Recolección e identificación de polen de colonias de abejas melíferas
Summary
Describimos métodos para recolectar polen corbicular de abejas melíferas, así como protocolos para la clasificación de colores, acetólisis y preparación de portaobjetos de polígono para la identificación taxonómica. Además, presentamos el color de los pellets y la diversidad taxonómica del polen corbicular recolectado de cinco sistemas de cultivo utilizando trampas de polen.
Abstract
Los investigadores a menudo recolectan y analizan el polen corbicular de las abejas melíferas para identificar las fuentes vegetales en las que buscan polen o para estimar la exposición a pesticidas de las abejas a través del polen. Aquí se describe un método eficaz de captura de polen para recolectar polen corbicular de las abejas melíferas que regresan a sus colmenas. Este método de recolección da como resultado grandes cantidades de polen corbicular que se pueden utilizar con fines de investigación. Las abejas recolectan polen de muchas especies de plantas, pero generalmente visitan una especie durante cada viaje de recolección. Por lo tanto, cada pellet de polen corbicular representa predominantemente una especie de planta, y cada pellet de polen se puede describir por color. Esto permite la clasificación de muestras de polen corbicular por color para segregar las fuentes vegetales. Los investigadores pueden clasificar aún más el polen corbicular analizando la morfología de los granos de polen acetolizados para la identificación taxonómica. Estos métodos se usan comúnmente en estudios relacionados con los polinizadores, como la eficiencia de la polinización, la dinámica de forrajeo de los polinizadores, la calidad de la dieta y la diversidad. Se presentan metodologías detalladas para recolectar polen corbicular utilizando trampas de polen, clasificar el polen por color y acetolizar granos de polen. También se presentan resultados relacionados con la frecuencia de colores de pellets y taxones de polen corbicular recolectado de abejas melíferas en cinco sistemas de cultivo diferentes.
Introduction
La abeja melífera occidental (Apis mellifera L.) es un polinizador importante de muchos cultivos agrícolas que dependen de la polinización de las abejas1. Durante más de una década, se han reportado pérdidas significativas de colonias de abejas melíferas 2,3,4,5,6,7,8,9. Varios factores, incluidos parásitos y enfermedades, mala nutrición y pesticidas, han sido implicados en estas disminuciones de colonias10. La mala nutrición puede atribuirse a la intensificación agrícola y a la pérdida del hábitat de forrajeo11. Es imperativo comprender los recursos florales utilizados por las abejas en diferentes paisajes para mejorar la nutrición de las abejas y ayudar en los esfuerzos de conservación de las abejas. El polen es la principal fuente de proteínas, lípidos, vitaminas y minerales para las abejas y se ha utilizado en muchos estudios agrícolas y ecológicos para comprender las preferencias de alimentación a nivel de colonia de las abejas melíferas, evaluar el impacto de la captura de polen en las colonias de abejas melíferas y determinar la exposición a pesticidas para las abejas12,13,14.
Las abejas recolectan polen de las flores, empacan el polen en pellets en su corbicula, una canasta de polen tibial en su pata trasera, y regresan a la colonia para su almacenamiento. El polen corbicular se puede eliminar de los recolectores capturándolos en la entrada de la colmena o en las flores, enfriándolos brevemente para inmovilizarlos y luego retirando los gránulos de polen de sus patas traseras con fórceps. El laborioso proceso de recolección manual de polen corbicular de recolectores capturados individualmente es lento e ineficiente si se requiere una cantidad considerable de polen. Un método más simple y eficiente para recolectar grandes volúmenes de polen es atrapar gránulos de polen corbicular de las abejas melíferas en las entradas de las colmenas. Las trampas de polen están diseñadas para desalojar el polen corbicular de las patas de los recolectores de polen que regresan cuando entran en la colmena15. Los recolectores deben pasar a través de agujeros de malla que están dimensionados para permitir el paso estrecho de un cuerpo de obrera de abejas melíferas.
