Imágenes de paquetes de estereocilios con resolución a nanoescala en células ciliadas auditivas de mamíferos vivos

A pesar del hecho de que los haces de estereocilios en las células ciliadas auditivas son lo suficientemente grandes como para ser visualizados por microscopía óptica y desviados en células vivas en un experimento de pinza de parche, los componentes estructurales esenciales de la maquinaria de transducción, como los enlaces de punta, solo se pueden visualizar con la microscopía electrónica en células muertas. En las células ciliadas auditivas de mamíferos, la maquinaria de transducción se encuentra en los extremos inferiores de los enlaces de punta, es decir, en las puntas de los estereocilios de fila más corta¹ y se regula localmente a través de la señalización en las puntas de los estereocilios^2,3. Sin embargo, las imágenes sin etiquetas de las estructuras superficiales en esta ubicación en las células ciliadas vivas no son posibles debido a los pequeños tamaños de los estereocilios.

La cóclea de mamífero tiene dos tipos de células sensoriales auditivas: células ciliadas internas y externas. En las células ciliadas internas, los estereocilios son más largos y gruesos en comparación con los de las células ciliadas externas⁴. La primera y segunda fila de estereocilios tienen un diámetro de 300-500 nm en las células ciliadas internas de ratón o rata. Debido a la difracción de la luz, la resolución máxima alcanzable con una microscopía óptica sin etiqueta es de aproximadamente 200 nm. Por lo tanto, la visualización de estereocilios individuales dentro de la primera y segunda fila del haz interno de células ciliadas es relativamente fácil con la microscopía óptica. En contraste, los estereocilios de fila más cortos en las células ciliadas internas y todos los estereocilios de las células ciliadas externas tienen diámetros de alrededor de 100-200 nm y no se pueden visualizar con microscopía óptica⁵. A pesar del progreso reciente en imágenes de superresolución, esta limitación fundamental persiste en cualquier imagen óptica sin etiquetas. Todas las técnicas actuales de superresolución disponibles comercialmente requieren algún tipo de moléculas fluorescentes^6,lo que limita sus aplicaciones. Además de las limitaciones debidas a la necesidad de moléculas específicas marcadas con fluorescencia, se ha demostrado que la exposición a la irradiación de luz intensa induce daño celular y podría influir en los procesos celulares, lo cual es una gran desventaja cuando se estudian células vivas⁷.

Nuestro conocimiento actual de los detalles ultraestructurales de los haces de estereocilios de células ciliadas se ha obtenido principalmente con diversas técnicas de microscopía electrónica (EM), como la microscopía electrónica de barrido (SEM), la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la em de congelación-fractura, y recientemente con técnicas 3D como la sección en serie con haz de iones enfocado o la tomografía crio-EM^{8,9,10, 11,12,13, 14,15,16}. Desafortunadamente, todas estas técnicas EM requieren la criofijación química o criofija de la muestra. Dependiendo de la escala de tiempo de los fenómenos, este requisito hace que un estudio de los procesos dinámicos en las puntas de los estereocilios sea imposible o muy laborioso.

Se han realizado esfuerzos limitados para obtener imágenes de haces de cabello de células ciliadas vivas con microscopía de fuerza atómica (AFM)^17,18. Dado que la AFM opera en soluciones fisiológicas, podría, en teoría, visualizar cambios dinámicos en los haces de estereocilios de las células ciliadas vivas a lo largo del tiempo. El problema radica en los principios de la AFM de alta resolución, que implica cierto contacto físico entre la sonda AFM y la muestra, incluso en el modo de “tapping” menos dañino¹⁹. Cuando la sonda AFM se encuentra con un estereocilio, generalmente se estrella contra él, dañando la estructura del haz de cabello. Como resultado, esta técnica no es adecuada para visualizar paquetes de células ciliadas en vivo, o incluso fijos,^17,18. El problema puede aliviarse parcialmente mediante el uso de una gran sonda AFM en forma de bola que impone solo fuerzas hidrodinámicas a la superficie de la muestra²⁰. Sin embargo, a pesar de que dicha sonda es ideal para probar las propiedades mecánicas de la muestra^21,proporciona solo una resolución submicrométrica cuando se obtienen imágenes del órgano de Corti²² y aún aplica a la muestra una fuerza que puede ser sustancial para los haces de estereocilios altamente sensibles.

