Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

Florian B&#252;rtin; Stephanie Matschos; Friedrich Prall; Christina S. Mullins; Mathias Krohn; Michael Linnebacher

doi:10.3791/62065

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Ricerca sul cancro

יצירה ותחזוקה של ביובנק חי - איך אנחנו עושים את זה

Published: April 10, 2021

doi:

10.3791/62065

Florian Bürtin¹, Stephanie Matschos², Friedrich Prall³, Christina S. Mullins², Mathias Krohn², Michael Linnebacher²

¹Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery,University Medical Center Rostock, University of Rostock, ²Molecular Oncology and Immunotherapy, Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery,University Medical Center Rostock, ³Institute of Pathology,University Medical Center Rostock

Summary

בעבודה הבאה, אנו מתארים את הצעדים הרצופים הדרושים להקמת ביובנק גדול של סרטן המעי הגס והלבלב.

Abstract

לאור הידע הגובר על המאפיינים הבין-אינדיבידואליים וההטרוגניות של סרטן, התחום המתפתח של רפואה מותאמת אישית דורש פלטפורמה למחקר פרה-קליני. במהלך השנים האחרונות, הקמנו biobank של סרטן המעי הגס והלבלב המורכב רקמת הגידול העיקרי, רקמה נורמלית, סרה, לימפוציטים בדם היקפי מבודד (PBL), קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX), כמו גם קווי תאים סרטניים ראשוניים ומשניים. מאז רקמת הגידול המקורי מוגבל ואת קצב הקמת של קווי תאים סרטניים ראשוניים הוא עדיין נמוך יחסית, PDX לאפשר לא רק שימור והרחבת biobank אלא גם את הדור של קווי תאים סרטניים משניים. יתר על כן, דגמי PDX הוכחו להיות המודל האידיאלי vivo עבור בדיקות סמים פרה-קוליניות. עם זאת, ביובנקינג דורש הכנה קפדנית, הנחיות קפדניות ותשתית מכווננת היטב. Colectomy, תריסריון או גרורות resected דגימות נאספים מיד לאחר כריתה ומועברים למחלקה הפתולוגית. כיבוד העדיפות של דו”ח היסטופטולוגי משוחד, על פי שיקול דעתו של הפתולוג המטפל שמבצע את הניתוחים, חתיכות גידול קטנות ורקמה שאינה גידול נקצרים.

חלקים נמקיים מושלכים ורקמת הגידול הנותרת נחתכת לקוביות קטנות וזהות וקריפטופדית לשימוש מאוחר יותר. בנוסף, חלק קטן של הגידול הוא טחון ומתוח עבור תרבות תאים סרטניים ראשונית. בנוסף, דגימות דם שנלקחו מהמטופל לפני ואחרי הניתוח, מעובדות כדי להשיג סרום ו- PBLs. עבור תחריט PDX, הדגימות cryopreserved מופשרים ומושתלים תת עורית לתוך האגפים של עכברים immunodeficient. PDX וכתוצאה מכך recapitulate מקרוב את ההיסטולוגיה של “התורם” גידולים והוא יכול לשמש גם עבור קסנוגרפטינג הבאים או cryopreserved לשימוש מאוחר יותר. בעבודה הבאה, אנו מתארים את השלבים האינדיבידואליים של יצירה, תחזוקה וניהול של ביובנק גדול של סרטן המעי הגס והלבלב. יתר על כן, אנו מדגישים את הפרטים החיוניים ואת האזהרות הקשורות biobanking.

Introduction

בשנים האחרונות, הידע המצטבר על התכונות המורפולוגיות, הקליניות והגנטיות של סרטן הוביל לתפיסת הסרטן כמחלה הטרוגנית ואינדיבידואלית. כתוצאה מכך, אפיון מוטציה של neoplasms, מלבד תכונות קליניות ופתולוגיות, צברה חשיבות לקבלת החלטות קליניות וטיפולים ממוקדים רבים פותחו עבור שינויים מולקולריים שונים. לדוגמה, את היעילות של cetuximab בטיפול בסרטן המעי הגס ניתן לחזות על ידי ניתוח של מצב מוטציה KRAS ו PIK3CA ¹. רפואה מדויקת שואפת לגישה מותאמת אישית כדי לספק את המענה הטיפולי הגבוה ביותר בכל מטופל ולהימנע מרעילות של טיפולים לא יעילים². Biobanks מכילים רקמות, דם וחומרים ביולוגיים אחרים של חולי סרטן, אשר קשורים לנתונים הקליניים, ולכן הם כלי מצוין לחקר סרטן תרגום. בשל מספר רב של דגימות קליניות, biobanks לאפשר גילוי של מוטציות נדירות, אך פוטנציאל לתרופות, אשר מספק הזדמנויות טיפול חדשות עבור המטופל הפרט³.

כדי לכסות רחב ככל האפשר ספקטרום מחקר אונקולוגי, לא לרסן את הפעילות שלנו על קציר מדגם לבד, אבל התמקד בהקמת קווי תאים סרטניים שמקורם בחולה וקסנוגרפטים (PDX). קווי תאים דו-מימדיים מסורתיים נשארים האבן הפינתית של מחקר במבחנה והם הבחירה העיקרית להקרנות סמים בקנה^מידהגדול 4^,⁵. יתר על כן, ניתוח קו התא הוא לעתים קרובות קל יותר, זול יותר וזמין יותר. בנוסף, מאז לימפוציטים בדם היקפי שמקורו בחולה (PBL) זמינים, גם אימונולוגיה הגידול ניתן ללמוד במבחנה⁶. עם זאת, רוב התרופות שפותחו לאחרונה עם השפעה פרה-קלינית מבטיחה בניסויים מבוססי תאים במבחנה או ב- vivo, הראו תוצאות מאכזבות בניסויים קליניים⁷. לעומת זאת, מחקרים פרה-קליניים המבוססים על PDX במחקרי vivo שיקפו את הפעילות הקלינית של סוכנים אנטי-ניאופלסטיים הרבה יותר בנאמנות⁸. מאז רקמת PDX משקף מקרוב את המאפיינים היסטולוגיים ומולקולריים של הגידול התורם, מודלים PDX הם דרך טובה להפיץ את כמויות מוגבלות מאוד לעתים קרובות של רקמת גידול קיימא כדי לשמור על השלמות של ביובנק ולאפשר חילופי דגימות בין קבוצות מחקר ומוסדות. יתר על כן, קווי תאים סרטן נגזר רקמת PDX ניתן להקים באופן משמעותי קל יותר מאשר קווי תאים סרטני ראשוני⁹. בשנים האחרונות הקימה קבוצת העבודה שלנו ביו-בנק משולב מקיף של סרטן המעי הגס והלבלב על ידי סטנדרטיזציה ואופטימיזציה של זרימת העבודה עבור כל הדגימות הביולוגיות המדוברות (איור 1).