A medida que la abeja melífera pasa a través de uno de estos agujeros, los gránulos de polen más grandes se raspan de sus patas y caen en una bandeja de recolección16. Los estudios han demostrado que la captura de polen estimula a los recolectores a recolectar más polen, aumentando así la eficiencia de polinización de los cultivos y la vegetación circundantes17,18,19,20. Las metodologías de recolección de polen también se pueden utilizar para comprender el forraje utilizado por las abejas melíferas en el paisaje como el primer paso para determinar la cantidad, calidad y taxones de especies de plantas con flores. Las metodologías eficaces de captura de polen facilitan tanto la polinización como la investigación nutricional de las abejas melíferas. Una comparación de estos métodos de recolección de polen se ilustra en la Tabla 1. El comportamiento de búsqueda de polen cambiará en función de la necesidad de la colonia de polen almacenado en relación con sus niveles de población de huevos y larvas21,22. Como estos cambios incluyen una intensidad de recolección variable, a menudo se espera una alta variación en la cantidad de polen entre colonias en el mismo lugar y entre diferentes lugares del mismo sistema de cultivo o tipo de paisaje23,24. Aumentar el número de colonias y lugares para atrapar el polen ayudará a acomodar esta variación.
Las trampas de polen varían en eficiencia25,26. El tamaño de los pellets de polen recolectados por las abejas melíferas varía entre las especies de plantas y puede cambiar según los niveles de polen almacenados en la colonia27,28. Esto plantea la posibilidad de que los gránulos de polen más pequeños estén subrepresentados y los gránulos más grandes estén sobrerrepresentados en muestras recolectadas a través de trampas de polen. Las abejas adultas varían en tamaño corporal, lo que también puede afectar la representación del polen recolectado en las trampas. También hay especies de plantas que producen predominantemente néctar que no se detectará si solo se evalúa el polen recolectado en algunos paisajes. La eficiencia de la captura también se ve afectada por la deriva y la desorientación del forrajero, que está influenciada por el tipo de trampa de polen y la condición del equipo de la colmena. Este problema puede mitigarse empleando las técnicas especificadas en este documento. Los investigadores pueden considerar técnicas de investigación adicionales, como contar las visitas de flores por parte de los recolectores, para complementar los resultados de las preferencias de forrajeo a nivel de colonia. Un método útil para evaluar la diversidad de polen es clasificar el polen corbicular por color. Aunque las abejas melíferas son recolectoras generalistas, también exhiben fidelidad floral, donde recolectan polen de la misma especie de planta en el mismo lugar durante cualquier viaje de recolección. Con base en este comportamiento de forrajeo, se supone que cualquier pellet de polen corbicular dado está representado predominantemente por una sola especie de planta 27,29,30,31. Por lo tanto, los científicos pueden describir la diversidad de polen clasificando el polen corbicular por color de pellet e informando el número total de colores detectados o la proporción del total representado por cada grupo de color 12,32,33,34. Esto se puede lograr midiendo la masa o el recuento de pellets de cada grupo de color. Se sugiere medir el recuento de pellets de cada grupo de color si existen diferencias sistemáticas conocidas o sospechadas en el peso de los pellets de diferentes taxones. Las diferencias sistemáticas podrían ser causadas por el tamaño del pellet o la cantidad de néctar que los recolectores agregan al polen al formar un pellet.
