически существует плохое понимание морфогенеза глаза: появление его 3D-структуры. Основная часть этих результатов была получена из визуализации секционированных эмбрионов в дискретных временных точках. Хотя этого достаточно, чтобы обеспечить представление о морфологии ткани в 2 измерениях, морфогенез является динамичным, 3D-процессом. Чтобы определить, как форма ткани изменяется в 3 измерениях с течением времени, как ведут себя отдельные клетки и как это поведение способствует изменениям в форме 3D-ткани, необходимы различные подходы.
Одним из решений для устранения этого значительного пробела в знаниях является живая визуализация, которая позволяет динамически наблюдать за клетками и тканями в режиме реального времени, когда орган принимает форму. К сожалению, это неосуществимо во многих модельных организмах из-за ограничений эмбрионального развития. Например, эмбрионы мышей и цыплят (развивающиеся в утробе матери или в яичной скорлупе) нелегко доступны, и многие живые эмбрионы не являются оптически прозрачными, вызывая значительное рассеяние света и ограничивая глубину, на которую могут быть получены изображения. Рыбки данио, с внешним развитием и прозрачными эмбрионами, предоставляют уникальную возможность проводить живую визуализацию морфогенеза глаза6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Также доступны обширные трансгенные и мутантные линии, а также инструменты для генерации новых трансгенов и мутантов20,21,22,23,24. Кроме того, морфогенез зрительной чашки происходит быстро у рыбок данио, в течение 12 часов (12-24 часа после оплодотворения, hpf), что делает возможным визуализацию всего процесса.
Усилия по визуализации в реальном времени были ускоряются расширением и оптимизацией семейства флуоресцентных белков, которые позволяют генетически кодировать жизненно важную маркировку субклеточных структур, а также улучшениями и инновациями в методах микроскопии. Протокол, описанный здесь, использует лазерную сканирующую конфокальную микроскопию, а не другие современные подходы к визуализации эмбриогенеза рыбок данио, включая конфокальную микроскопию вращающегося диска, селективную микроскопию плоскостного освещения (SPIM и ее варианты) и другие более специализированные методы микроскопии. Для развивающегося глаза рыбки данио мы обнаружили, что конфокальной микроскопии вращающегося диска было недостаточно для визуализации глубже в ткани. Хотя SPIM может похвастаться чрезвычайно быстрым временем обработки изображений и становится все более широко используемым, обработка больших наборов данных для визуализации и анализа остается проблемой. Напротив, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия легко доступна, особенно для людей, не имеющих опыта в сборке оптического оборудования. Мы надеемся, что широкая доступность лазерной сканирующей конфокальной микроскопии сделает наш протокол полезным для многих лабораторий.
Здесь мы описываем наш метод захвата 4D-наборов данных морфогенеза оптической чашки, используя in toto маркировку эмбриона для мембран и хроматина, и лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения изображения (схематизировано на рисунке 1). Флуоресцентные белки, используемые здесь (EGFP-CAAX и H2A. F/Z-mCherry) были выбраны для обеспечения маркировки тканей с разрешением одной клетки. Мы используем наборы данных, сгенерированные с помощью этого протокола, для различных функций анализа и визуализации изображений. Этот протокол может быть легко адаптирован, если желательны другие субклеточные структуры. Для визуализации формы клетки была выбрана маркировка плазматической мембраны: мы используем EGFP-CAAX, в которой последние 21 аминокислота H-ras, служащая последовательностью сигналов пренилирования, сливается с С-концем EGFP13. Другие флуоресцентные белки, нацеленные на плазматическую мембрану (например, трансмембранное слияние или миристоилированные), вероятно, будут работать так же хорошо. Чтобы пометить ядра, мы выбрали H2A. F/Z-mCherry, в котором mCherry сливается с гистоновым белком13. Это гарантирует, что деление клеток, включая ориентацию митотического веретенника, легко визуализируется.