La microscopía de conductancia iónica de barrido (SICM) es una versión de la microscopía de sonda de barrido que utiliza una sonda de pipeta de vidrio llena de una solución conductora²³. SICM detecta la superficie cuando la pipeta se acerca a la celda y la corriente eléctrica a través de la pipeta disminuye. Dado que esto está sucediendo mucho antes de tocar la célula, el SICM es ideal para imágenes sin contacto de células vivas en solución fisiológica²⁴. La mejor resolución de SICM es del orden de nanómetros individuales, lo que permite resolver complejos proteicos individuales en la membrana plasmática de una célula viva²⁵. Sin embargo, al igual que otras técnicas de sonda de escaneo, SICM es capaz de obtener imágenes solo de superficies relativamente planas. Superamos esta limitación inventando el microscopio de conductancia iónica de sonda de salto (HPICM)^26,en el que la nanopipeta se acerca a la muestra en cada punto de imagen(Figura 1A). Usando HPICM, pudimos obtener imágenes de haces de estereocilios en células ciliadas auditivas vivas con resolución a nanoescala²⁷.

Otra ventaja fundamental de esta técnica es que HPICM no es solo una herramienta de imagen. A diferencia de otras técnicas de sonda de barrido, la sonda HPICM/SICM es un electrodo ampliamente utilizado en la fisiología celular para registros eléctricos y entrega local de diversos estímulos. La actividad del canal iónico no suele interferir con las imágenes HPICM, porque la corriente total a través de la sonda HPICM es varios órdenes de magnitud mayor que la corriente extracelular generada por los canales iónicos más grandes²⁵. Sin embargo, HPICM permite el posicionamiento preciso de la nanopipeta sobre una estructura de interés y el posterior registro de patch-clamp de un solo canal a partir de esta estructura²⁸. Es así como obtuvimos las primeras grabaciones preliminares de la actividad de un solo canal en las puntas de los estereocilios de células ciliadas externas²⁹. Vale la pena mencionar que incluso una gran corriente a través de la nanopipeta no puede producir cambios significativos del potencial a través de la membrana plasmática debido a la enorme derivación eléctrica del medio extracelular. Sin embargo, los canales iónicos individuales pueden activarse mecánicamente por flujo de líquido a través de la nanopipeta³⁰ o químicamente por aplicación local de un agonista³¹.

En HPICM, la imagen se genera cuando una nanopipeta se acerca secuencialmente a la muestra en un punto, se retrae y luego se mueve en dirección lateral para repetir el enfoque(Figura 1A). Un amplificador de abrazadera de parche aplica constantemente voltaje a un cable AgCl en la pipeta(Figura 1B)para generar una corriente de ~ 1 nA en la solución de baño. El valor de esta corriente cuando la pipeta está lejos de la superficie de la celda se determina como una corriente de referencia (I_ref, Figura 1C). Luego, la pipeta se mueve en el eje Z para acercarse a la muestra hasta que la corriente se reduce en una cantidad predefinida por el usuario (punto de consigna), generalmente 0.2% -1% de la _referencia I (Figura 1C,traza superior). A continuación, el sistema guarda el valor Z en este momento como la altura de la muestra, junto con las coordenadas X e Y de este punto de imagen. Luego, la pipeta se retrae lejos de la superficie(Figura 1C,traza inferior) a una velocidad definida por el usuario, generalmente 700-900 nm / ms. Después de la retracción, la pipeta (o, en nuestro caso, la muestra – ver Figura 1B)se mueve lateralmente al siguiente punto de imagen, se obtiene un nuevo valor de corriente de referencia y la pipeta una vez más se acerca a la muestra, repitiendo el proceso. El movimiento X-Y de la pipeta se prefiere en una configuración de microscopio vertical que se utiliza normalmente para las grabaciones de las corrientes de mecanotransducción de células ciliadas. En este entorno, la sonda HPICM se acerca a los haces de células ciliadas no desde la parte superior, sino en un ángulo^32. Sin embargo, la mejor resolución de las imágenes HPICM se logra en una configuración de microscopio invertido(Figura 1A,B),donde el movimiento de la muestra en direcciones X-Y se desacopla del movimiento Z de la nanopipeta, eliminando así los posibles artefactos mecánicos.