La clasificación de colores es un proceso simple y eficiente en el tiempo, pero puede no tener una precisión aceptable para algunos estudios de investigación de polinización porque diferentes taxones de plantas pueden tener colores similares de pellets de polen35,36. Además, existe un límite logístico para el número de grupos de colores distintos en los que se pueden separar los gránulos de polen. Por lo tanto, la separación del polen de cada taxón de planta individual en su propio grupo de color de pellets puede no ser siempre posible en los estudios de polinización. La caracterización morfológica de los granos de polen mediante microscopía óptica a menudo complementa la separación del color de los gránulos al distinguir el polen de dos o más taxones en gránulos del mismo grupo de color. Aunque es común encontrar granos de polen de múltiples taxones en un grupo de color de pellets de polen dado, los pellets de polen individuales recolectados por una abeja melífera generalmente comprenden un taxón predominante, posiblemente con otros taxones en cantidades menores. Por lo tanto, es común asumir la fidelidad taxonómica en pellets de polen corbicular de abejas melíferas. Los gránulos de polen de otros polinizadores que no exhiben un comportamiento de fidelidad floral, como los abejorros, a menudo contienen muchas especies de plantas y pueden no poseer un taxón predominante. En los casos en que se desean estimaciones cuantitativas de las proporciones de taxones en pellets de polen polifloral, se requieren métodos microscópicos que incluyen acetólisis para un análisis adecuado.
La evaluación de las características morfológicas de los granos de polen acetolizados es el método más común para la identificación taxonómica16. El procedimiento de acetólisis elimina el protoplasma del grano de polen para exponer características diagnósticas que pueden ser observadas bajo microscopía óptica37,38. Usando este método, los investigadores pueden reportar diferentes taxones, frecuencia de taxones encontrados en sistemas de cultivo específicos y taxones predominantes de colores de pellets33,36. La acetólisis es la mejor técnica analítica para revelar la morfología del polen28. Sin embargo, algunos granos de polen acetolizados, como muchos tipos de Rosaceae, no se pueden identificar a nivel de género o especie a través de la acetólisis y la microscopía óptica solamente. Los investigadores consideran la microscopía electrónica de barrido o el metabarcoding como métodos alternativos para lograr la identificación a nivel de género o especie. Estos métodos alternativos, sin embargo, sólo proporcionan identificación cualitativa de taxones y no logran estimar las proporciones de diferentes taxones de granos de polen en pellets de polen polifloral36,39. Además, el gasto y la experiencia necesaria son considerablemente mayores para estos métodos. Una comparación de estos métodos de identificación se ilustra en la Tabla 1.
| Métodos | Hora | Gasto | Resolución | Pericia |
| Recolección de polen | ||||
| Captura de polen | Bajo | Moderado | Variable | Moderado |
| Recolección de forrajeros de polen | Alto | Moderado | Alto | Bajo |
| Identificación del polen | ||||
| Visual (solo clasificación por color) | Moderado | Bajo | Bajo | Bajo |
| Acetólisis | Moderado | Moderado | Moderado | Moderado |
| Microscopía electrónica de barrido | Alto | Alto | Alto | Alto |
| Metabarcoding | Variable | Alto | Alto | Alto |
Tabla 1: Comparación de diferentes métodos de recolección e identificación de polen basados en tiempo, gasto, resolución y experiencia. Los métodos visuales (solo clasificación por colores) informan el número total de colores detectados o la proporción del total representado por cada grupo de colores como una métrica para determinar las fuentes de polen, pero no proporcionan identificación de taxones.
