Indução de Microstreaming por Oscilações de Bolhas Não Esféricas em um Sistema de Levitação Acústica

Na medicina, um medicamento administrado deve penetrar em muitos obstáculos no sistema vivo antes de atingir os alvos desejados. No entanto, a maioria das drogas são rapidamente limpas longe da corrente sanguínea. A eficiência do direcionamento é baixa e eles não podem atravessar facilmente as membranas celulares, levando à entrega ineficaz de drogas. Atualmente, o uso de microbolhas em combinação com o ultrassom tem sido proposto como um método inovador para a liberação não invasiva, precisa e direcionada de fármacos e genes para tecidos e células^{patológicas1}. Nesta abordagem, as microbolhas podem desempenhar um papel como transportadores onde as drogas livres são co-injetadas com uma suspensão de bolha de gás ou carregadas em sua superfície. As microbolhas também podem atuar como um vetor local para redirecionar a energia do ultrassom, a fim de interagir com as células. Basicamente, sob exposição ao ultrassom, as bolhas se comprimem e se expandem de forma estável, um regime chamado cavitação estável que gera fluxos de líquido e, portanto, estresse de cisalhamento em objetos próximos. As microbolhas também podem oscilar de forma não linear e expandir-se até o colapso, em regime de cavitação inercial, produzindo ondas de choque que se propagam radialmente a partir do local do colapso². Tem sido demonstrado que a cavitação, estável ou inercial, aumenta a permeabilização das membranas celulares e, assim, aumenta a internalização de fármacos na célula³.

Em aplicações terapêuticas, entender o mecanismo da interação célula-bolha é muito importante, mas existem várias barreiras, tanto do lado científico quanto técnico, que impedem que nosso conhecimento avance. Primeiro, capturar a dinâmica das células em resposta a estímulos mecânicos induzidos por bolhas é muito^difícil4. Na escala de tempo acústica, as oscilações de microbolhas de primeira ordem podem levar à ativação de canais de membrana, facilitando a passagem molecular através de interfaces biológicas. Isso ocorre por meio da oscilação direta da membrana celular, também chamada de “massagem celular”⁵. A ativação do canal após estresse mecânico direto foi evidenciada usando técnicas de patch-clamp que mediram as propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares durante e após a exposição ao ultrassom⁶. A medição da dinâmica celular induzida por bolhas (ou seja, o campo completo de deformação da membrana celular) na escala de tempo acústica também forneceria informações sobre o limiar de expansão da área da membrana Δ A/A necessário para induzir poros na membrana celular⁷. A segunda barreira é controlar o regime de bolhas em colapso para evitar a lise celular induzida por microbolhas. Colapsos de bolhas e microjatos induzidos têm sido identificados como mecanismo pelo qual ocorre perfuração da membrana ^8,9. Uma vez permeabilizada, a membrana celular se repara através do auto-selamento das bicamadas lipídicas com cálcio e fusão das vesículas intracelulares⁹. A ocorrência de colapsos de bolhas também pode causar danos letais à célula e induzir efeitos colaterais desnecessários nas vizinhas. Em aplicações sensíveis, como a abertura da barreira hematoencefálica mediada por ultrassom, é geralmente aceito que colapsos de bolhas inerciais devem ser evitados¹⁰.

