제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

제브라피쉬를 사용하여 여기에 설명된 모든 방법은 크리스틴 콴 박사의 동물 프로토콜인 “제브라피시의 시각 시스템 개발의 세포 및 분자 메커니즘”에 적용되며 유타 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 1. 캡된 RNA 합성 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성합니다. 반응 혼합물의 100 μL 부피에서 DNA의 10 μg를 소화하여 DNA 템플릿을 선형화합니다. 일반적인 반응은 다음과 같이 조립됩니다 : 효소 의 3 μL및 완충제의 10 μL을 사용하여 10 μg DNA를 소화하고, 물로 100 μL에 반응 부피를 가져옵니다.참고: 다이제스트를 위한 일반적인 템플릿은 pCS2 벡터, 예를 들어 pCS2-EGFP-CAAX 또는 pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry 에 기재된 멤브레인 및 크로마틴 라벨링이다. 이 경우, 플라스미드 DN은 각각 효소 NotI를 사용하여 소화된다. 사용자는 스타 활동에 주의해야 합니다. 이 경우 고충실도 효소를 권장하고 시판됩니다. DNA가 완성되도록 밤새 37°C에서 반응을 배양하여 DNA가 완성되도록 한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 제한 소화를 정리합니다. 30 μL ddH2O.로 DNA를 엘테우트 -20°C에 선형화된 DNA를 저장하고 필요에 따라 사용하십시오.참고: 소화된 DNA의 양과 용출 부피수약 0.3 μg/μL; 이것은 기본으로 DNA의 ~2 μg를 사용하여 각 라운드에서 시험관 내 전사의 ~ 5 라운드에 충분하다. 시험관 내 전사 키트를 사용하여 RNA를 덮었다. 여기에 설명된 대로 pCS2 템플릿의 경우 SP6 키트를 사용합니다. 다음과 같이 체외 전사 반응을 조립하십시오: DNA 템플릿의 2 μg 또는 10x 반응 버퍼의 2 μL, 2x 리보뉴클레오티드 믹스의 10 μL, 10x 효소 믹스의 2 μL로 최대 6 μL까지 분해합니다. 2-4 시간 이상 37 °C에서 배양하십시오 (더 긴 시간은 더 큰 수율로 이어질 것입니다). 원하는 경우, 효소 믹스의 1 μL은 인큐베이션 기간을 통해 중간에 보충 될 수있다. RNase 가 없는 DNase의 1 μL을 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 DNA 템플릿을 소화합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 덮인 RNA를정화합니다(재료 표 참조). RNase 프리 H2O의 100 μL와 엘루트.참고: 이 응용 프로그램에는 β-메르카토에탄올을 추가할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 간단하지만, 대체 시약은 RNA를 정화하는 데 사용할 수도 있습니다. RNA를 침전시합니다. 3M RNase 프리 NaOAc의 10 μL과 2.5부량(~275 μL)의 얼음-차가운 RNase 프리 100% EtOH를 용출된 RNA에 추가합니다. 15-30 분 동안 -20 °C에서 반응을 배양합니다. RNA를 펠릿4°C에서 고속으로 15분 동안 회전시키십시오.참고: 펠릿은 튜브 벽에 표시되어야 합니다. 펠릿이 스핀의 끝에 있어야 하는 위치를 예측하기 위해 튜브가 이 단계에서 원심분리기에 어떻게 정렬되는지 주목하는 것이 도움이 됩니다. 