איור 1: זרימת עבודה וארגון של הביובנק אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

המחקר הבא אושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של המרכז הרפואי האוניברסיטאי רוסטוק (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 ו A 2019-0222). יתר על כן, כל ההליכים הרלוונטיים וטרינרית אושרו על ידי Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und פישרי מקלנבורג-וורפומרן תחת מספרי הרישום LALLF M-V/TSD / 7221.3-2-020/17 ו 7221.3-1-007/1. 1. תנאים מוקדמים ניסיוניים לעמוד במספר תנאי מסגרת חשובים להקמה ותחזוקה של ביובנק. השתמש במרפאה עם מחלקה כירורגית ומספר מספיק של כריתות אונקולוגיות יחד עם מעבדה מאובזרת היטב וצוות אקדמי מספיק. תשתית טובה וקשר איתן עם מחלקת פתולוגיה משתפת פעולה הם תנאים מוקדמים נוספים. למחקר in vivo, השתמשו במתקן לבעלי חיים עם תנאי דיור המתאימים לעכברים אימונודפיים. קבל אישור על כל מחקר על חומר שמקורו בחולה מוועדת האתיקה של שירותי הבריאות. קבל אישור על כל מחקר in vivo מהרשות המוסמכת על פי תקנות סטטוטוריות מקומיות. 2. אוסף לדוגמה יום לפני הניתוח להעריך את כל החולים עם סרטן המעי הגס או הלבלב resectable ו /או גרורות המתאימות לזכאות biobanking. הימנעו מלכלול מקרים עם טיפול טרום טיפול ניאו-אדג’ובנטי, גידולים קטנים מאוד, גידולים של כבוד לא בטוח או נגעים אשר נשדדו חלקית אנדוסקופית לפני. קבל אישור בכתב להשתתפות מהמטופל במהלך הדיון על ההסכמה מדעת על ההליך הכירורגי. הודע בזמן לכל המנתחים המעורבים, לצוות המעבדה כמו גם לפתולוג. רכישה לדוגמה להודיע לכל המשתתפים בחדר הניתוח (OR) על איסוף הרקמות עבור biobank מיד לפני תחילת ההליך הכירורגי.הערה: זה חיוני כי הרקמה לא צריך להיות קבוע פורמלין. אם הרקמה שקועה בפורמלין, היא הופכת להיות לא מתאימה לבנק ביולוגי משולב. לצייר 40 מ”ל של דם הפריני (2 x 20 מ”ל מזרק) כמו גם צינור סרום סטנדרטי 7.5 מ”ל מיד לאחר אינדוקציה הרדמה ולהעביר במהירות למעבדה עבור בידוד PBL ועיבוד סרום (ראה שלב 3-4). השג את הדגימה הניתוח ישירות משולחן הניתוחים, הנח אותה במיכל מתאים וקח אותה למחלקה הפתולוגית. רשום את נקודת הזמן של ניתוק מהמחזור, כריתה והגעה לפתולוגיה.הערה: ההתאמה של הדגימה לבנקאות ביולוגית צריכה להיות מוערכת על ידי הפתולוג המשתף פעולה שמנתח פרוסת גידול ורקמות לא ממאירות. אל תגרש חלקים כלשהם של הדגימה בעצמך אשר עלול לסכן את הדו”ח הפתולוגי הבא. מניחים את שתי חתיכות הרקמה בצינור פוליפרופילן נפרד של 15 עד 50 מ”ל עם פתרון אחסון רקמות של 10 עד 30 מ”ל (או DPBS) על קרח. תרשום את זמן הקבלה ותעביר את הדגימות מיד למעבדה.הערה: יש לבצע את שלבי הפרוטוקול הבאים 3-6 בארון זרימה למינארי בתנאים סטריליים מחמירים. השתמש בכל הנוזלים בטמפרטורת החדר. 3. עיבוד סרום צנטריפוגה צינור סרום 7.5 מ”ל ב 1128 x גרם ו 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש. Aliquot 1 מ”ל סרום לכל צינור ב cryotubes שכותרתו מראש להקפיא חנקן נוזלי. 4. בידוד של PBL על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות הערה: עבוד במקביל לכל אחד משני המזרקים של 20 מ”ל. למלא 20 מ”ל של דם הפריני לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ”ל ולהוסיף 15 מ”ל של DPBS. קח 15 מ”ל של Pancoll עם פיפטה סרולוגית, להכניס את פיפטה בזהירות כל הדרך לתחתית צינור פוליפרופילן ולשחרר את Pancoll לאט מאוד כדי ליצור שכבה מתחת לעמודה דם / DBPS. צנטריפוגה ב 375 x g במשך 15 דקות ללא בלם. לשאוף ולהעביר את שכבת interphase אטום בין העמודה האמצעית והעליונה של שתי הדגימות לתוך צינור פוליפרופילן טרי 50 מ”ל ולהתמלא DPBS ל 50 מ”ל. צנטריפוגה ב 270 x גרם במשך 15 דקות עם בלם. לשאוף ולהשליך את supernatant, resuspend גלולה התא ב 4.5 מ”ל של מדיום מקפיא. Aliquot 1.5 מ”ל של ההשעיה לכל cryotube, לסגור את הצינורות בחוזקה ומניחים אותם במיכל הקפאה מתאים להקפאה איטית ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. 