La información disponible sobre la captura y clasificación del polen y la acetolización de los granos de polen es diversa y a menudo se distribuye a través de múltiples fuentes, que varían para los investigadores en diferentes campos. Este documento ofrece información detallada sobre los diferentes tipos de trampas de polen que pueden ser utilizadas tanto por investigadores como por apicultores para recolectar de manera efectiva grandes volúmenes de polen corbicular. También se proporcionan protocolos para preparar muestras de polen, por acetólisis, tinción y montaje de portaobjetos, para la identificación de taxones de plantas. Las metodologías detalladas aquí son exhaustivas y sirven como un recurso único para identificar especies de plantas predominantes en las que las abejas melíferas se alimentan en un paisaje determinado, particularmente en los sistemas de cultivo. Se han presentado hallazgos basados en estos métodos de un estudio previo que documentan la diversidad de colores de pellets de polen y taxones de plantas a partir del polen corbicular recolectado por las abejas melíferas en cinco sistemas de cultivo14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los diferentes estilos de trampas de polen tienen sus propias ventajas y consecuencias. Los beneficios y limitaciones de cuatro estilos de trampa de uso común, (1) montaje frontal, (2) montaje inferior, (3) barrena y (4) trampas de polen de montaje superior se discuten a continuación. Las trampas de montaje frontal son el estilo más versátil (Figura 1B). La instalación es rápida y fácil; se puede hacer sin levantar cajas de colmenas, y estas trampas pueden caber en cualquier estilo Langstroth de equipo de colmena. Como la bandeja de recolección se encuentra frente a la colonia, recoge un mínimo de escombros de la colonia. Sin embargo, la bandeja de recolección también está más expuesta a elementos externos: la humedad del riego del campo, el clima lluvioso o húmedo, o el rocío puede entrar en contacto con el polen a través de la bandeja de recolección, lo que puede hacer que el polen sea inutilizable si los gránulos se saturan demasiado para separarse. El riesgo de saturación de polen puede reducirse evitando la captura durante los eventos pronosticados de lluvia o alta humedad. Colocar una estera de goma debajo de la trampa y material de cobertura adicional (por ejemplo, fieltro para techos) encima de la trampa de polen también puede proteger la bandeja de recolección del clima.
Se utilizaron trampas de montaje inferior para recolectar polen para los datos de este documento (Figura 1A). No son tan convenientes de instalar porque deben colocarse debajo del nido de cría de la colonia. La instalación requiere mucho tiempo y da como resultado un gran volumen de escombros que caen en la trampa de la colonia, como partes de abejas y pequeños trozos de cera. El piso de la bandeja de recolección para la mayoría de las trampas de montaje inferior fabricadas está hecho de malla fina, lo que permite una ventilación adecuada para proteger el polen recolectado de la humedad. Las trampas de polen de barrena ayudan a minimizar la desorientación de los recolectores si utilizan principalmente agujeros de barrena como entradas de colmena en lugar de la entrada hecha por el tablero inferior de la colmena (Figura 1C). Como la bandeja de recolección para trampas de polen con barrena es muy pequeña, debe vaciarse con frecuencia para evitar el desbordamiento de la bandeja de recolección. Dada su ubicación superior en una colmena, la trampa de polen de montaje superior es el estilo de trampa más fácil de instalar y quitar, y la muestra de polen recolectada está libre de restos de colmena. Sin embargo, este estilo de trampa es muy sensible al equipo de colmena dañado, ya que la bandeja de recolección estaría expuesta a la humedad si la tapa, la cubierta interior y la caja superior de la colmena no están selladas correctamente.
Los protocolos descritos en este documento requieren la selección de colonias con grandes poblaciones adultas y larvales (paso 1.2). Este método de selección está destinado a producir cantidades muy grandes de polen atrapado de estas colonias. Las colonias con poblaciones de forrajeo sustanciales pueden experimentar una gran congestión en la entrada tras la instalación de la trampa. Seleccionar una gran entrada de colmena aliviará la congestión. Las grandes poblaciones de forrajeo también pueden recolectar cantidades muy grandes de polen que pueden exceder los límites de la bandeja de recolección. Use bandejas de recolección voluminosas, como se ve con la mayoría de los estilos de trampas de montaje inferior o superior, y bandejas vacías con frecuencia para acomodar grandes cantidades de polen atrapado. Si el objetivo de investigación deseado es evaluar las cantidades de polen recolectadas por las colonias en un colmenar, seleccione colonias representativas en lugar de optimizar las poblaciones adultas y larvales para la selección. Todos los estilos de trampas de polen bloquean la entrada de la colmena y crean una nueva entrada que difiere espacialmente de la entrada original16. Las trampas de polen comúnmente no recolectan polen cuando los recolectores no pueden reorientarse a la nueva entrada de la trampa de polen después de la instalación. Estos recolectores se desplazan fácilmente a las colmenas vecinas, lo que podría contaminar otras muestras de recolección de polen si ingresan a otra colmena con una trampa de polen. Por lo tanto, a los recolectores se les debe dar al menos 24 h para aclimatarse a la nueva entrada, manteniendo el mecanismo de captura desconectado después de la instalación. La selección de colonias con pocas o ninguna entrada adicional de colmenas también reduce la confusión al orientarse hacia la nueva entrada de la trampa de polen.