주사기로 EtOH를 조심스럽게 제거하여 가열, 과다 건조 또는 펠릿을 탈취하지 않도록 주의하십시오. RNase 프리 H2O의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 합성이 성공적이라는 것을 확인하기 위해 RNA를 확인하십시오. 1 μL을 사용하여 분광계에 농도를 분석하고 1% 아가로즈 젤에 0.5 μL을 실행하여 저분자 계수 얼룩이 아닌 하나 또는 두 개의 이산 밴드를 확인합니다. 시험관 내 전사 반응의 수율은 ~1 μg/μL이어야 한다. 알리쿼트 및 RNA를 -20°C 또는 -80°C에서 저장한다. RNA는 주사 직전까지 희석되지 않습니다. 2. 1 세포 제브라피시 배아의 미세 주입 참고: RNA 당 200-300 pg를 주입하여 광학 컵 형태 발생 을 통해 크로마틴 및 세포막의 유비쿼터스 발현을 얻습니다. RNA 희석의 5-10 μL을 준비하고 2.5-5 μL/바늘을 적재합니다. 바늘이 파손되는 경우에 추가 계획을 세우게 됩니다. 주사에 대한 사전 준비. 미세 주입을 위한 1 세포 배아의 정렬 및 방향을 용이하게 하기 위하여 사출 금형 접시를 준비합니다. E3(표준 배아 매체)에 2% 아가로즈를 녹여 페트리 접시에 붓습니다. 뜨거운 아가로즈 의 상단에 사출 몰드 (재료의 표참조)를 조심스럽게 띄워 아가로즈의 트로프의 각인을 생성하여 고화시킵니다. 아가로즈가 고화되면 사출 몰드를 제거합니다.참고: 사출 금형 접시는 몇 달 동안 사용할 수 있습니다. E3에 커버 하고 사용하지 않을 때는 4°C로 보관하십시오. 미세 주입 바늘을 당깁니다. 긴 테이퍼에 유리 모세 혈관을 당겨 바늘 풀러 기계를 사용하여 미세 주입 바늘을 만듭니다. 사용되는 모세 혈관의 유형에 따라 기계를 프로그래밍합니다. 1.0 x 0.78 mm borosilicate 모세혈관은 다음과 같은 프로그램을 사용합니다: 열 = 546°C, 풀 = 130, 속도 = 70, 시간 = 90(그림 2F). 페트리 접시에 바늘을 저장하고 모델링 점토로 고정합니다.참고: 당기기 레시피는 기계와 필라멘트에 따라 다르며 새로운 필라멘트는 항상 보정해야 합니다. 당기기의 각 라운드는 두 개의 바늘을 생성(그림 2G); 우발적 인 휴식과 미래의 실험의 경우 충분한 바늘을 생산하기 위해 여러 번이 작업을 수행합니다. 주사를 위해 덮인 RNA를 희석시킵니다. EGFP-CAAX와 H2A-mCherry RNA를 RNase-free H2O 및 페놀 레드의 1 μL을 사용하여 200-300 ng/μL 농도를 총 5 μL(페놀 레드의 최종 농도는 0.1%)으로 희석한다. 혼합물을 플릭하고 잠시 아래로 회전하여 총 부피를 수집합니다. 주입하기 전에 희석 된 RNA를 얼음 위에 유지하십시오. 1 세포 배아의 주입 물고기가 번식하기 시작하면 15-20 분 동안 계란이 수정되도록하십시오. 이 시간 동안, P10 및 P10 마이크로 로더 팁을 사용하여 RNA 희석의 2.5-5 μL로 바늘을 역로드한다. 피코인젝터를 사용하여, 안면 망상을 사용하여 바늘을 보정 (마이크로 미터 교정 슬라이드도 충분하다) 액적의 부피를 측정하기 위해 (구의 부피 = (4/3) * pi * 반경 ^3). 사출 부피가 1nL(도2I)인주사 시간과 압력을 조정한다. 롤러/이송 파이펫으로 계란을 사출 몰드(도2J)에조심스럽게 적재합니다. 도움이 되는 경우, 집게를 사용하여 주사 전이나 주사 중에 단일 세포가 보이는 배아를 굴리게 하십시오. 마이크로 조작기를 사용하는 것이 사용자의 기본 설정입니다. 