5. עיבוד רקמות הערה: התחל עם הדור של דגימות קפואות הצמד של גידול ורקמות בריאות כדי לשמור על שלמות של חומצות גרעין. דגימת רקמת גידול להעביר את דגימת הגידול עם כמה מ”ל של פתרון אחסון רקמות מצינור פוליפרופילן לצלחת פטרי. יש לשטוף עם DPBS במידת הצורך. הימנע מלגעת בדגימה ולהשתמש בשני אזמלים סטריליים כדי להתמודד עם הרקמה. הימנע התייבשות בכל עת. לשקול את דגימת הגידול בקנה מידה נוח בצלחת נפרדת ולשים לב למשקל הרקמה. להעריך את גודל, צורה ואיכות הרקמה של רקמת הגידול לפני החיתוך. המטרה להשיג לפחות חתיכה אחת על גודל של ראש סיכה להקפאת הצמדה וארבע קוביות של כ. 30 מ”מ3 (אורך קצה 3 x 3x 3 מ”מ) כל אחד עבור cryopreservation חיוני. צור כמה שיותר קוביות30 מ”מ 3 ב quadruples ככל האפשר וליצור חתיכה אחת להקפאה הצמד לכל 5 quadruples. כמו כן יש לקחת בחשבון כי מנות נמק חייב להיות מנותק, כך קוביות מורכב רקמה חיונית בלבד. צור פרוסות בעובי 3 מ”מ. חותכים מנות נמק, להבחין כמו ג’ל כמו או מסה נוזלית, לחתוך את הפרוסות לקוביות של שני הגדלים הרצויים.הערה: אין להשליך שום רקמה בשלב זה. הקפאת הצמדה תווית cryotubes בהתאם (ראה שלב 7.7). מניחים חתיכת רקמה אחת קטנה לכל cryotube שכותרתו מראש. לטבול את הדגימות מיד לתוך חנקן נוזלי במשך כמה דקות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר מכן. הקפאה של רקמות חיוניות תווית cryotubes בהתאם (ראה שלב 7.7) ולמלא כל אחד עם 1.5 מ”ל של מדיום מקפיא. מניחים את מיכל ההקפאה ליד הספסל.הערה: בצע את השלבים הבאים במהירות האפשרית. מאז DMSO במדיום המקפיא יש תכונות ציטוטוקסיות, הזמן של הרקמה להיות שקוע במקפיא בינוני ללא קירור נאות לא יעלה על 2 דקות. מסדרים את קוביות30 מ”מ 3 בארבעה. לדחוף רקמה נמקית ושרידים אחרים לקצה המנה, אבל לא להשליך אותם. סקופ את הקוביות עם להב אזמל ולהעביר 4 קוביות לכל cryotube. ודא כי חתיכות הגידול שקועים לחלוטין במדיום מקפיא. סוגרים את הצינורות בחוזקה ומניחים אותם במיכל הקפאה המתאים להקפאה איטית ומאחסנים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. העבר cryotubes לתוך מערכת אחסון מתאים לאחסון לטווח ארוך ב -140 מעלות צלזיוס ומטה. תיעוד במערכת ניהול מלאי המעבדה הוא חובה. דגימת רקמה בריאה: חזור על שלבים 5.1.1. ל-5.1.6.4 לדגימה בריאה של רקמות. 6. תרבות תאים ראשית לפורר את שרידי רקמת הגידול, כולל גרוטאות נמק, בצלחת פטרי עם אזמלים לחתיכות קטנות ככל האפשר. מניחים מסננת תאים סטרילית (גודל נקבובית 100 מיקרומטר) על גבי צינור פוליפרופילן 50 מ”ל. השתמש פיפטה סרולוגית להוסיף 5-10 מ”ל של DPBS לצלחת פטרי, לצוף את שרידי הרקמה פיפטה למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה. העבר את ההשעיה עם פיפטה למסננת התא. חזור על שלבים 6.3-6.4 עד שכל שרידי הרקמה ייפתרו מצלחת הפטרי. השתמש בוכנה של מזרק 20 מ”ל בכיוון אחד כדי לסחוט את התא ואת ההשעיה רקמה דרך מסננת התא. יש לשטוף עם 5-10 מ”ל של DPBS טרי, להשליך את מסננת התאים ולסגור את הצינור כראוי. צנטריפוגה ההשעיה ב 180 x g במשך 5-10 דקות. הכינו קולגן-אני precoated 6 צלחת היטב עם 1.5 מ”ל של בינוני לכל באר. לשאוף ולהשליך את העל טבעי. Resuspend גלולה ב 3 מ”ל של DPBS או בינוני ולהוסיף 500 μL של ההשעיה לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור (100% לחות, 5% CO2, 37 °C (60 °F) לפקח על הצלחת מדי יום עבור צמיחת תאים וזיהום.הערה: תאים נוספים המכתים עד לנקודה של הקמת קו תא קבוע אינו מתואר כאן. 7. דור ה-PDX ערוך ניסוייםi n vivo רק על ידי אנשים מוסמכים המתאימים העומדים בדרישות הסמכות המוסמכת של תחום השיפוט שלך. עכברים אימונודפיים בבית בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) מספקים את הדרישות של זן העכבר המשומש. האמצעים ההיגייניים כוללים כלובים מאווררים בנפרד, מזון אוטוקלאב, מים וחומר קינון, כמו גם מנעול אוויר בטיחותי ולבישת ציוד מגן אישי. אוטוקלאב כל המכשירים מראש ולהשתמש רק קבוצה אחת של מכשירים עבור כל מקרה הגידול, כדי למנוע זיהום צולב. טפל ברקמת הגידול באופן אספטי ככל האפשר. כל הפריטים הפלסטיים הנקראים להלן צריכים להיות סטריליים, חד פעמיים ומושלכים לאחר כל ניתוח.