Portanto, grandes esforços são atualmente dedicados ao projeto de sequências de emissão de ultrassom, juntamente com o monitoramento e controle passivo da cavitação, a fim de garantir oscilações estáveis das^{microbolhas11}. Nesse regime estável, foi levantada a hipótese de que bolhas oscilantes estáveis desempenham um forte papel no desencadeamento da permeabilização da membrana, promovendo tensões de cisalhamento espacialmente direcionadas na membrana celular⁷. A tensão de cisalhamento resulta dos fluxos de líquidos criados nas proximidades das bolhas oscilantes. Esses fluxos líquidos são chamados de cavitation microstreaming, e, como mencionado acima, são um dos vários mecanismos possíveis responsáveis pelo aumento da captação de moléculas extracelulares. Quando se trata de suspensão de bolhas ou células, como ensaios de transfecção biológica in vitro¹², a permeabilização por microstreaming pode ser muito mais eficiente do que a permeabilização por colapso de bolhas. Isso pode ser demonstrado por uma simples consideração geométrica. Em suspensões celulares, a sonoporação será eficiente se a maioria das células em suspensão for submetida a efeitos mecânicos suficientemente grandes (levando à permeabilização da membrana). Sabe-se que os colapsos de bolhas são direcionados na direção da quebra de simetria isotrópica, como o eixo parede-bolhas¹³ ou a linhagem bolha-bolha e célula-bolha unindo seu centro de massa¹⁴. O microjato produzido é, portanto, um fenômeno espacialmente localizado ao longo de um número finito de linhas que unem os centros celulares e de bolhas. Dependendo da concentração celular e de bolhas, bem como da distância célula-bolha, esse efeito pode não ser o mais eficiente para permeabilizar todo o número de células em suspensão. Em contraste, o microfluxo de cavitação é um fenômeno que ocorre em uma escala de tempo lenta, com uma grande expansão espacial em comparação com o raio da bolha. Além disso, o fluxo de líquido é distribuído por toda a bolha, podendo, portanto, impactar um número maior de células, em um intervalo muito longo. Portanto, entender o microfluxo de cavitação gerado em torno de uma bolha oscilante é um pré-requisito para controlar e quantificar a tensão de cisalhamento induzida por bolhas que é aplicada às células.

Para tanto, uma etapa preliminar consiste em controlar as oscilações esféricas e não esféricas de uma bolha impulsionada por ultrassom, uma vez que os fluxos líquidos gerados são induzidos pelo movimento da interface da bolha^15,16. Em particular, as oscilações de forma das microbolhas devem ser acionadas e mantidas estáveis. Além disso, a orientação das oscilações da forma da bolha deve ser controlada para analisar adequadamente a correlação entre a dinâmica da interface da bolha e o padrão de microstreaming induzido. Ao resumir a literatura existente, é óbvio que resultados experimentais detalhados de microfluxo induzido por cavitação estão disponíveis apenas para bolhas presas a uma superfície. Microbolhas acopladas à parede são comumente usadas para avaliar a dinâmica precisa da interface e interações celulares na escala micrométrica sob um sistema de microscopia ultrarrápida. Essa configuração é terapeuticamente relevante quando se considera microbolhas vibratórias localizadas na membrana celular^17,18,19. O estudo da bolha acoplada ao substrato pode, no entanto, tornar a análise da dinâmica das bolhas mais complicada, em parte devido à natureza complexa da dinâmica das linhas de contato²⁰ e ao desencadeamento de modos de forma assimétricos²¹. Em aplicações médicas e biológicas, bolhas que não estão presas a uma parede são comumente encontradas em geometrias confinadas, como pequenos vasos. Isso afeta significativamente a dinâmica das bolhas e as instabilidades de forma. Particularmente, a presença de uma parede próxima desloca o limiar de pressão para o acionamento do modo de forma para valores de pressão mais baixos, dependendo do número do modo de forma e do tamanho da bolha²². A parede também afeta o microfluxo induzido por bolhas com possivelmente maior intensidade para o fluxo produzido²³.

