优化了炔基脂肪酸类似物的掺入，用于使用点击化学检测脂肪酰化蛋白

1. 细胞培养 为了补充DMEM（Dulbecco的改性鹰培养基）用于细胞培养，加入10%胎牛血清（FBS），1x青霉素 – 链霉素，2mM L-谷氨酰胺和100mM丙酮酸钠（1%体积/体积）。 将约5×105 个HEK293T细胞/孔加入6孔组织培养皿中，并在37°C加湿培养箱中生长18小时，其中5%CO 2 达到75%-80%汇合度。 脂肪酸血清剥夺 要准备标记介质，请按上述方式（步骤 1.1）准备 DMEM，不带 10% FBS。用5%葡聚糖 – 木炭涂层FBS（DCC-FBS）代替FBS。使用前预热至37°C。 在室温下用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻洗涤细胞，并用标记培养基替换。注意：HEK293T细胞很容易从组织培养板上分离。清洗细胞和更换培养基时要小心。在转入和移出培养箱期间，尽可能减少搅拌。 将细胞用5%CO 2 返回37°C培养箱并孵育约45分钟（至少15分钟有效），最多60分钟，然后继续用脂肪酸进行代谢标记。 2. 脂肪酸类似物的制备和皂化 通过在DMSO中增溶以达到以下浓度并储存在-20°C下，提前制备炔基脂肪酸的储备溶液。 根据需要在室温下解冻。将准备工作储存在N2 或Ar下以获得最佳性能。炔基肉豆蔻酸酯（13-十四炔酸，13-TDYA）：25 mM棕榈酸炔酯（15-十六炔酸;15-HDYA）：100 mM炔基硬脂酸酯（17-十八烷酸;17-ODYA）：100 mM 要制备20%脂肪酸游离BSA（FAFBSA），在50 mL一次性管中称取2gFAFBSA。 使用预热 （37 °C） DMEM 输送至 10 mL。 通过端对端旋转或通过涡旋混合，并置于37°C水浴中以完全溶解FAFBSA。 使用0.2μm过滤器过滤灭菌培养基。 等分试样在约1 mL体积中，并储存在-20°C。 根据需要解冻，并在使用前在水浴中加热至37°C。 为了提高脂肪酸和脂肪酸类似物的溶解度，通过在3mL玻璃锥形反应瓶中孵育20%摩尔过量的氢氧化钾（KOH）进行皂化。注意：这些小瓶允许盐保持可溶性，同时确保FAFBSA不会因高温而凝结。使用玻璃还可以防止脂肪酸粘附在塑料上。 将至少2μL炔基脂肪酸类似物直接移出到3mL锥形反应瓶的底部。使用6孔板每孔制备2μL脂质（见 表1）。注意：由于脂肪酸的疏水性，最好在将移液器的尖端涂覆几次，然后将其分配到反应瓶中。 将1M KOH稀释至等于20%摩尔过量的炔基脂肪酸标记（13-TDYA为30mM，15-HDYA和17-ODYA为120mM）。 移出等量的稀释KOH（1μL：1μL脂肪酸：KOH）靠近玻璃边缘反应瓶底部，使得KOH的分配体积与脂肪酸混合。 合上小瓶盖，轻轻敲击以混合溶液。注意：混合物可能迅速凝固，特别是随着脂肪酸烃链长度的增加。注意不要移液固体（即，不要通过移液混合）。 将反应瓶在65°C下加热约5分钟，或一旦加入脂肪酸（溶液变得透明）。注意：碳含量较高且溶解度降低的脂肪酸，如硬脂酸酯（17-ODYA），可能需要更长的孵育时间才能在65°C下完全掺入KOH中。 如果需要，将温度升高至70°C。水浴是最好的。注意液体不会蒸发太多。 一旦脂肪酸进入溶液并且没有可见的固体残留，移液器预热20FBSA使得脂肪酸的体积比：KOH：FAFBSA为1：1：50，以达到20x BSA结合的炔基脂肪酸的最终浓度。 通过上下移液混合。溶液通常看起来很清晰，没有可见的固体。注意：通常，任何小固体将在37°C下孵育后进入溶液。 将脂肪酸和FAFBSA在37°C下孵育15分钟。注意：此时皂化标签稳定超过15分钟。   总培养基体积（毫升） 体积脂肪酸或脂肪酸类似物（μL） 光之合（μL） 体积 20% 法夫巴硫 （μL） BSA偶联皂化标记的总体积（μL） 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 表1：皂化脂肪酸标记比。 