הערה: נקבע על ידי השיטה של הקפאת ארבע חתיכות רקמת הגידול לכל cryotube, הדור PDX דורש תמיד שני עכברים לכל מדגם, באופן אידיאלי וכתוצאה מכך ארבעה גידולים PDX. בחר את הגידול העיקרי הרצוי עבור חריטה באמצעות מערכת ניהול מלאי מעבדה ולהעביר את המדגם (רקמת גידול השתמרה באופן חיוני) ממיכל האחסון הראשי למיכל חנקן נוזלי נייד (אחסון ביניים ב -80 מעלות צלזיוס על קרח יבש הוא גם נוח). לשים על ציוד מגן אישי לפני הכניסה SPF-סעיף (קרצוף, כפכפים, סינר, כיסוי שיער, מסכה כירורגית overshoes), לחטא את הידיים ואת כל הציוד. השריית מטריגל הסר את cryotube טופס מיכל חנקן נוזלי לחכות להפשרה של הדגימה. תווית צינור פוליפרופילן 50 מ”ל ולמלא עם 35 מ”ל של DPBS. להטות את cryotube למעלה ולמטה ולהעביר את התוכן מיד לצינור פוליפרופילן ברגע רקמה בינונית-רפש ניתן להעביר. לשטוף בעדינות את חתיכות רקמת הגידול, להשליך את הנפח העיקרי מהצינור בכלי נפרד, לסגור את המכסה ולשים את הצינור כלפי מעלה בצד למטה, כך ארבע חתיכות רקמה לאסוף במכסה. שים צלחת פטרי על צובר הקירור ומניחים 100 μL של Matrigel כמו טיפה אחת לאמצע. השתמש מלקחיים אנטומיים להעביר את חתיכות הגידול לתוך Matrigel. ודא כי כל חתיכה מכוסה לחלוטין עם Matrigel. דגירה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הרדמה לעכבר (2 עכברים לדגימה, עבודה במקביל) הכן 3:1- מלאי של קטמין (100 מ”ג / מ”ל) ו xylazine (20 מ”ג / מ”ל) פתרון הרדמה. המינון המומלץ הוא 90/6 מ”ג /ק”ג משקל גוף. שוקלים את העכבר ומציירים את פתרון ההרדמה הדרוש למזרק אינסולין חד פעמי. מניחים את העכבר על רשת הכלוב, מושכים את זנבו בעדינות ביד אחת כדי לגרום לתנועה קדימה ובו זמנית סרטנים את הצוואר עם אחיזה קמצוץ של היד השנייה. הרם את העכבר של הרשת וסובב את היד המחזיקה, כך שהגב של החיה מונח על כף היד שלך. לשתק את אחת הרגליים האחוריות עם הזרת שלך ולהזריק את הסמים תוך אישית. החזירו את העכבר לכלוב שלו והמתינו לגיוס נרקוטי. מניחים את העכבר מורדם על צלחת החימום לכסות את העיניים עם משחה, כדי למנוע נזק הקרנית. יש לו את עומק ההרדמה על ידי צביטה עדינה של הרגל האחורית של העכבר במלקחיים כירורגיים.הערה: היעדר תנועה מצביע על נרקוזיס עמוק. כל סוג של תנועה גם דורש יותר זמן להגיע לעומק הסמים הרצוי או מנה נוספת של הרדמה. הליך כירורגי יוצרים קיפול עור על ידי צביטה בצוואר העכבר ומזריקים את השבב תת עורי עם המוליך (ראה שלב 9 לפרטי תכנות) לגלח את האגפים של העכבר במידת הצורך (NMRInu / nu עכברים אינם דורשים גילוח), להחיל povidone-יוד עם ספוגית כותנה ולהשתמש וילון כירורגי כדי ליצור שדה סטרילי. להרים את העור של האגף עם מלקחיים כירורגיים, לעשות חתך קטן של מילה 4 מ”מ וליצור כיס תת עורי קטן על ידי הכנה בוטה עם מספריים. מכניסים חתיכת גידול אחת לכל כיס ומניחים אותה בקצה האחורי. חותכים את הקצה של קצה פיפטה 100 μL ושואבים את Matrigel הנותרים מצלחת פטרי ולהחיל אותו באופן שווה לתוך כל כיס העור. סגור את הפצעים עם תפרים מופרעים פשוטים ולהחיל רוטב ספריי. סרוק את השבב ובדוק את תוקף העכבר ומזהה הגידול. הכינו כלוב חדש עם מצעים טריים וחומר קינון, כמו גם מקל כרסום. מקפלים “כרית” ממגבות נייר ומניחים את העכבר עם ראש מורם תחת מנורת חום אינפרא אדום. יש לערבב 0.25 מ”ל של טרימתופרים/סולפטוקסזול (400 מ”ג/80 מ”ג) עם 100 מ”ל מי שתייה ולנהל באמצעות בקבוק השתייה. קחו בחשבון שעכבר אחד צורך כ-150 מ”ל לק”ג משקל גוף מדי יום.