При любом подходе к визуализации в реальном времени необходимо учитывать компромиссы между увеличением скорости изображения при максимизации отношения сигнал-шум, осевого разрешения и сохранения образца. Мы оптимизировали наши методы, чтобы максимизировать качество изображения и количество эмбрионов, которые могут быть изображены за один прогону. Часто цель состоит в том, чтобы изобразить морфогенез оптической чашечки у гомозиготного мутантного эмбриона, который может быть фенотипически неотличим от дикого типа в начале морфогенеза оптической чашечки и потомства гетерозиготного скрещивания (25% эмбрионов являются желаемым генотипом). Оптимизируя, а затем мультиплексируя получение изображения, повышается вероятность захвата набора данных гомозиготного мутантного эмбриона.
Временное разрешение или частота получения объемных данных (Z-стеков) является ключевым аспектом таймлапс-визуализации. В зависимости от назначения таких наборов данных существуют различные требования к скорости. Первоначально этот протокол был разработан для ручного отслеживания 4D-клеток. Отслеживание отдельных клеток в равномерно меченной ткани требует достаточно высокого временного разрешения, чтобы обеспечить уверенность в том, что какая-либо одна клетка непрерывно отслеживается с течением времени. Мы обнаружили, что Z-стеки морфогенеза зрительной чашки рыбок данио должны приобретаться не реже чем каждые 3,1 мин в течение 12 ч; Здесь мы оптимизировали наше приобретение на лазерном сканируруемом конфокальном микроскопе таким образом, что мы можем получать Z-стеки из 4-5 эмбрионов каждые 2,5 мин.
Установление размера Z-шага было решающим шагом в оптимизации протокола: для 3D-рендеринга и визуализации идеальны изотропные данные, в которых размер Z-шага равен размеру пикселя XY. На самом деле, чрезвычайно трудно получить такие данные таймлапса с живыми образцами, учитывая ограничения со временем визуализации и фотоотбеливанием. Поэтому определение адекватного размера Z-шага важно для рендеринга и визуализации потребностей эксперимента, и, в частности, для максимизации осевой информации при сохранении скорости и предотвращении фотоотбеливания необходимо соотношение X:Y:Z. Для этого протокола установленное соотношение вокселя составляло 1:1:3,5 (0,6 мкм x 0,6 мкм x 2,1 мкм Z-шаговый размер с использованием 40-кратного объектива погружения в воду на большое рабочее расстояние). При получении Z-глубины 130-140 мкм это дает объемные данные с подходящим временным разрешением и небольшим фотоотбеливанием.
Как обсуждалось выше, этот протокол является специфическим для 4D-визуализации морфогенеза оптической чашки рыбок данио, с использованием эмбрионов в toto, помеченных для плазматической мембраны и хроматина, а также лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Приведенный ниже протокол может быть легко адаптирован для различных экспериментов и потребностей. Во-первых, в отношении субклеточных структур можно визуазировать любую структуру, для которой существует маркер живой клетки. Далее, хотя основное внимание здесь уделяется исключительно морфогенезу оптической чашечки, таймлапсная визуализация может быть адаптирована для других стадий развития глаза, например, нейрогенеза25,26, 27,28, 29,30,31,32,33. Для визуализации более позднего развития может потребоваться рассмотреть иммобилизацию эмбриона (поскольку спонтанная мышечная активность начинается около 24 л.с.ф.), пигментацию (которая начинает проявляться около 24 л.с.ф.), размер ткани (глаз значительно увеличивается в объеме во время нейрогенеза) и скорость визуализации (которая должна быть скорректирована в зависимости от скорости интересующего процесса). Всеми этими соображениями можно легко управлять. Протокол достаточно гибкий; В дополнение к деталям конкретного протокола здесь, есть общие принципы, которые помогут тем, кто заинтересован в живой визуализации других аспектов развития глаз.
Здесь мы описываем протокол для маркировки in toto и 4D-визуализации таймлапса морфогенеза оптической чашки. Мы проходим через процесс генерации закрытой РНК, кодирующей флуоресцентные белки, для маркировки различных субклеточных компартментов; инъекции 1-клеточных эмбрионов рыбок данио; встраивание 11 эмбрионов HPF в агарозу для мультиплексированной визуализации; и получение 4D-наборов данных нескольких эмбрионов на время морфогенеза оптической чашки (12–24 л.с.ф.).