根据所用培养基的体积，脂肪酸，KOH和FAFBSA的实验体积用于脂肪酸标记的皂化。 作为控件，重复步骤 2.3。与脂肪酸没有炔烃标签。 将1/20体积的20x脂肪酸- BSA偶联物直接标记在饥饿培养基（通常，在2mL培养基/细胞中为100μL）上，以达到1%BSA和25μM的终浓度（用于炔基 – 肉豆蔻酸酯，或100μM用于炔基 – 棕榈酸酯和炔基 – 硬脂酸酯）。注意：为了最大限度地减少对附着细胞的物理干扰，请在移液器尖端靠近培养基表面形成液滴，而不是直接移液到培养基中。如果使用酰化抑制剂，请在标记的脂肪酸前至少15分钟添加。时间可能因使用的细胞或抑制剂而异。建议在此步骤中使用皂化法28。 为了进行比较，通过将2μL（或相当于体积皂化）未标记的脂肪酸直接移液到饥饿培养基中来添加非皂化脂质。 将细胞放回培养箱并孵育3-6小时。注意：可能需要为每种细胞类型或实验条件确定最佳标记时间。较长的孵育时间可能导致脂肪酸通过β氧化和/或掺入其他脂质基团（如磷脂）而分解28。 在室温下用1x PBS轻轻洗涤细胞。 通过在4°C下摇动裂解物15分钟，用500μL不含乙二胺四乙酸（EDTA）的改良放射性免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（0.1%SDS，50mM N-2-羟乙基哌嗪-N-乙烷磺酸（HEPES）pH 7.4，150mM NaCl，1%非变性洗涤剂，0.5%脱氧胆酸钠，2mM MgCl2 与新鲜加入的1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和10μg/ μL Pepstatin A（或不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物））收获细胞并裂解细胞。 在4°C下以16，000× g 离心裂解物10分钟。 将上清液收集在1.7mL微量离心管中，并储存在-20°C，直到准备好继续进行点击反应。注意：协议可以在此处暂停。裂解物在-20°C下稳定长达1个月。但是，建议及时进行点击反应。 根据制造商的方案使用适当的测定法（例如去垢剂相容性（DC）测定法）来量化蛋白质浓度。 3. 点击反应细胞裂解物 准备用于点击化学的试剂。 将三（苄基三唑基甲基）胺（TBTA）溶解在DMSO中至2 mM。用干燥剂在-20°C下储存在小等分试样中长达2-3个月。最好储存在N2 或Ar下。 将 CuSO4 溶解在 ddH2O 水中，达到 50 mM。在室温下储存长达2个月。 将三羧乙基膦（TCEP）溶解在ddH2 O水中至250 mM。在4°C的黑暗中储存，并在点击反应之前制作新鲜的50 mM稀释液。 在DMSO中制备2 mM叠氮化物。用干燥剂在-20°C下储存在小等分试样中长达6个月。最好储存在N2 或Ar下。注意：据观察，具有三个或更多聚乙二醇组的产品与生物素配合使用效果最好。 使用与上述相同的裂解缓冲液将50-100μg蛋白质裂解物放入1.7mL微量离心管中至相同体积。注意：保持反应体积尽可能小（20-100μL）。 向每个样品中添加十二烷基硫酸钠（SDS）以达到最终的1%浓度。 准备点击试剂的预混合，以便加入裂解物后的最终浓度为：100μM TBTA（2mM储备液），1mM CuSO4，（50mM储备）1mM TCEP（50mM储备）和100μM叠氮化物探针（2mM储备）。相应地组合储备溶液（见 表2）。注意：顺序很重要。加入每种成分后完全混合。 将适当体积的预混液添加到裂解液中。通过上下移液混合。 在37°C水浴中在黑暗中孵育30分钟。偶尔搅拌/混合。 总反应体积（μL） 体积蛋白（μL） 体积 TBTA （2 mM） （μL） 体积铜溶氧物质4 （50 mM） （μL） 体积 TCEP （50 mM） （μL） 氮化物探针 （2 mM） （μL） 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 表2：点击试剂和蛋白质体积比。 