הערה: מכיוון שמודל ה- PDX התת עורי אינו קשור לכאב לאחר הניתוח, לא במהלך תהליך ריפוי הפצע, ולא במהלך צמיחת הגידול, אין צורך במשככי כאבים לאחר הניתוח. אנא שימו לב כי ההנחיות לרווחת בעלי החיים במוסד/הרשות שלכם עשויות להיות שונות. ניטור בעלי חיים ניסיוניים לפקח על העכברים מדי יום לסימני מצוקה. זה יכול להיות מוקצה למטפלים בעלי חיים מוסמכים. שמור על טיפול אנטיביוטי לאחר הניתוח עם המינון הנ”ל במשך 4 שבועות. החלף את תערובת האנטיביוטיקה פעמיים בשבוע. למדוד את גודל הגידול לפחות פעם בשבוע, באופן אידיאלי מדי יום, עם caliper (נפח הגידול = 0.52 x אורך x רוחב x גובה [מ”מ3])ולהקליט במסד הנתונים. 8. קציר ועיבוד PDX לקצור ולעבד את הגידול PDX, כאשר:גודל הגידול מגיע לנפח היעד של 1.500 מ”מ3.הגידול הנושא בעלי חיים מראה סימנים של מצוקה ו/או מחלה והטיפול הוא חסר תועלת.הגידול הופך כיב או חודר את העור של העכבר. קרא את השבב כדי לזהות את ה- PDX הנכון. המתת חסד לעכבר בשיטה משפטית (בהתאם להנחיות הלאומיות) כמו למשל CO 2 -חנקאו הזרקת קטמין /xylazine ואחריו נקע בצוואר הרחם. הרם את העור עם מלקחיים כירורגיים באגפים ו incise עם מספריים Metzenbaum כמה מילימטרים רחוקים מהגידול. נתק את העור מעל הגידול על ידי הכנה בוטה, ואז בזהירות לתפוס את הגידול עם מלקחיים אנטומיים לנתק את הגידול מן fascia השטחי של הגוף. לשטוף את הגידול עם DPBS, לשים אותו לתוך צלחת פטרי ולהסיר רקמת חיבור סמוכה. בשלב זה, בצע אחת מהפעולות הבאות: חותכים 30 מ”מ3 קוביות וליצור PDX חדש (המשך עם פרוטוקול בנקודה 7.7.4). חותכים את הגידול לפרוסות, אשר מועברים לאחר מכן קלטות היסטולוגיה נשמרים 4% פורמלדהיד עבור הטבעה פרפין מאוחר יותר. לשמר את הגידול בצינור עם פתרון אחסון רקמות כדי להוסיף אותו biobank (להמשיך עם פרוטוקול בשלב 3.) ו / או ליצור קווי תאים נגזר PDX (המשך עם פרוטוקול בשלב 4.) 9. ביובנק וניהול נתונים הקצה מזהה פנימי לכל מקרה גידול לפי טבלה 1. מיקום/שם מעבדה ישות סרטן מספר אירוע עוקב מפרט מספר עוקב C=המעי הגס _Met=גרורות P =לבלב _Tu=גידול דוגמה: HROC389_Met2 = רוסטוק, סרטן המעי הגס, מקרה 389, גרורות השני טבלה 1: הגדרת המזהה לדוגמה. אחסן את הסכמת המטופל בטופס אלקטרוני ונייר יחד עם מזהה הגידול. לאסוף נתונים קליניים רבים ככל האפשר ולאחסן אותם באנונימיות ובנפרד. השתמש בתוכנת ניהול נתונים (למשל, Freezerworks) או אחרת וצור ממשק עם תוכנת הדפסת תוויות כדי ליצור תוויות ברקוד עמידות בטמפרטורה ודבקות עצמית. הוסף מדגם חדש על ידי פתיחת תוכנת ניהול הנתונים, להגדיר את סוג הדגימה ולתעד את המידע הבא: מזהה גידול, סוג רקמה, שיטת הקפאה, תאריך, עובד אחראי, מספר מעבר, מזהה עכבר ומתח עכבר. הקצה את הדגימות למיקומים ספציפיים במיכל האחסון. מעקב וניטור של PDX (חל על שלב 7-8) השתמש בבסיס נתונים של MS Access (או במערכת דומה) במכשיר נייד המותאם לשימוש Bluetooth (מחשב נישא או טאבלט) כדי לתעד מזהה גידול, תאריך ההשתלה, תאריך המתת חסד, גיל העכבר ומתח, כמו גם צמיחת הגידול לאורך זמן. חבר את קורא השבבים למכשיר והקרא את השבב לפני ההשתלה. הקצה מזהה ספציפי לכל עכבר; אנו משתמשים בערכה הבאה:(ראה טבלה 2 להלן) לאחר ההשתלה, רשום את המזהה יחד עם מאפייני העכבר בבסיס הנתונים. קרא מחדש את השבב ובדוק, אם המפרטים של השבב, בסיס הנתונים ותווית ההקפאה עקביים. צור תווית עבור כל כלוב עכבר בהתאם.הערה: כדי ליצור גיבוי פיזי, הדבק את תוויות ההקפאה עם תוויות השבב המתאימות לחוברת ותאריך הערה ומתח העכבר. כדי לפקח על צמיחת הגידול של PDX הפרט, לסרוק את השבב של העכבר עם הקורא מחובר למכשיר בסיס הנתונים לזיהוי ולתעד את גודל הגידול נמדד על ידי caliper בכל שבוע. תכנן את נקודת הזמן האידיאלית של קצירת PDX על ידי ניתוח עקומת הצמיחה של הגידול. מזהה גידול אחסון קודם ב- N2 (=f) מספר מעבר (=T) מספר עכבר עוקב (=M) דוגמה: HROP12 fT0 M1 = רוסטוק, סרטן הלבלב, מקרה 12, שנוצר מרקמה ראשונית קפואה, מעבר ראשון, עכבר 1. טבלה 2: הגדרת מזהה PDX.