Las entradas adicionales de la colmena (por ejemplo, agujeros y tapas deformadas) deben sellarse, pero el riesgo de que los recolectores se desvíen hacia colmenas vecinas aumentará con estas entradas presentes al comienzo de la instalación de la trampa. Los recolectores también se desplazarán fácilmente hacia otras entradas de colmenas si se instala una trampa de polen solo en una colmena en un grupo de colmenas paletizadas. Es menos probable que los recolectores se desvíen si todas las colmenas que miran hacia la misma dirección en la plataforma tienen trampas instaladas. Las trampas de polen de montaje superior pueden representar un mayor riesgo de deriva de abejas debido a la distancia sustancial entre la entrada de la trampa de polen y la entrada original de la colmena. Para este estudio, se instalaron trampas de polen en múltiples colonias de abejas melíferas en cada ubicación experimental para tener en cuenta la variación en la cantidad de polen y la composición de taxones entre cada colonia de abejas melíferas. Por lo tanto, las trampas de polen deben instalarse en múltiples colonias para lograr colecciones de polen robustas del paisaje porque la recolección de polen puede variar ampliamente entre colonias según el tipo de especie de planta y la cantidad total recolectada12,13. Cada muestra de polen tuvo un período de recolección de 7 días. En estudios futuros, la recolección de polen en dos o tres intervalos consecutivos de 72 h aumentará la precisión de la estimación del polen forrajero40.
Como existe un alto grado de fluctuación temporal en la recolección de polen, la precisión de la estimación del polen podría aumentarse repitiendo el proceso de recolección de polen en los períodos de floración temprana, máxima y tardía de los sistemas de cultivo objetivo24,27,39. El polen debe recolectarse de múltiples ubicaciones, aunque sean del mismo sistema de cultivo o tipo de paisaje, debido a la variación anticipada en cantidad y tipo de especie de planta entre las ubicaciones de los colmenares 14,27,33,43. La captura de polen a largo plazo puede ser perjudicial para las colonias de abejas melíferas. Los impactos potenciales incluyen la reducción de la cría de crías, el acortamiento del período de crecimiento larvario y el canibalismo de huevos y larvas jóvenes en las colmenas 19,44,45,46. Los períodos más largos de captura de polen, como toda la temporada de crecimiento, pueden empeorar los efectos nocivos sobre la cría de crías en colonias. La captura de polen también puede causar una reducción en la producción de miel y un aumento en el nivel de humedad de la miel almacenada13. La rotación de trampas de polen entre colonias en un colmenar cuando se monitorea continuamente un paisaje o sistema de cultivo podría mitigar el daño a las colonias utilizadas para la captura de polen. Utilizar trampas de polen cada dos semanas reducirá los impactos perjudiciales, particularmente la pérdida en la producción de miel, si atrapa polen en las mismas colonias durante un período de tiempo13.