노른자가 아닌 세포를 표적으로 하는 1 세포 단계에서 배아를 주입한다(도2M). 이것은 발전 태아의 균일한 라벨링을 보장할 것입니다. 원하는 단계로 배아를 올립니다 (표준 스테이징34에따르면 12 hpf 이전). 주입된 배아는 발달이 지연되므로 시간을 만회하기 위해 약간 더 높은 온도(29.0-29.5°C)로 올립니다. 오후에는 배아를 확인하고 죽은 배아를 제거하여 클러치의 건강을 유지하십시오. 3. 타임랩스 이미징을 위한 광학 소포 스테이지 제브라피시 배아 장착 장착하기 전에 E3에서 1.6% 저용 아가로즈를 준비하십시오. 여러 이미징 실험을 계획하는 경우 저용 아가로즈를 ~20mL로 준비하고 실온에서 보관하십시오. 배아 장착 당일, 이를 녹여 장착하기 전에 42°C 열블록에 배치할 수 있는 튜브에 신선한 알리쿼트(1-5mL)를 생성한다. 장착 하기 전에 형광 현미경을 사용 하 여 성공적인 주사 및 형광의 전반적인 밝기에 대 한 화면 배아. 이상적인 샘플은 강한 EGFP와 mCherry 형광을 가지고 올바른 발달 단계에있을 것입니다(그림 3B – B’). 형광 현미경을 사용하여 배아를 스크린. 장착을 위해 EGFP와 mCherry 형광을 모두 강하게 표현하는 배아를 선택하십시오. 11hpf인 배아를 선택합니다. 소미트를 세어 배아를 올바르게 무대에 담는다34; 11 hpf에서 3 개의 솜릿이 있어야하며 12 hpf로 6 개의 솜릿이 있습니다.참고: 12hpf(11hpf)에 앞서 배아를 장착하면 시간 경과가 시작될 때 샘플이 12hpf로 적절하게 준비됩니다. 장착하기 전에 배아를 데초리오네이트합니다. 미세 한 집게와 수동으로 또는 화학적으로 pronase를 사용 하 여이 작업을 수행 (2 mg/mL). 이 젊은 배아와 함께, 성추는 한천 코팅 접시 내에서 수행되고 배아가 공기 물 인터페이스에 접촉하지 않는 것이 필수적입니다. 유리 롤러 파이펫을 사용하여 배아를 빨아 서 가능한 한 많은 E3를 배출하여 배아가 유리 파스퇴 피펫의 끝에 앉아 있습니다. 열 블록에서 아가로즈의 튜브에 배아를 떨어 뜨립니다. 그것은 몇 초 동안 아가로즈에 가라 앉은 다음 먼저 아가로즈를 빨아 다음 배아를 빨아, 배아가 파이펫의 끝에 남아 있는지 확인(그림 3C – C’). 해부 범위 아래에 이미징을 위한 유리 바닥 접시를 놓습니다. 배아를 배출하고 아가로오스를 유리 바닥 접시에 있는 아가로즈 액적으로 배출한다. 배아가 등쪽 다운 (유리 바닥에 머리의 상단)이 있도록 매우 빠르게 방향을 위해 집게를 사용합니다. 아가로즈 액적을 굳게 할 수 있도록한다(그림 3D – D’). 이 단계의 배아는 깨지기 쉽기 때문에이 단계는 신속하고 신중하게 수행해야합니다. 손상된 배아는 타임랩스 이미징 프로세스에서 살아남지 못할 것입니다.참고: 이 실험을 위해 모든 배아를 일관되게 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 타임랩스를 수행할 때, 배아는 광학 소포가 자라기 위한 추가 공간을 유지하면서 할당된 시야 내에 맞아야 합니다. 최적의 방향은 모든 배아의 전방 후방 축을 “수직으로” 또는 시계 면에 12 및 6시(그림3G)를따라 정렬하는 것입니다. 10-12 배아 사이에 마운트, 이는 이미지 될 것이다 두 배 이상, 최고의 샘플은 한 번 공초점에 평가 할 수 있도록(그림 3E – E’). 샘플은 연령, 형광 라벨링의 균일성 및 장착 방향의 정밀도에 대해 평가됩니다. 배아를 장착한 후, 파이펫이 접시의 바닥을 완전히 덮기 위해 더 많은 아가게로 발생하여, 하나의 큰 아가로즈디스크(도 3F -F’)에별도의 아가로즈 방울을 모두 감싸는 것이다. 