Representative Results

בידינו, שיעור ההקמה של תרביות תאים ראשוניות (איור 2A & B) היה 12.9% בסדרה גדולה9. רוב הניסיונות לבודד תאים סרטניים הניתנים להרחבה מדגימות כירורגיות טריות שנכשלו נכשלו בשל חוסר התרחבות או זיהום מוקדם. הקמת קו התא נחשב מוצלח לאחר 3 קטעים עם צמיחה יציבה בתנאי תרבות סטנדרטיים (DMEM, 10% FCS, כלי תרבות סטנדרטי) ואימות של בידול אפיתל באמצעות FACS-ניתוח10. קווי התאים הנגזרים מגידולי PDX (איור 2C &D) הראו שיעור הקמה גבוה יותר של 23.6% אשר נובע גם מהאפשרות של ניסיונות חוזרים ונשנים לעומת גידולים ראשוניים9. עם זאת, חלק מהתרבויות המעורבות (איור 2E)אינן יכולות להשתחרר מצמיחה פיברובלסטית או אפילו ללכת לאיבוד עקב צמיחת יתר פיברובלסטית(איור 2F). איור 2: תרבות התאים. קווי תאים סרטניים ראשוניים, נגזר גרורות של מקרה סרטן המעי הגס HROC313, מעבר 21 (A) ומקרה סרטן הלבלב HROP88, קטע 5 (B). PDX נגזר קווי תאים סרטניים של המעי הגס PDX HROC285 T0 M2 (D) ולבלב PDX HROP10 T5 M2, מעבר 4 (E). תרבות מעורבת של פיברובלסטים ותאי סרטן מסרטן הלבלב HROP75, מעבר 8 (C) וגימת יתר פיברובלסטית (F). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. בהתחשב בשינויים בפרוטוקול הדור PDX, זנים העכבר בשימוש וגם ניסויים על פני מספר שנים, כמו גם הבדלים גדולים בכמות רקמת הגידול זמין עבור חריטה, זה לא טריוויאלי לתת את שיעור ההצלחה הכולל של דור PDX. בסדרה עדכנית מאוד של ניסויי דור PDX שבוצעו על ידי שני חוקרים (S.M. ו- F.B.), נצפו שיעורי שגשוג ראשוניים של 63% עבור PDX המעי הגס (היסטולוגיה למופת ניתן לתאר מאיור 3A) ו -48% עבור PDX הלבלב (איור 3B). תולדות הלימפומה המורינית או האנושית באתר ההשתלה נדירות יחסית, אך יכולות לחקות את תנופת PDX המוצלחת(איור 3C). מלבד בדיקה היסטופתולוגית, קונקורדנציה בין מודלים PDX לבין המטופלים התורמים שלהם אושרה באופן קבוע על ידי ניתוח חוזר טנדם קצר (STR) (איור 3D). עד היום הביובנק כולל >50 צבעים ראשוניים ו->50 משניים, 3 קווי תאים משניים לסרטן הלבלב ו-6 קווים משניים של סרטן הלבלב, כמו גם >150 דגמי PDX המעי הגס ו-19 דגמי PDX בלבלב. איור 3: השוואה היסטולוגית מייצגת של המעי הגס (A) ושל PDX הלבלב (B). לימפומה אנושית באתר ההשתלה מחקה את PDX מצמח (C). בדיקות זהות גנטית של מודל PDX (HROC430 T1 M2) לרקמת הגידול המקורית של המטופל (HROC430Tu) על ידי ניתוח חוזר טנדם קצר (STR). השוואה בין תשעת הלוקוסים STR, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (צבע FAM) ו- D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (צבע HEX) באמצעות PCR מולטיפלקס עם פריימרים עם תווית פלואורסצנטית בעקבות אלקטרופורזה נימי אישר קונקורציה גנטית של PDX וגידול (DDX) לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הדור של ביו-בנק חי מניח מראש, מלבד עמידה בתקנות החוקיות של פרטיות, משפט רפואי ורווחת בעלי חיים, תשתית טובה וצוות מתואם היטב. זה הוכיח יתרון ישירות לערב חלק מהצוות הכירורגי בהליכי המחקר, שכן הם יכולים מאוד להעריך את ההתאמה של המטופל הפרט לתרומת רקמות. יתר על כן, חולים נוטים להסכים עם biobanking בתדירות גבוהה יותר, כאשר האישור בכתב שלהם מתקבל במהלך הדיון בהסכמה מדעת כירורגית. כדי לחסוך זמן ומשאבים, מקרים כי יהיה ככל הנראה להניב כמויות מספיקות של רקמת הגידול לא צריך להיבחר עבור biobanking. כשמדובר ברכישת דגימה, המקסימום “תקשורת היא המפתח” הוא אמת פשוטה, אך לעתים קרובות מתעלמים ממנה. זה לוקח רק אחות תיאטרון אחת חסרת ידע או עמית כירורגי להרוס את הדגימה ממש בהתחלה על ידי המשך כרגיל והוספת פורמלדהיד לדגימה כריתה. לכן, זה חיוני לחלוטין כי כל אחד מחברי הצוות המעורב מקבל היכרות עם SOP עבור biobanking. מנתחים יש לשים לב יום לפני וממש בתחילת ההליך על איסוף רקמות מתוזמן. יתר על כן, מקרים שנבחרו עבור biobanking, צריך להיות מודגש בתוכנית או אלקטרונית. קצירת רקמות מהדגימה הכירורגית צריכה להתבצע על ידי פתולוג. ראשית, זה יבטיח כי קצירת הרקמות אינה מפריעה לדו”ח הפתולוגי הסופי. שנית, זה מגדיל את ההסתברות של קבלת רקמה עם כמויות נאותות של רקמת סרטן קיימא. במיוחד בסרטן הלבלב עם תגובה desmoplastic בולט ואזורים נמקיים תכופים, חלקים קיימא קשה לזהות מקרוסקופית עבור העין לא מאומן. כחריג לכלל זה, בלוקי רקמה מגרורות גדולות בכבד או בפולמונלה, עשויים לפעמים להיות מגורשים “שולחן אחורי” על ידי המנתח, אם שוליים כירורגיים יכולים להיות מוגדרים מקרוסקופית. סרטן פי הטבעת resected על ידי כריתה mesorectal הכולל (TME), לא יכול להיות מתאים biobanking, שכן קצירת רקמות מן הדגימה resected לפני הטמעת פרפין עלול להפריע להערכת איכות TME. לחלופין, רקמה עבור biobanking ניתן לרכוש על ידי ביופסיה טרנסאנלית של סרטן פי הטבעת.

שיעורי ההקמה של תרביות תאים ראשוניות הנגזרות מהגידול המקורי הם בדרך כלל נמוכים. PDX נגזר, תרביות תא משני יכול להיות הוקמה בהצלחה רבה יותר. אנו ממליצים לבדוק מדיה שונה עבור כל מקרה ושימוש תוספי אנטיביוטיקה עבור הקטעים הראשונים כדי להפחית את הזיהום למינימום מאז הרקמה שנקטפו הוא לעתים רחוקות סטרילי. לאחר התפשטות מוצלחת, כל קו תאים בודד צריך להיות מאושר כקו תאים סרטניים על ידי ניתוח FACS ונבדק באופן קבוע לזיהום mycoplasma. כדי לא לכלול זיהום צולב, ניתוח STR רגיל מומלץ. יש לציין, כי פרוטוקול ההקמה עבור קווי תאים ראשיים ומשניים נתון כל הזמן לאופטימיזציה. פרטים על ההרכב ושיעורי ההצלחה של המדיה הבודדת הם בבירור מעבר להיקף עבודה זו ויפורסמו בנפרד.

