Induktion von Mikroströmungen durch nichtsphärische Blasenschwingungen in einem akustischen Levitationssystem

In der Medizin muss ein verabreichtes Medikament viele Hindernisse im lebenden System durchdringen, bevor es die gewünschten Ziele erreicht. Die meisten Medikamente werden jedoch schnell aus dem Blutkreislauf entfernt. Die Targeting-Effizienz ist gering und sie können die Zellmembranen nicht leicht durchdringen, was zu einer unwirksamen Wirkstoffabgabe führt. Derzeit wird die Verwendung von Mikrobläschen in Kombination mit Ultraschall als innovative Methode für die nicht-invasive, präzise und gezielte Verabreichung von Medikamenten und Genen an pathologische Gewebe und Zellen vorgeschlagen¹. Bei diesem Ansatz können Mikrobläschen als Träger eine Rolle spielen, bei denen freie Medikamente entweder mit einer Gasblasensuspension co-injiziert oder auf deren Oberfläche geladen werden. Mikrobläschen können auch als lokaler Vektor für die Neufokussierung der Ultraschallenergie fungieren, um mit den Zellen zu interagieren. Grundsätzlich komprimieren und dehnen sich Blasen unter Ultraschallbestrahlung stabil aus, ein Bereich, der als stabile Kavitation bezeichnet wird und Flüssigkeitsströme und damit Scherspannungen auf nahe gelegene Objekte erzeugt. Mikrobläschen können auch nichtlinear schwingen und sich im Bereich der Trägheitskavitation bis zum Kollaps ausdehnen, wobei Stoßwellen erzeugt werden, die sich radial von der Kollapsstelle² ausbreiten. Es hat sich gezeigt, dass Kavitation, ob stabil oder träge, die Permeabilisierung von Zellmembranen und damit die Internalisierung von Medikamenten in die Zelle verbessert³.

In therapeutischen Anwendungen ist es sehr wichtig, den Mechanismus der Blasen-Zell-Interaktion zu verstehen, aber es gibt mehrere Hindernisse, sowohl von wissenschaftlicher als auch von technischer Seite, die unseren Wissensfortschritt verhindern. Erstens ist es sehr schwierig, die Dynamik von Zellen als Reaktion auf blaseninduzierte mechanische Reize zu erfassen⁴. Auf der akustischen Zeitskala können die Mikroblasenoszillationen erster Ordnung zu einer Aktivierung von Membrankanälen führen, was die molekulare Passage über biologische Grenzflächen erleichtert. Dies geschieht durch die direkte Schwingung der Zellmembran, auch “Zellmassage” ^genannt5. Die Kanalaktivierung nach direkter mechanischer Belastung wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Techniken nachgewiesen, die die elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellmembranen während und nach der Ultraschallexposition messen⁶. Die Messung der blaseninduzierten Zelldynamik (d.h. des gesamten Verformungsfeldes der Zellmembran) auf der akustischen Zeitskala würde auch Einblicke in den Schwellenwert der Membranflächenausdehnung Δ A/A liefern, der erforderlich ist, um Poren in die Zellmembran zu induzieren⁷. Die zweite Barriere besteht darin, das kollabierende Blasenregime zu kontrollieren, um eine durch Mikrobläschen induzierte Zelllyse zu vermeiden. Blasenkollapse und induzierte Mikrojets wurden als ein Mechanismus identifiziert, durch den die Perforation der Membran erfolgt ^8,9. Nach der Permeabilisierung repariert sich die Zellmembran durch Kalziumselbstabdichtung der Lipiddoppelschichten und Fusion intrazellulärer Vesikel⁹. Das Auftreten von Blasenkollapsen kann auch tödliche Schäden an der Zelle verursachen und unnötige Nebenwirkungen in der Umgebung hervorrufen. Bei sensiblen Anwendungen, wie z. B. der ultraschallvermittelten Öffnung der Blut-Hirn-Schranke, ist es allgemein anerkannt, dass Trägheitsblasenkollapse vermieden werden sollten¹⁰.