충분한 양의 아가로즈는 개별 배아 물방울 또는 전체 디스크가 접시 바닥에서 들어 올려서 보이지 않도록 합니다. 일단 경화되면, e3와 아가로즈를 오버레이하여 타임랩스 이미징 실험 기간 동안 수화된 샘플을 유지합니다(건물의 습도와 환경에 따라 우려).참고: 트리카인은 이러한 특정 타임랩스 이미징 실험에 필요하지 않습니다. 그러나, 원하는 경우, 그리고 배아의 이전 단계로 작업 하는 경우, 트리카인 은 아가로즈 자체에 추가 하 고 미디어에 오버레이 수 있습니다. 종이에, 타임랩스 설정 하는 동안 쉽게 참조 하는 배아의 지도를 그립니다. 이것은 나중에 각 견본의 유전자형과 위치를 연결하는 것이 중요합니다. 4. 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 여러 위치 공초점 시간 경과 참고: 이 타임랩스 이미징 프로토콜은 제조업체의 소프트웨어가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다(재료 표참조). 이 시스템에는 Z 스택을 빠르게 습득할 수 있는 페조 Z 단계 장치가 장착되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 레이저 라인은 488 nm 아르곤 이온 레이저와 DPSS 561 nm 레이저입니다. 561 nm 레이저는 mCherry 플루오로포어 를 이미징에 적합합니다 : 그것은 mCherry 흥분 (587 nm)의 피크에 충분히 가깝고 잘 구동됩니다. 공초점 설정. 공초점에 전원을 공급하고 데스크톱 컴퓨터에 로그인합니다. 압착 Z 단계 인서트를 설치(그림 4B),다음 획득 소프트웨어를 시작합니다. 획득 모드 내의 소프트웨어에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 488 및 561 레이저를 켭니다(그림4F). 레이저는 워밍업하는 데 몇 분 정도 걸리므로 이 단계는 시간을 절약하기 위해 일찍 수행됩니다.참고: 획득 매개 변수는 다음과 같습니다: Z 스택, 타임 시리즈및 위치 상자를 확인합니다. 프레임 크기를 512(X) x 384(Y)로 설정하고, 9로 스캔 속도를 스캔하고, 양방향으로 스캔 모드를 스캔하고, 0.7로 확대, 핀홀에서 60.2(1.63 에어리 유닛 ~= 1.6 μm 섹션), Z 간격을 2.1 μm로 설정합니다. 이렇게 하면 303.6 μm x 227.7 μm, 픽셀 크기 0.59 μm의 이미지 크기가 생성됩니다. 488 및 561 레이저를 검사하 고 동일한 트랙에 할당 해야; EGFP 검출 범위는 494-545 nm이고 mCherry 검출 범위는 598-679(도 4F)입니다. 유리 접시의 바닥을 물의 굴절률과 일치하는 침지 매체로 자유롭게 코팅하고 기포(그림4C)를피하기 위해 주의하십시오. 40배 물 목표를 선택하고 작은 침수 매체를 목표에 적용한다(도4D). 단계 인서트에서 유리 바닥 접시를 고정하고, E3를 적용하여 하룻밤 동안 배아를 촉촉하게 유지한 다음 모델링 점토를 사용하여 접시 위에 플라스틱 뚜껑을 밀봉하십시오(그림4E). 요리와 접촉하는 목표를 올립니다. 시료를 검사하고 타임랩스를 준비합니다. 획득 탭에서 찾기 탭으로 전환하고 전구 기호를 클릭하여 전송된 라이트를 켭니다. 전염된 빛으로 조이스틱으로 첫 번째 샘플을 찾아내고, 눈으로 먼저 샘플을 빛의 광선으로 옮은 다음, 안구를 중앙으로 사용하고 광학 소포에 집중합니다. 획득 탭으로 돌아갑니다. Z 스택,타임 시리즈및 위치 상자를 선택 하 고 레이저를 사용 하 여 워밍업 되어 있는지 확인 합니다. 