Además, las trampas de polen se colocan preferiblemente en colonias fuertes. Ocasionalmente, las trampas de polen pueden activarse involuntariamente. Esto podría evitarse bloqueando el mecanismo de la trampa de polen cuando no se desea la recolección de trampas de polen. Las trampas de polen no eliminan todo el polen corbicular de las abejas recolectoras de abejas. La eficiencia de captura depende del tipo de trampa, el tamaño del pellet de polen, el tamaño del cuerpo de la abeja, la hora del día y las condiciones climáticas. Por lo tanto, la recolección de polen corbicular no es consistente cuando se utilizan trampas de polen para diferentes especies de plantas y períodos de recolección25,26. Los pellets de polen más pequeños de plantas como Eucalyptus spp. y Tamarix spp. tienen menos probabilidades de ser capturados por trampas de polen27. En particular, no se encontró polen de arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum L.) en los sitios de recolección de arándanos de arbusto alto en este estudio, lo que respalda la evidencia previa de que los gránulos de polen de arándanos de arbusto alto son demasiado pequeños para la recolección de trampas de polen47. En contraste, el polen obtenido del diente de león (Taraxacum officinale F.H. Wigg) se encontró en todos los sistemas de cultivo en este estudio. Los pellets de polen de algunas especies de plantas también pueden ser mucho más grandes que otros, como Taraxacum spp., y posiblemente podrían estar sobrerrepresentados en el análisis de las colecciones de polen de trampas de polen27. La captura de recolectores de polen individuales y la eliminación manual de su polen corbicular aumentará la precisión de una evaluación de la fuente de polen, pero requiere mucho tiempo y recursos en comparación con el uso de trampas de polen (Tabla 1). La clasificación de los gránulos de polen en grupos de color es relativamente sencilla, aunque lleva mucho tiempo. A menos que haya una meta u objetivo de investigación específico, la cantidad de pellets de polen debe limitarse a 10 g o menos (para cualquier muestra dada) para clasificar en grupos de color. La clasificación de muestras enteras que contienen cantidades mayores que esta cantidad aumentará drásticamente el tiempo requerido para completar el análisis. Sin embargo, es crucial que una muestra de polen esté muy bien mezclada antes de tomar una submuestra para la clasificación de colores. No mezclar la muestra original puede resultar en una submuestra que no es representativa del todo, lo que debe evitarse.
Si el recipiente original de la muestra no contiene suficiente espacio libre para permitir una mezcla completa de pellets de polen, colocar toda la muestra en una bolsa de plástico grande o una bolsa de papel pequeña debería ser suficiente, incluso para muestras grandes. Los recipientes de plástico duro con tapa también funcionarán. La mezcla de la muestra debe hacerse suavemente, de modo que los gránulos de polen no se aplasten ni se destruyan de otra manera. El sesgo involuntario podría persuadir inconscientemente a uno a sacar “los bonitos gránulos púrpuras”, por ejemplo, al eliminar una submuestra del conjunto. Por lo tanto, la composición de color de la muestra debe ocultarse de la vista mientras se extrae una submuestra. De esta manera, es más probable obtener una submuestra que sea verdaderamente representativa del todo. Sin embargo, este método de submuestreo podría no seleccionar pellets de polen que están en baja abundancia en la muestra. Por lo tanto, si la identificación de cada taxón de plantas individual representado en la muestra es un objetivo de investigación, la recolección de una submuestra no será apropiada; Se debe analizar toda la muestra. Por lo tanto, los pellets deben clasificarse en una placa de Petri de vidrio. Una vez que se completa la clasificación, se pueden colocar las páginas apropiadas de la guía de color Pantone debajo del plato para facilitar la coincidencia de colores entre la guía y el polen clasificado. Un ejemplo de esto se ilustra en la Figura 5.
Al atrapar el polen de las colonias de abejas melíferas colocadas en cultivos para la polinización, no se deben usar más de diez grupos de colores totales: nueve colores individuales y un grupo de colores “misceláneos” compuesto por los colores minoritarios en la muestra. Establecer un límite razonable en el número máximo de grupos de color en los que se puede dividir una muestra evita que el investigador se atasque al separar interminablemente los gránulos en un número cada vez mayor de grupos extremadamente específicos, que, cuando se completa la clasificación, pueden no contener individualmente cantidades suficientes para la acetólisis. Si se captura a partir de colonias que probablemente se alimentan de una variedad muy diversa de especies de plantas, pueden ser necesarios más grupos de colores, y los protocolos deben optimizarse para reflejar ese requisito. El presente estudio se centró en las muestras de polen recolectadas de colonias de abejas melíferas que polinizaban cultivos, y se encontraron comúnmente múltiples taxones en un grupo de color, similar a estudios previos 29,30,31.