Entre todos os cenários possíveis que as microbolhas podem experimentar (livres ou presas, próximas a uma parede, colapsando ou oscilando de forma estável), propomos investigar a dinâmica não esférica de uma única bolha longe de qualquer fronteira. O arranjo experimental é baseado em um sistema de levitação acústica²⁴ no qual uma onda de ultrassom estacionária é usada para aprisionar a bolha. Esse cenário é consistente com aplicações médicas em que uma coleção de bolhas e células suspensas coexistem em uma câmara de sonotransfecção, por exemplo. Na medida em que bolhas e células não estão muito próximas, supõe-se que a presença de uma célula não afeta a dinâmica da interface de bolhas. Quando as células seguem as trajetórias em loop do microfluxo induzido por cavitação, elas estão ciclicamente se aproximando e repelindo do local da bolha e podemos supor que a presença celular não impacta nem o padrão de fluxo nem sua velocidade média. Além disso, a dinâmica não esférica e o microfluxo induzido a partir de bolhas únicas longe da fronteira são bem conhecidos do ponto de vista teórico. Para ligar o fluxo de líquido induzido por bolhas à dinâmica do contorno de bolhas, é necessário caracterizar com precisão a dinâmica da interface de bolhas. Para tanto, é preferível adaptar a escala espaço-temporal em estudos experimentais em relação àquelas utilizadas na terapêutica para que a aquisição com câmeras comuns de alta velocidade (abaixo de 1 milhão de frames/segundo) seja possível utilizando grandes bolhas excitadas em frequências mais baixas. Ao considerar bolhas não revestidas, a autofrequência ω n de um dado modo _n está relacionada ao tamanho da bolha como ²⁵. Essa relação rádio-autofreqüência é ligeiramente modificada quando se consideram bolhas descascadas²⁶, mas a ordem de grandeza da autofreqüência ω_n permanece a mesma. Assim, investigar bolhas com raios de equilíbrio ~50μm em um campo de ultrassom de 30 kHz é semelhante ao estudo de bolhas revestidas de raios ~3μm em um campo de 1,7 MHz, como proposto por Dollet et ^al.27. Números de modo de forma semelhantes e, portanto, padrões de microstreaming são, portanto, esperados.

Para desencadear oscilações não esféricas da interface de bolhas, é necessário exceder um determinado limiar de pressão que é dependente do raio, como mostrado na Figura 1. As técnicas experimentais existentes baseiam-se no aumento da pressão acústica para desencadear modos de superfície (ilustrado pelo caminho (1) na Figura 1), seja pelo aumento passo a passo da pressão²⁸ ou pela excitação de amplitude modulada responsável pelo início periódico e extinção dos modos de superfície²⁹. As principais desvantagens dessas técnicas são (i) uma orientação aleatória do eixo de simetria das oscilações da superfície que não pode ser controlada para estar no plano da imagem, (ii) uma curta vida útil das oscilações da forma da bolha que dificulta a análise dos fluxos de líquido induzidos em escalas de tempo maiores, e (iii) o desencadeamento frequente de modos de forma instáveis. Propomos uma técnica alternativa para cruzar o limiar de pressão a uma pressão acústica constante no mapa de raio/pressão, como ilustrado pelo caminho (2) na Figura 1. Para isso, é necessário aumentar o tamanho da bolha de forma que ela fique na zona de instabilidade. Tal aumento é realizado por uma técnica de coalescência de bolhas. A coalescência de duas microbolhas, inicialmente oscilantes esfericamente, é explorada para criar uma única bolha deformada. Se a pressão acústica e o tamanho da bolha coalescida estiverem na zona de instabilidade, os modos de superfície serão acionados. Também evidenciamos que a técnica de coalescência induz oscilações de forma estáveis em regime de estado estacionário, bem como um eixo de simetria controlado definido pelo movimento retilíneo das duas bolhas que se aproximam. Como uma oscilação de forma estável é garantida ao longo de minutos, a análise do fluxo de fluido induzido por bolhas é possível semeando o meio líquido com micropartículas fluorescentes, iluminadas por uma fina folha de laser. O registro do movimento das micropartículas sólidas nas proximidades da interface de bolhas permite identificar o padrão do fluxo de fluido induzido³⁰. O princípio geral do desencadeamento de oscilações em forma de bolha, levando a um fluxo de fluido estável no tempo, é ilustrado na Figura 2.

No protocolo a seguir, descrevemos os passos necessários para criar oscilações estáveis em forma de bolhas através da técnica de coalescência e descrevemos as medidas de fluxo de fluido. Isso inclui o projeto do sistema de levitação acústica, a calibração acústica, a nucleação de bolhas e a técnica de coalescência, a medição da dinâmica da interface de bolhas e do fluxo de fluido circundante e o processamento de imagens.