프레임 크기를 512(X) x 384(Y)로 설정하고, 속도를 9로 스캔하고, 모드를 양방향으로 스캔하고, 줌을 0.7로 설정합니다. 채널 제목에서, 전원에 488 및 561 레이저를 할당하여 시작 2.0 및 게인 550 (이 나중에 조정할 수 있습니다). 핀홀을 60.2(1.63 에어유닛 ~= 1.6 μm 섹션)로 설정합니다. 연속 단추를 사용하여 스캔을 시작합니다. 미세 초점 노브를 사용하여 Z 축의 샘플을 찾아 X-Y 축을 프레임에 배치합니다. 스캔을 중지합니다. 위치 제목 아래에서 추가를 클릭하여 첫 번째 샘플(그림4F)에XYZ 정보를 저장합니다. 샘플이 시간 경과에 대해서만 이 작업을 수행합니다. 강한 형광과 최적의 장착을 위해 샘플을 선택합니다. 찾기 탭으로 전환하고 다음 샘플로 이동하고 4.2.5-4.2.6 단계를 반복하여 샘플을 선택하는 데 선택적입니다. 샘플 위치를 마무리하고 z 범위를 할당한 다음 시간 경과를 시작합니다. 모든 샘플을 선택하면(총 시간 간격 2.5분 내에 4-5개의 샘플을 이미지할 수 있음) 위치가 저장되고 각 샘플을 살펴보고 보기 프레임 내에서 XYZ 위치를 조정할 수 있습니다. 첫 번째 위치를 강조 표시하고 로 이동을 클릭합니다. 지속적으로 스캔하는 동안 프레임 내에서 광학 소포를 정렬합니다. 광학 소포와 뇌에 비해 전방 및 탈반 부위에 충분한 공간을 남겨 둡니다. 다음으로, 미세 초점 노브와 Z 방향을 통해 이동하는 동안 첫 번째 세트와 마지막 설정을 선택하여 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 할당합니다. 광학 컵의 성장을 수용할 수 있기 때문에 총 슬라이스 수 ~63을 유지합니다. 성장을 위한 공간을 확보할 수 있도록 광학 소포의 복부 쪽에 여분의 공간을 제공합니다. 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스가 설정되면 C 버튼을 클릭하여 Z 스택의 중심으로 이동합니다. 레이저 파워와 레이저 모두에 대한 게인을 조정; 가능하면 레이저 전력을 5 이하로 유지하고 필요한 경우 더 높은 게인을 사용하십시오. 스캔을 중지합니다. 업데이트를 클릭하여 위치 정보를 업데이트합니다. 위치 2를 클릭하여 다음 위치로 이동합니다. 각 할당된 위치에 대해 4.3.1-4.3.3 단계를 반복합니다. 레이저 전원과 게인은 모든 샘플이 충분히 조명될 수 있도록 설정해야 합니다. 위치 정보와 레이저 설정이 모두 완료되면 타임시리즈 설정을 할당합니다. 시계열 제목에 따라 시간 간격을 2.5분으로 할당하고 사이클을 300(그림4F)으로 할당합니다. 사이클 의 수는 시간 경과가 광학 컵 개발이 완료되면 24 hpf 단계를 지나 진행될 수 있도록 계산됩니다. 타임랩스를 시작하려면 시작을클릭합니다. 첫 번째 전체 주기를 모니터링: 타이머를 사용하여 하나의 전체 주기(모든 위치 이미징)가 2.5분 미만인지 확인하고 각 위치가 올바른지 확인합니다. 현미경은 하룻밤 독립적으로 실행되며 모니터링 할 필요가 없습니다.참고: 공초점실은 온도 조절되지만 실온은 20-25°C입니다. 장비가 실행되고 레이저 스캐닝을 통해, 배아 발달이 이 예상 속도로 진행되기 때문에, 단계의 온도는 형태학적 랜드마크와 시각적으로 분석되기 때문에 28.5°C에 가까운 것으로 보입니다. 이러한 설정을 사용하면 타임랩스가 12.5h로 지속됩니다. 타임랩스가 완료되면 파일을 저장합니다. 큰(~40GB)이며 인수 소프트웨어를 사용하여 저장한 후 개별 위치로 구분할 수 있습니다.