С помощью этих наборов данных с большим количеством информации можно ответить на множество вопросов. 4D-данные могут быть визуализированы и количественно проанализированы различными способами. Хотя это выходит за рамки этого протокола, мы включаем здесь некоторые из наших целей и стандартных приложений в качестве примера типов вещей, которые могут быть достигнуты. Конечно, методы количественного анализа изображений постоянно разрабатываются, и могут использоваться как коммерчески доступные, так и специально созданные инструменты. Если кто-то не использовал такие методы раньше, он должен быть готов проработать некоторую оптимизацию, чтобы убедиться, что полученные наборы данных адекватны для количественного анализа.
Визуализация и количественная оценка наборов данных 4D может быть сложной задачей из-за размера файлов. Программное обеспечение для сбора может использоваться для разделения наборов данных на отдельные эмбрионы, а ImageJ / Fiji может использоваться для преобразования конфокальных файлов из коммерческих форматов в более стандартные стеки tif, в которых каждая точка времени сохраняется как отдельный файл. Это уменьшит размеры файлов и стандартизирует форматы файлов. Отдельные оптические секции от каждой точки времени могут быть собраны в виде 2D (XY) таймлапса с использованием ImageJ / Fiji, что обеспечивает быструю 2D-визуализацию и оценку данных. Фильм 1 является примером именно этого: один оптический срез с течением времени, собранный как таймлапс оптимального образца, показанного на рисунке 4I–I”’. Оттуда, для 3D и 4D визуализации, мы обычно используем FluoRender35,36, который находится в свободном доступе, но имеет конкретные требования к видеокарте. С помощью FluoRender можно поворачивать 3D-визуализированные данные по любой оси, визуализировать набор данных в 4D с течением времени, генерировать вырезы в любой плоскости и сохранять повороты и визуализации в виде фильма или серии изображений tif.
С точки зрения количественного анализа, есть множество вопросов, на которые нужно ответить. Мы разработали собственное программное обеспечение, чтобы помочь нашим собственным конкретным целям понимания поведения клеток, лежащего в основе морфогенеза оптической чашки. Наша программа, LongTracker, использует ядерный сигнал в качестве прокси для позиции для отслеживания ячеек13. С помощью этих данных мы можем определить, когда, где и как движутся клетки; как быстро и как далеко движутся клетки; и как часто клетки делятся. В дополнение к нашему собственному программному обеспечению, существует несколько коммерчески доступных и изготовленных на заказ вариантов отслеживания 4D-клеток. Мы также разработали программу LongAxis для проведения сегментации клеток и количественной оценки формы и организации клеток в нейронной сетчатке37. Однако наборы данных, вводимые в LongAxis, представляют собой одиночные Z-стеки, взятые с высоким разрешением. Постоянной проблемой является создание наборов данных таймлапса с достаточно высоким разрешением, чтобы клетки можно было сегментировать с уверенностью, а их морфологию экстраполировать. Одной из альтернатив является мозаичная (разреженная) маркировка с использованием фотоконвертируемого флуорофора, такого как Kaede, для прямой визуализации формы клеток, как мы и другие проводили в развивающемся глазу8,11,13. Это упрощает задачу сегментации клеток, а форма и размер клеток могут быть легко количественно определены с помощью 3D-рендеринга в FluoRender.
Каждый шаг этого протокола был оптимизирован специально для наших целей. Специфика этого протокола приводит к нескольким ограничениям: протокол, как написано, не оптимизирован для визуализации других аспектов развития глаз рыбок данио (таких как нейрогенез сетчатки), других глазных структур, других стадий развития или других субклеточных компартментов. Ориентация внедрения, скорость визуализации и метки — все это предназначено для того, чтобы мы могли ответить на наши биологические вопросы. Например, для того, чтобы изобразить нейрогенез сетчатки, дорсальная ориентация эмбриона, описанная здесь, может не позволять визуализировать конкретные особенности, представляющие интерес, и скорость визуализации может быть не подходящей. Многие аспекты протокола могут быть адаптированы и изменены для различных потребностей, в зависимости от конкретных интересов и целей. Во-первых, использование инъекций РНК делает процесс маркировки очень гибким. Флуоресцентные конструкции слияния белков могут быть использованы для маркировки субклеточных структур, представляющих интерес, а количество инъекций РНК может быть изменено для оптимизации маркировки. Основываясь на нашей работе с фотоконвертируемым флуорофором Kaede, инъекции РНК, по-видимому, поддерживают всплеск трансляции, который заканчивается на 12 л.с.11,13. Высокие уровни экспрессии флуоресцентного белка от инъекции РНК могут бороться с фотоотбеливанием, но такой подход не поддерживает устойчивую экспрессию интересующей флуоресцентной метки. Если необходима устойчивая экспрессия, например, при визуализации эмбрионов на более поздних стадиях, трансгенные линии являются вариантом, а построение новых линий у рыбок данио является простым24.