点击化学试剂的实验体积和相应的储液浓度，以及蛋白质样品的体积。 4. 免疫沉淀蛋白上的点击反应 或者，可以在磁珠 上或磁珠外的 免疫沉淀（IP）蛋白上进行点击反应。注意：通常，执行点击 关闭 磁珠会导致最少的背景，并且在测试感兴趣的新蛋白质时是最好的。 转染细胞以获取感兴趣的蛋白质，在这种情况下，野生型肉豆蔻酰化C端亨廷顿蛋白（HTT）融合到GFP（myr-ctHTT-GFP）和ctHTT-GFP，具有G2A取代，使用磷酸钙DNA共沉淀，如前所述41。 在6孔组织培养板中平板2.5×105 个细胞/孔，并生长过夜至约70-80%汇合度。 通过将2.5μg DNA加入10μL和99.75μL分子级H2 O到1.7mL微量离心管中来制备DNA混合物。然后，将15.25μL CaCl2 滴加到DNA混合物中。 将DNA / CaCl2 混合物以滴滴方式加入含有125μL 2x HEPES缓冲盐水（HBS，pH 7.0）的单独管中混合。 缓慢地将DNA / CaCl2 / HBS混合物添加到细胞中。2-4小时后，更换培养基并孵育过夜。继续执行步骤 1.3-2.8 中的标记。 在裂解缓冲液中制备等体积的500μg蛋白质。 通过与兔抗GFP孵育ctHTT-GFP在4°C下旋转过夜来执行IP。 向每个管中加入15-20μL蛋白G珠，用裂解缓冲液预先平衡，并使其在4°C下端对端反应3小时。 用裂解缓冲液洗涤磁珠，并重悬于45μL 1%SDS 50mM HEPES缓冲液中。 将珠子在80°C下加热15分钟，并倒置管或大约每5分钟搅拌一次。短暂旋转管并返回80°C。 在样品仍然温热时收集含有蛋白质的上清液。注意：如果不能立即用于点击化学，则可以在此处暂停实验方案，并且免疫沉淀样品可以储存在-20°C或-80°C下。 让43μL上清液与7μL点击试剂的预混液反应。 按照步骤3.2.3中所述进行反应。 5. SDS-PAGE和蛋白质印迹 通过加入含有25mM二硫黄醇（DTT）的1x样品上样缓冲液并在95°C下加热5分钟来停止反应并变性。注：最高可达 100 mM DTT28。不要使用β-巯基乙醇与S-酰化蛋白，因为它可以水解硫酯键并除去点击的脂肪酸类似物。 简要地降低样本。 用SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶上一式两份地分离蛋白质。注意：用KOH碱性处理需要两个凝胶，以确认硫酯键的存在。如果使用荧光叠氮化物探针，则可以在凝胶内或使用指示的激发通道在转印后检测到酰化。 转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（在甲醇中活化并在ddH2 O中冲洗5分钟），用半干转印装置在25 V，1.0 A（恒定）下30分钟。 用ddH2O短暂冲洗膜后，将一个复制膜浸泡在甲醇/水（9：1 v / v）中的0.1 M KOH中，另一个在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中浸泡在甲醇/水（9：1 v / v）中，作为非碱性对照，在室温下轻轻摇动60分钟。 在ddH 2O水中短暂冲洗膜，然后在PBS-T（1x PBS，0.1%吐温20）中洗涤6次，每次5分钟。注意：彻底清洗。 在5%脱脂牛奶阻断缓冲液（1x PBS，0.1%吐温20）中阻断膜过夜。 6. 进行蛋白质印迹 在指示的情况下，在室温下将荧光标记的链霉亲和素（1：5000）和负载控制，抗GAPDH罗丹明（1：5000）的探针置于5%BSA封闭缓冲液（0.01%SDS，1x PBS，0.1%吐温20）中，在室温下轻轻摇动45-60分钟，在黑暗中轻轻摇晃。 首先在5%脱脂牛奶封闭缓冲液中使用一级抗GFP抗体探测免疫沉淀蛋白印迹，然后按照步骤6.1在5%BSA中使用适当的二抗。 在PBS-T（1x PBS，0.1%吐温20）中洗涤膜5分钟，共重复四次，并在成像前用ddH 2 O水冲洗。