Daher werden derzeit große Anstrengungen in die Entwicklung von Ultraschall-Emissionssequenzen in Verbindung mit passiver Kavitationsüberwachung und -steuerung gesteckt, um stabile Schwingungen von Mikrobläschen^{zu gewährleisten 11}. In diesem stabilen Regime wurde die Hypothese aufgestellt, dass stabil oszillierende Blasen eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Membranpermeabilisierung spielen, indem sie eine räumlich gezielte Scherspannung auf die Zellmembran^{fördern 7}. Die Scherspannung ergibt sich aus den Flüssigkeitsströmen, die in der Nähe der oszillierenden Blasen entstehen. Diese Flüssigkeitsströmungen werden als Kavitations-Mikrostreaming bezeichnet und sind, wie oben erwähnt, einer von mehreren möglichen Mechanismen, die für eine verstärkte Aufnahme extrazellulärer Moleküle verantwortlich sind. Bei der Suspension von Blasen oder Zellen, wie z. B. bei biologischen In-vitro-Transfektionsassays¹², könnte die Permeabilisierung durch Mikrostreaming viel effizienter sein als die Permeabilisierung durch Blasenkollaps. Dies kann durch eine einfache geometrische Betrachtung gezeigt werden. Bei Zellsuspensionen ist die Sonoporation effizient, wenn der Großteil der suspendierten Zellen ausreichend großen mechanischen Effekten ausgesetzt ist (was zu einer Membranpermeabilisierung führt). Es ist bekannt, dass Blasenkollapse entlang der Richtung der isotropen Symmetriebrechung gerichtet sind, wie z. B. die Blasenwandachse¹³ oder die Blasen-Blase- und Blasenzellenlinie, die ihren Massenschwerpunkt¹⁴ verbinden. Der erzeugte Mikrojet ist also ein räumlich lokalisiertes Phänomen entlang einer endlichen Anzahl von Linien, die die Zell- und Blasenzentren verbinden. Abhängig von der Zell- und Blasenkonzentration sowie dem Abstand zwischen Blase und Zelle ist dieser Effekt möglicherweise nicht der effizienteste, um die gesamte Anzahl der suspendierten Zellen zu permeabilisieren. Im Gegensatz dazu ist Kavitations-Microstreaming ein Phänomen, das auf einer langsamen Zeitskala auftritt und im Vergleich zum Blasenradius eine große räumliche Ausdehnung aufweist. Außerdem ist der Flüssigkeitsstrom um die Blase herum verteilt und kann daher eine größere Anzahl von Zellen in einer sehr großen Entfernung beeinflussen. Daher ist das Verständnis der erzeugten Kavitations-Mikroströmung um eine oszillierende Blase eine Voraussetzung für die Kontrolle und Quantifizierung der blaseninduzierten Scherspannung, die auf Zellen ausgeübt wird.

Zu diesem Zweck besteht ein vorbereitender Schritt darin, die sphärischen und nichtsphärischen Schwingungen einer ultraschallgetriebenen Blase zu steuern, da die erzeugten Flüssigkeitsströme durch die Bewegung der Blasengrenzfläche^{15, 16} induziert werden. Insbesondere müssen Formschwingungen von Mikrobläschen ausgelöst und stabil gehalten werden. Darüber hinaus muss die Orientierung der blasenförmigen Oszillationen kontrolliert werden, um die Korrelation zwischen der Dynamik der Blasengrenzfläche und dem induzierten Mikroströmungsmuster zu analysieren. Fasst man die vorhandene Literatur zusammen, so fällt auf, dass detaillierte experimentelle Ergebnisse des kavitationsinduzierten Mikrostreamings nur für Blasen vorliegen, die an einer Oberfläche haften. An der Wand befestigte Mikrobläschen werden häufig verwendet, um die genaue Grenzflächendynamik und Zellinteraktionen auf der Mikrometerskala unter einem ultraschnellen Mikroskopiesystem zu beurteilen. Diese Konfiguration ist therapeutisch relevant, wenn vibrierende Mikrobläschen auf der Zellmembran^17,18,19 betrachtet werden. Die Untersuchung von substratgebundenen Blasen kann jedoch die Analyse der Blasendynamik komplizierter machen, was zum Teil auf die komplexe Natur der Kontaktliniendynamik²⁰ und das Auslösen asymmetrischer Formmoden²¹ zurückzuführen ist. In medizinischen und biologischen Anwendungen finden sich Blasen, die nicht an einer Wand befestigt sind, häufig in begrenzten Geometrien wie kleinen Gefäßen. Dies wirkt sich erheblich auf die Blasendynamik und Forminstabilitäten aus. Insbesondere verschiebt das Vorhandensein einer Wand in der Nähe die Druckschwelle für das Auslösen des Formmodus auf niedrigere Druckwerte in Abhängigkeit von der Anzahl der Formformen und der Blasengröße²². Die Wand wirkt sich auch auf die blaseninduzierte Mikroströmung mit möglicherweise höherer Intensität für die erzeugte Strömung²³ aus.