עבור תחריט PDX, רקמת הגידול יכולה להיות מושתלת ישירות לאחר כריתה או cryopreserved בסרום עגל העובר עם 10% DMSO או מדיה הקפאה דומה להשתלה מאוחרת. ההשתלה מיד עם קצירת רקמת הגידול מכבידה על צוות הלוגיסטיקה והמעבדה, ותוצאות קסנוגרפטינג לאחר ההקפאה אינן נחותות כלל ¹⁰. יתר על כן, דגירה של הרקמה Matrigel לפני השתלת הגידול, מגדיל באופן משמעותי את שיעורי החריטה¹². אנו ממליצים על חריטה מאוחרת בעקבות ממצא פתולוגי מובהק וסילוק מיידי של דגימות רקמה שנאספו בטעות. מאז שיעור ההצלחה של תחריט ראשי עולה עם כשל חיסוני של העכבר הנמען, אנו נוטים להשתמש בעכברי NSG עבור המעבר PDX הראשון. לאחר תחריט PDX המוצלח הראשון, עכברי NMRI^nu/nuיכולים ויש להשתמש בהם למעברים הבאים ולהרחבת רקמות. זן זה הוא חזק יותר, זול יותר וקל יותר להתרבות בהשוואה NSG או זנים immunodeficient דומה, אבל עדיין מראה שיעורי חריטה סבירים. יתר על כן, העירום שלה מקל על השתלה וניטור צמיחת הגידול. כדי להגדיל את שיעורי החריטה במעברים הבאים, אנו ממליצים על העברה ישירה של רקמות PDX שנקטפו לאחרונה כדי לארח עכברים במידת האפשר, במיוחד עבור PDX הגדל לאט ומקרים עם שיעור הצלחה תחריט ראשוני נמוך. קולינס ולאנג סקרו לאחרונה 14 מחקרים של הקמת PDX המעי הגס ודיווחו על שיעורי חריטה הנעים בין 14 ל -100% עם שיעור הקמה PDX חציוני של 68%, האחרון עולה בקנה אחד עם הממצאים שלנו¹³. בקנה אחד עם הספרות, ראינו שיעורי הקמה נמוכים יותר של הלבלב לעומת סרטן המעי הגס PDX¹⁴. ללא קשר לזן העכבר המארח וישות הגידול, צמיחתו של האדם, וירוס אפשטיין-בר (EBV) הקשורים לימפומות B-cell ולימפומות מורין בצד ההשתלה מהווה מכשול חשוב¹⁵^,¹⁶. אם לא מזוהה, גידולים כאלה יכולים “לזהם” קטעים הבאים ובכך לבלבל תוצאות רצופות. צמיחה PDX מהירה יוצאת דופן ונפיחות של בלוטות לימפה צוואר הרחם, בית השחי, מפשעתי הם אינדיקטורים חזקים של צמיחת לימפומה מורין, אבל בדיקה היסטולוגית קבועה של PDX מומלץ בכל זאת. יתר על כן, קונקורדנציה גנטית בין PDX לבין המטופל התורם המתאים צריך להיבדק באופן קבוע על ידי ניתוח STR. באופן אידיאלי, biobank צריך להיות קשור למסד נתונים קליני הכולל מאפייני חולים (מידע כללי, הישרדות, הישרדות ללא הישנות, טיפול, neoplasia משני וכו ‘). בשל תקנות משפטיות של הגנת פרטיות והיעדר בסיס נתונים אנונימיות כזה, ערכת הנתונים הקליניים שלנו מנוהלת ומתעדכנת באופן קבוע על ידי הרופאים המשתפים פעולה.

בעוד ביובנקים קונבנציונליים מוגבלים למחקר מצפה כוכבים, ביובנק חי מספק את ההזדמנות להתערבויות במבחנה ובוויו. קווי תאים שמקורם בחולה הם כלי חשוב למחקר בסיסי, הקרנות תרופות בתפוקה גבוהה והערכה של סוכני תרופות חדשים⁴. מודלים PDX המקביל, עם זאת, הם בעלי חשיבות גוברת, שכן הם מסכמים מקרוב את ההיסטולוגיה של הגידול המקורי¹⁷^,¹⁸ ולהראות יציבות גנטית גבוהה על פני מספר קטעים¹⁹^,²⁰. ה-PDX biobank שלנו הוכיח את עצמו כפלטפורמה מצוינת למחקר פרה-קליני ויסודי^6,^21. יתר על כן, מאז אוספי PDX גדולים כראוי לשקף את ההטרוגניות הבין-אינדיבידואלית של אוכלוסיית המטופלים, הגישה ניסוי קליני PDX (PCT) (חיה אחת לכל מודל לכל טיפול) צברה חשיבות לפיתוח תרופות שכן היא מאפשרת חיזוי נאמן של תגובה קלינית לתרופות חדשות משטר קומבינטורי⁸. אנו גם מעריכים כעת תרופות ניסיוניות חדשות בניסויים קטנים PCT.

למרות תוצאות מבטיחות אלה, משך ההקמה החציוני של 12.2 חודשים, מעכב את הישימות הקלינית של מודלים PDX כמו “עכברי גלגול” לבדיקת אפשרויות טיפול נגד סרטן, לפחות עבור אותם חולים הזקוקים לטיפול אדג’ובנטי מיידי או אפילו neoadjuvant²². חיסרון נוסף של דגמי PDX סטנדרטיים הוא היעדר שימושיות לבדיקות אימונותרפיות בשל כשל חיסוני של עכברים מארחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו מספר זני עכבר “אנושיים”. עכברים אלה הם immunocompromised בכבדות, אבל ניתן לשקם עם סוגים שונים של תאים נגזר מח עצם אנושי או CD34⁺ תאי גזע hematopoietic לאחר PDX outgrowth²³, המאפשר הערכה של cytotoxicity בתיווך לימפוציטים של תגובה טיפולית לטיפול מעכבי מחסום חיסוני²⁴^,²⁵.

בשנים האחרונות, אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) התגלו כמודלים חשובים לסרטן המתחרים ב- PDX. מבנים תלת-ממדיים אלה, המופקים מחתיכות גידול שלמות ומתורבתים בפיגום מטריצה חוץ-תאית, משקפים באופן הדוק את התכונות ההיסטולוגיות והגנטיות של הגידול המקורי. האפשרות של התרחבות ארוכת טווח ו cryopreservation הופך PDO תוסף אידיאלי של biobank חי²⁶^,²⁷. בנוסף לשיעור הקמה גבוה יחסית, דווח על חיזוי תגובת תרופות אמינה עבור PDO של מספר ישויות גידול²⁸. יתר על כן, PDOs אפילו נוצרו מתאי הגידול במחזור וגם הקמת בו זמנית של אורגנואידים מרקמה בריאה תואמת אפשרי, המאפשר הערכה של רעילות הקשורות לטיפול על בסיס חולה-אדם²⁹^,³⁰. עם זאת, בהשוואה לתרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות, תרבות האורגנואידים היא זמן ותרכובות מטריצה חוץ-תאית מלאכותיות יכולות להפריע להליכים אנליטיים מסוימים³¹. יתר על כן, אורגנואידים סרטניים רגישים לצמיחת יתר על ידי גידול מהיר יותר, אורגנואידים שאינם ממאירים נגזר אפיתל בריא³⁰. בשל מחסור בסטרומה, כלי דם ותאי חיסון, PDOs הם בעיקר בלתי ניתנים לתיישנות לבדיקה של סוכנים אימונותרפיים אנטי אנגיוגניים. עם זאת, שיטות culturing חדש לאפשר מידול של microenvironment הגידול במבחנה, מה שהופכים PDOs מתחרה אמיתי עבור מודלים PDX³². בעתיד הקרוב, מודלים של גידולים מטופלים-אינדיבידואליים, בשילוב עם כלים גנטיים רבי עוצמה כמו רצף הדור הבא, יסללו בתקווה את הדרך לרפואה מדויקת אמיתית וגישות מותאמות אישית.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בחביבות לג’ני בורמייסטר, העוזרת הגרפית שלנו, על ההקלטה והעריכה של הסרטון. בנוסף, אנו מודים לעמיתינו במחלקה הכירורגית והפתולוגית על שיתוף הפעולה ארוך השנים. ברצוננו גם להודות למרקוס מולר, מנהל ההפקה של מרכז ה- IT והמדיה, אוניברסיטת רוסטוק, על אספקת ציוד הקלטת השמע וזיקוק איכות הצליל.