La acetólisis disuelve los lípidos, proteínas y desechos orgánicos de la superficie de los granos de polen, revelando los caracteres distintivos de la exina, de modo que los granos se pueden teñir e identificar más fácilmente. Es una metodología antigua y común utilizada en muchos tipos de investigación del polen37. Los pasos generales están estandarizados; Varían poco de un protocolo a otro. Sin embargo, los detalles de las velocidades y tiempos de centrifugación, la temperatura y duración de la incubación, los volúmenes de reactivos impulsados por la cantidad de polen e incluso el método de eliminación del sobrenadante (decantación vs pipeteo) pueden necesitar ser optimizados experimentalmente de acuerdo con los objetivos de la investigación y, en cierta medida, los tipos de polen que probablemente se encontrarán48. De hecho, la acetólisis puede eliminar importantes caracteres diagnósticos del polen de algunos taxones como Malvaceae y Orchidaceae38. Por lo tanto, no todo el polen es susceptible a los métodos estándar de acetólisis. Como se indicó anteriormente, estos métodos se optimizaron en este estudio con el fin de identificar las fuentes dominantes de polen de taxones vegetales recolectados por las abejas melíferas polinizadoras de cultivos. Los detalles que deben considerarse si la cuantificación precisa de los granos de polen es parte del estudio, no se han abordado en este documento.
El uso de solventes y ácidos requiere una planificación cuidadosa, equipo de protección personal (EPP) adecuado y eliminación responsable de desechos (Figura 6). Es fundamental que los investigadores determinen la forma correcta de almacenar los reactivos y eliminar los residuos antes de comenzar cualquier parte de la acetólisis. En este laboratorio, los guantes de butilo se utilizan durante cualquier parte del proceso que involucre ácido sulfúrico e incluso ácido acético glacial, ya que tienen calificaciones de degradación y permeación mucho mejores para ambos ácidos que los guantes de nitrilo, sin comprometer la destreza49. Sería prudente consultar las directrices de seguridad de la institución respectiva para obtener recomendaciones sobre guantes apropiados y otros EPP49. La adición de ácido acético glacial antes de la etapa de acetólisis ayuda a eliminar cualquier humedad residual en la muestra y la prepara para la importante reacción de acetólisis. La mezcla de ácido acético glacial-ácido sulfúrico en la etapa de acetólisis puede reaccionar violentamente con el agua, por lo que es importante que toda la cristalería y los suministros estén completamente secos, y que toda la humedad se elimine de la muestra antes de la acetólisis. La adición post-acetólisis de ácido acético glacial diluye y neutraliza la mezcla de acetólisis.
El etanol y el ácido acético glacial, en particular, pueden disolver la tinta de las etiquetas de los tubos de microcentrífuga, si estos reactivos gotean en el exterior del tubo, incluso con plumas resistentes a los solventes. Revise las etiquetas de los tubos con frecuencia durante todo el proceso para asegurarse de que aún sean legibles. Si es logísticamente factible, considere el uso de etiquetas impresas con LaserJet como protección contra esta posibilidad. La forma en que se decantan los sobrenadantes influirá en si los reactivos gotean por el exterior de los tubos de microcentrífuga. Es importante decantar el sobrenadante con una mano segura y suave, que viene con la práctica. Se debe tener cuidado para evitar la pérdida de muestras de polen del tubo de centrífuga durante la decantación. Decantar demasiado rápido corre el riesgo de perder parte o la totalidad del residuo de polen; La decantación demasiado lenta puede hacer que el sobrenadante corra por el tubo. Aunque comúnmente se recomienda una temperatura de incubación de 100 °C, el polen podría fácilmente “cocerse en exceso” a esa temperatura en las cantidades utilizadas en este estudio (0,25 g), particularmente si se incuba por duraciones ligeramente más largas29. De hecho, incluso a 80 ° C, los granos de polen pueden estallar o dañarse si se dejan en la mezcla de acetólisis demasiado tiempo. La temperatura y la duración de la incubación deben determinarse cuidadosamente para evitar la destrucción de los granos de polen en la muestra.