Usando HPICM, obtuvimos imágenes topográficas de haces de estereocilios de células ciliadas internas y externas de ratones y ratas, e incluso visualizamos los enlaces entre los estereocilios que tienen aproximadamente 5 nm de diámetro^26,27. El éxito de las imágenes de paquetes de células ciliadas con esta técnica se basa en varios factores. En primer lugar, el ruido (varianza) de la corriente de nanopipeta debe ser lo más pequeño posible para permitir el punto de ajuste más bajo posible para las imágenes HPICM. Un punto de consigna bajo permite a la sonda HPICM “detectar” la superficie de los estereocilios a una distancia mayor y en cualquier ángulo con respecto al enfoque de la sonda y, sorprendentemente, mejora la resolución X-Y de las imágenes HPICM (consulte discusión). En segundo lugar, las vibraciones y derivas en el sistema deben reducirse a menos de 10 nm, ya que contribuyen directamente a los artefactos de imagen. Finalmente, a pesar de que la sonda HPICM y la etapa de muestra se mueven en ejes Z y X-Y por los actuadores piezoeléctricos calibrados controlados por retroalimentación que tienen una precisión de un solo nanómetro o mejor, el diámetro de la punta de la nanopipeta determina la propagación de la corriente (volumen de detección) y, por lo tanto, la resolución (Figura 1A). Por lo tanto, antes de obtener imágenes de células ciliadas vivas, es vital tirar de las pipetas adecuadas, alcanzar la resolución deseada con muestras de calibración y lograr un bajo nivel de ruido en el sistema de grabación.

Durante al menos un par de décadas, la técnica SICM no ha estado disponible comercialmente y ha sido desarrollada por solo unos pocos laboratorios en el mundo con el laboratorio líder del Prof. Korchev en el Imperial College (Reino Unido). Recientemente, varios sistemas SICM se pusieron a disposición comercial (ver Tabla de Materiales),todos los cuales se basan en los principios originales de HPICM. Sin embargo, los paquetes de estereocilios de imágenes en las células ciliadas requieren varias modificaciones personalizadas que son técnicamente desafiantes (o incluso imposibles) en los sistemas cerrados “listos para usar”. Por lo tanto, se necesita cierta integración de componentes. Dado que la configuración de HPICM representa una plataforma de abrazadera de parche con requisitos de vibración y deriva más estrictos y un movimiento piezoeléctrico de la sonda HPICM y la muestra(Figura 1D),esta integración es relativamente fácil para cualquier investigador, que sea competente en el pinzamiento de parches. Sin embargo, un científico sin la formación adecuada definitivamente necesitaría algo de capacitación en electrofisiología primero. A pesar de los desafíos restantes, como el aumento de la velocidad de las imágenes (ver Discusión),hemos podido obtener imágenes de haces de estereocilios en células ciliadas vivas con resolución a nanoescala sin dañarlas.

Este artículo presenta un protocolo detallado para realizar imágenes HPICM exitosas de los haces de células ciliadas auditivas vivas en explantes cocleares de ratas o ratones jóvenes postnatales utilizando nuestro sistema personalizado. Los componentes integrados se enumeran en la Tabla de Materiales. El documento también describe los problemas comunes que se pueden encontrar y cómo solucionarlos.