מימון מימון: הקרן הגרמנית לסיוע לסרטן (DKH e.V.), מענק מספר 108446, ומספר המענק TBI-V-1-241-VBW-084 מהמדינה מקלנבורג-וורפומרן מימנו חלקית מחקר זה.

Materials

Bacillol® AF; 1L	Bode, Hartmann	REF 973380	desinfection
PP centrifuge tube, 15ml; sterile	Greiner Bio One	GBO Cat. No.:188271	centrifuge tube
PP centrifuge tube, 50ml, sterile	Sarstedt	Order number: 62.547.254	centrifuge tube
BD Discardit^TMII Syringe 20ml	BD	REF 300296	blood collection
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette	Sarstedt	Item number: 01.1601	blood collection
serological Pipette 10ml	Sarstedt	REF 86.1254.001	liquid transfer
Pipetboy ratiolab® accupetta	Ratiolab	Item number: RL3200300	liquid transfer
PIPETBOY acu 2	Integra Biosciences	VWR Cat.No: 613-4438	liquid transfer
DPBS; w/o Ca & Mg	Pan Biotech	Cat. No.: P04-36500	washing
Pancoll human	Pan Biotech	Cat. No.: P04-60500	density gradient centrifugation
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	PAN Biotech	Cat. No.: P04-41500	cell cultivation
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)	PAN Biotech	Cat. No.: P40-47500	cell cultivation
L-Glutamine 200mM	PAN Biotech	Cat. No.: P04-80100	cell cultivation
Trypsin / EDTA	PAN Biotech	Cat. No.: P10-023100	cell cultivation
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)	PanReac AppliChem	VWR Cat.No: A3672.0250	cell freezing
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)	selfmade	—	cell freezing
cryotube- CryoPure 2ml	Sarstedt	72380	cell freezing
6-Well cell culture plate; steril; with lid	Greiner bio-one	Cat.-No.: 657 160	cell cultivation
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams	Sarstedt	Cat. No.: 82.1472.001	tissue preparation
sterile surgical blades	B.Braun (Aesculap)	REF BB510	tissue preparation
BD Discardit^TMII Syringe 10ml	BD	REF 309110	tissue preparation
cell strainer; yellow; 100µm	Falcon	REF 352360	tissue preparation
CoolCell	biocision	Item number: 210004	cooling container with -1°C/min
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm	KGW	Cat. No.: HT39.1	transport system
Pipette tip 200µl	Sarstedt	REF 70.760.002	liquid transfer
Filter tip 1000µl	Sarstedt	REF 70.762.411	liquid transfer
Pipette 200µl, yellow	Eppendorf	Cat. No.: 3121 000.082	liquid transfer
Pipette 1000µl, blue	Eppendorf	Cat. No.: 3121 000.120	liquid transfer
incubator BB 6220 CU	Heraeus	Cat.-No.: 51012839	cell cultivation
heating plate PRÄZITHERM	Harry Gestigkeit GmbH	—	heating
Microscope Zeiss Primo Vert	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	Serial number. 3842000839	imaging cell cultures
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc	nunc GmbH & Co. KG	—	sterile working bench
freezer -80°C	Kryotec-Kryosafe GmbH	—	sample storage
Electronic balance MP-300	Chyo	—	Scale
BD Micro-fine, U100 insulin syringe	BD	REF 324826	injection anesthetic
Rompun 2%; 25ml	Bayer	approval number: 6293841.00.00	anesthesia
Ketamin 100 mg/ml, 25ml	CP-Pharma GmbH	approval number: 401650.00.00	anesthesia
GES3S Reader	Datamars	not available	RFID reader
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)	Peddymark	—	RFID chip
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml	Ratiopharm	PZN-03928197	antibiotic drinking water
Heating plate #FM-20 42x28cm	Dragon	—	heating
Heating lamp	Electric Petra, Burgau	—	heating
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen	Bayer	PZN-01578675	Eye protection
anatomical tweezer	B.Braun Aesculap	BD21 OR	surgical instruments
surgical tweezer	B.Braun Aesculap	BD50 1 R	surgical instruments
scissors	B.Braun Aesculap	BC05 6R	surgical instruments
needle holder	B.Braun Aesculap	BH1 1 OR	surgical instruments
Prolene 5-0	Ethicon	XN8870.P32	surgical suture material
Opsite moisture vapour permable spray dressing	Smith&Nephew	REF 66004978, PZN- 02063507	surgical suture material
Adhesive aperture drape	Barrier	REF 904622	sterile OP tissue
gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm	Lohmann&Rauscher	REF 18506	sterile OP tissue
Raucotupf cotton tipped applicators	Lohmann&Rauscher	REF 11969	applicator
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	Cat.-No.: 354234	Basement Membrane Matrix
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)	B.Braun Melsungen AG	Item number: 18839	desinfection
MACS® Tissue Storage Solution	Miltenyi Biotec GmbH	Order No.:130-100-008	storage solution
Formafix 4%	Grimm med. Logistik GmbH	Item number: F10010G	fixation solution
Software FreezerworksBasic	Dataworks Development, Inc	—	sample organization
Zebra TLP 2844 printer	Zebra	—	label printer

Riferimenti

Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 – a Crohn’s related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671 (2016).
Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).
Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981 (2018).
Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).
Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).
Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).
Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice–a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).
Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).
Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Bürtin, F., Matschos, S., Prall, F., Mullins, C. S., Krohn, M., Linnebacher, M. Creation and Maintenance of a Living Biobank – How We Do It. J. Vis. Exp. (170), e62065, doi:10.3791/62065 (2021).