La tinción del polen aumenta la definición y el contraste de las características de la exina, lo que facilita la fotografía y la identificación (Figura 7). Cinco gotas (de una pipeta de transferencia de plástico) de Safranin O al 1% tiñeron efectivamente 0,25 g de polen. Sin embargo, diferentes pólenes se tiñen de manera diferente. Si los granos de polen se manchan demasiado ligeramente o demasiado, la identificación puede ser difícil. Cuando sea posible, deberá validarse el volumen de la solución de tinción necesaria para teñir adecuadamente las especies de polen que se espera encontrar en el estudio antes de comenzar el procesamiento de las muestras experimentales. Sin embargo, si una de las muestras experimentales no se tiñe adecuadamente, se puede corregir. Para aclarar una muestra de polen que está manchada demasiado, enjuague la muestra con agua y luego etanol. Si el polen no está lo suficientemente bien como para ver características distintivas, se pueden agregar algunas gotas adicionales de mancha. La tinción de estas muestras debe verificarse antes de agregar glicerina. Del mismo modo, puede ser necesario un poco de prueba y error para determinar el volumen ideal de glicerina para los residuos de polen. Quince gotas de glicerina protegieron adecuadamente las muestras en este estudio de la desecación, al tiempo que diluyeron el residuo de polen a una concentración ideal para la identificación posterior a través de microscopía óptica. Otras cantidades de residuos de polen pueden requerir más o menos glicerina para evitar la desecación y facilitar el montaje.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) por ayudar con la clasificación de colores y el análisis de acetólisis. Esta investigación fue apoyada por fondos de investigación proporcionados a R.R.S. por la Asociación de Apicultores del Estado de Oregón.
Materials
| #8 hardware cloth | 2.7 mm aperture | ||
| 10 mL graduated cylinder | |||
| 1000 uL micropipette tips | |||
| 1250 mL filter micropipette tips | |||
| 15 x 75 mm glass slides | Thickness: 0.93 mm – 1.05 mm | ||
| 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| 250 mL graduated Borosilicate glass beakers (x3) | VWR | 10754-952 | |
| 50 mL graduated Borosilicate glass beakers (x6) | VWR | 10754-946 | |
| 95% EtOH | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/Kosher grade |
| Butyl vinyl gloves | |||
| Centrifuge | 1060 x g maximum speed; horizontal swing preferred | ||
| Chemical safety goggles | |||
| Color guide | Pantone | SKU: GP1601A | Solid coated |
| Coverslip of 1 or 1.5 | Thickness: 0.13 mm – 0.19 mm | ||
| Distilled water | |||
| Forceps | |||
| Fume hood | |||
| Glacial acetic acid | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS grade |
| Glass funnel | |||
| Glycerin | Humco | 103196001_1 | USP grade, 99.5%, anhydrous |
| Hazardous waste containers | |||
| Hive tool | |||
| Hot block | Must reach 80 degree C | ||
| Lab coat with long sleeves | |||
| Latex or polyurethane foam | |||
| Microscope | |||
| Nailpolish, clear | |||
| Nitrile gloves | |||
| P1000 pipette | VWR | ||
| Petri dish | |||
| Plastic spoon | |||
| Safranin | Ward's Science | 470302-322 | Lab grade |
| Smoker | For pollen trap installation | ||
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | ACS grade, powder |
| Squirt bottles (x2) | |||
| Sulfuric acid | EMD Millipore | SX1244 | ACS grade |
| Sundance Bottom Mount Pollen Trap | Betterbee Beekeeping Supply | PTRAPB | |
| Tape | |||
| Wooden stir sticks | |||
| Wooden tooth picks |
Riferimenti
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