Unter all den möglichen Szenarien, die Mikrobläschen erleben können (frei oder anhaftend, in der Nähe einer Wand, kollabierend oder stabil oszillierend), schlagen wir vor, die nichtsphärische Dynamik einer einzelnen Blase weit weg von jeder Grenze zu untersuchen. Der Versuchsaufbau basiert auf einem akustischen Levitationssystem²⁴, bei dem eine stehende Ultraschallwelle verwendet wird, um die Blase einzufangen. Dieses Szenario steht im Einklang mit medizinischen Anwendungen, bei denen beispielsweise eine Ansammlung von Schwebeblasen und Zellen in einer Sonotransfektionskammer koexistieren. Soweit Blasen und Zellen nicht zu nahe beieinander liegen, wird angenommen, dass das Vorhandensein einer Zelle keinen Einfluss auf die Dynamik der Blasengrenzfläche hat. Wenn Zellen den schleifenartigen Trajektorien der kavitationsinduzierten Mikroströmung folgen, nähern sie sich zyklisch der Blasenposition und stoßen sich von ihr ab, und wir können davon ausgehen, dass die Anwesenheit der Zelle weder das Strömungsmuster noch ihre mittlere Geschwindigkeit beeinflusst. Darüber hinaus sind aus theoretischer Sicht nichtsphärische Dynamik und induzierte Mikroströmungen aus einzelnen Blasen, die weit von der Grenze entfernt sind, bekannt. Um die blaseninduzierte Flüssigkeitsströmung mit der Dynamik der Blasenkontur zu verknüpfen, ist es erforderlich, die Dynamik der Blasengrenzfläche genau zu charakterisieren. Um dies zu erreichen, ist es vorzuziehen, die räumlich-zeitliche Skala in experimentellen Studien so anzupassen, dass die Aufnahme mit herkömmlichen Hochgeschwindigkeitskameras (unter 1 Million Bildern/Sekunde) durch die Verwendung großer Blasen, die bei niedrigeren Frequenzen angeregt werden, möglich ist. Bei der Betrachtung von unbeschichteten Blasen wird die Eigenfrequenz ω n einer gegebenen Mode _n mit der Blasengröße als ²⁵ in Beziehung gesetzt. Diese Radius-Eigenfrequenz-Beziehung wird bei der Betrachtung von geschälten Blasen²⁶ leicht modifiziert, aber die Größenordnung der Eigenfrequenz ω_n bleibt gleich. Daher ist die Untersuchung von Blasen mit Gleichgewichtsradien ~50 μm in einem 30-kHz-Ultraschallfeld vergleichbar mit der Untersuchung von beschichteten Blasen mit Radien ~3 μm in einem 1,7-MHz-Feld, wie von Dollet et ^al.27 vorgeschlagen. Es werden daher ähnliche Shape-Mode-Nummern und damit Microstreaming-Muster erwartet.

Um nicht-sphärische Schwingungen der Blasengrenzfläche auszulösen, ist es notwendig, eine bestimmte Druckschwelle zu überschreiten, die radiusabhängig ist, wie in Abbildung 1 dargestellt. Bestehende experimentelle Techniken beruhen auf der Erhöhung des Schalldrucks, um Oberflächenmoden auszulösen (dargestellt durch Pfad (1) in 1), entweder durch eine schrittweise Druckerhöhung²⁸ oder durch eine Anregung mit modulierter Amplitude, die für das periodische Einsetzen und Erlöschen von Oberflächenmoden²⁹ verantwortlich ist. Die Hauptnachteile dieser Techniken sind (i) eine zufällige Ausrichtung der Symmetrieachse der Oberflächenschwingungen, die nicht kontrolliert werden kann, um sich in der Abbildungsebene zu befinden, (ii) eine kurze Lebensdauer der blasenförmigen Oszillationen, die die Analyse der induzierten Flüssigkeitsströmungen auf größeren Zeitskalen erschwert, und (iii) das häufige Auslösen instabiler Formmoden. Wir schlagen eine alternative Technik vor, um die Druckschwelle bei konstantem Schalldruck in der Radius-/Druckkarte zu überschreiten, wie durch den Pfad (2) in Abbildung 1 dargestellt. Dazu ist es erforderlich, die Blasengröße so zu erhöhen, dass sie sich in der Instabilitätszone befindet. Eine solche Erhöhung wird durch eine Blasenkoaleszenztechnik durchgeführt. Die Verschmelzung zweier, zunächst kugelförmig oszillierender Mikrobläschen wird ausgenutzt, um eine einzige deformierte Blase zu erzeugen. Wenn der Schalldruck und die Blasengröße der koaleszierten Blase in der Instabilitätszone liegen, werden Oberflächenmoden ausgelöst. Wir konnten auch zeigen, dass die Koaleszenztechnik stabile Formoszillationen in einem stationären Zustand induziert, sowie eine kontrollierte Symmetrieachse, die durch die geradlinige Bewegung der beiden sich nähernden Blasen definiert wird. Da eine stabile Formoszillation über Minuten gewährleistet ist, ist die Analyse der blaseninduzierten Flüssigkeitsströmung möglich, indem das flüssige Medium mit fluoreszierenden Mikropartikeln bestückt wird, die von einer dünnen Laserschicht beleuchtet werden. Die Aufzeichnung der Bewegung der festen Mikropartikel in der Nähe der Blasengrenzfläche ermöglicht die Identifizierung des Musters der induzierten Fluidströmung³⁰. Das Gesamtprinzip der Auslösung blasenförmiger Oszillationen, die zu einer zeitstabilen Fluidströmung führen, ist in Abbildung 2 dargestellt.

Im folgenden Protokoll skizzieren wir die Schritte, die erforderlich sind, um stabile blasenförmige Oszillationen mit der Koaleszenztechnik zu erzeugen, und beschreiben die Messungen des Flüssigkeitsflusses. Dazu gehören das Design des akustischen Levitationssystems, die akustische Kalibrierung, die Blasennukleation und die Koaleszenztechnik, die Messung der Blasengrenzflächendynamik und der umgebenden Flüssigkeitsströmung sowie die Bildverarbeitung.