Далее протокол может быть адаптирован для более поздних стадий разработки. Поскольку пигмент может препятствовать визуализации на более поздних стадиях, эмбрионы можно лечить фенилтиомочевиной (ПТУ) для ингибирования образования пигмента, или можно использовать генетические мутанты для синтеза пигмента. Чтобы предотвратить подергивание эмбриона, трикаин может быть добавлен к растворам наложения агарозы и эмбриональной среды, а процент агарозы может быть скорректирован по мере необходимости. По мере роста глаза может потребоваться изменение ориентации крепления; здесь мы монтируем эмбрионы дорсально, но на более поздних стадиях может иметь смысл монтировать латерально или с передней частью, в зависимости от интересующей структуры. Поскольку различные процессы происходят в разных пространственных и временных масштабах, можно также оптимизировать Z-шаг и временной шаг получения изображения. Эти особенности действительно могут быть определены только эмпирически для потребностей каждой лаборатории.
Наконец, этот протокол был разработан специально для лазерного сканирующего конфокального микроскопа, с эмбрионами, встроенными в относительно высокий процент агарозы на ранней стадии развития глаз. Если кто-то проводит визуализацию в разное время или в разных местах во время развития глаз, этот протокол необходимо будет адаптировать для интересуя. В настоящее время возможно множество различных подходов к визуализации, причем другие разрабатываются оптическими инженерами. Каждый подход приносит свой собственный набор проблем, от различных способов встраивания и монтирования эмбрионов для визуализации, до различных размеров файлов и форматов. Мы излагаем соображения во введении, чтобы направлять процесс оптимизации, в котором максимальное пространственное и временное разрешение сбалансировано с фотоотбеливанием, фототоксичностью и огромными размерами файлов. Мы надеемся, что эти общие принципы, в дополнение к практической информации, описанной выше, помогут другим в создании подходов к визуализации таймлапса для изучения многих открытых вопросов в развитии глаз.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны бывшим и нынешним членам Kwan Lab за работу над подходами к таймлапсу и обсуждения этого протокола. Эта работа была поддержана NIH (R01 EY025378 и R01 EY025780 для KMK; F31 EY030758 в SL; и T32 GM007464 в MAC).
Delta TPG Dish 0.17mm clear | Bioptechs | 0420041500C | coverglass bottom for optical compatibility |
Disposable Pasteur Pipettes | VWR | 14672-608 | overall length 14.6 cm (53/4") |
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter | P-97 | |
Immersol W | Carl Zeiss Microscopy | 4449690000000 | immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence |
Microinjection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side. |
Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL |
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature. |
Nikon SMZ645 Stereo Microscope | Nikon | SMZ645 | used for injecting embryos (see Fig. 2B) |
NotI-HF enzyme | NEB | R3189S | comes with Gel Loading Dye, Purple (6X) |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | fine resolution, low melt agarose |
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 | Carl Zeiss Microscopy | 421867-9970-000 | |
Olympus SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX2-ZB16 | used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A) |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested |
Pico-liter Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold |
Pipette Pump Pipettor | SP Bel-Art | F37898 | fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying |
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | 1.0 x 0.78 mm |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml) |
RNase-free H2O | Invitrogen | AM9906 | DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers |
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9000-000 | |
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9030-000 | |
Zeiss LSM 880 with Airyscan | Carl Zeiss Microscopy | N/A | inverted Axio Observer microscope |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss |