JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

Published: March 20, 2021
doi:
10.3791/61998
, , , , ,
1Department of Genetics – Sorbonne Université, INSERM, CNRS,Institut de la Vision

Summary

אנו מתארים שיטה להשגת תרבויות ראשוניות של קולטני חרוטים מהרשתית של עוברי עוף והשימוש בה להקרנת תוכן גבוה.

Abstract

ראיית היום האנושית מסתמכת על תפקודם של קולטני חרוטים במרכז הרשתית, הגומה. חולים הסובלים הצורה הנפוצה ביותר של ניוון רשתית בירושה, רטיניטיס פיגמנטוזה, לאבד את ראיית הלילה בגלל מוטציה מונעת אובדן של מוט photoreceptors, תופעה ואחריה אובדן מתמשך של תפקוד ומוות של קונוסים המוביל עיוורון. גנטיקאים זיהו גנים רבים עם מוטציות הגורמות למחלה זו, אך המוטציות הראשונות שזוהו חקרו את המנגנונים של ניוון חרוט משני וכיצד מוטציה דומיננטית בקידוד הגן רודופסין עבור הפיגמנט החזותי המתבטא אך ורק במוטות יכולה לגרום לניוון חרוטים.

תוצאה זו של השתלות במודל גנטי של המחלה הובילה למושג אינטראקציות תאים בין מוטות וקונוסים ושל ניוון אוטונומי שאינו תאים של קונוסים בכל הצורות הגנטיות של רטיניטיס פיגמנטוזה.

קונוסים מהווים 5% מכלל הפוטורצפטורים בבני אדם ורק 3% בעכבר, כך שהמחקר שלהם קשה במינים אלה, אך קונוסים עולים במספרם על מוטות במיני ציפורים. התאמנו צלחות של 96 בארות למבשרי רשתית התרבות מהרשתית של עוברי עוף בשלב 29 להתפתחותם. בתרבויות ראשיות אלה, קונוסים מייצגים 80% מהתאים לאחר בידול במבחנה. התאים מנוונים על פני תקופה של שבוע בהעדר סרום. כאן אנו מתארים את השיטות ואת התקינה שלה.

מערכת תרבות מועשרת חרוט זה שימשה לזיהוי גורם הכדאיות חרוט נגזר אפיתל (EdCVF) על ידי הקרנת תוכן גבוה של אפיתל פיגמנטי חולדה מנורמל ספריית cDNA. EdCVF רקומביננטי מונע התנוונות של הקונוסים.

Introduction

הרשתית של מינים בעלי חוליות היא כפולה, עם פוטורצפטורים מוט לראיית אור עמום קולטני חרוט עבור אור יום, צבע וראיית חדות. חדות ראייה פרימטים מסתמכת על אזור במרכז הרשתית, הנקרא הגומה, המועשר בקונוסים, אך בסך הכל, קונוסים מייצגים רק 5% מכלל הפוטורצפטורים. כתוצאה מכך, הניתוח של הקונוסים ברשתית הפרימטים ובמיוחד תרבות הקונוסים קשה מבחינה טכנית. לכל מיני היונקים האחרים אין גומה ואחוז הקונוסים נמוך עבור מכרסמים הנפוצים ביותר במחקר רשתית. זה לא המקרה של מיני העופות, שעבורם קונוסים שולטים ברשתית של מיני הציפורים הנראים היטב האלה. דינוזאורים, ששלטו במערכת האקולוגית כאשר היונקים הופיעו לראשונה במהלך האבולוציה, נמצאים במקור הפילוגנטי שלציפורים 1. כתוצאה מתחרות כזו בין דינוזאורים ליונקים מוקדמים, היונקים הם בעיקר ליליים עם רשתיות הנשלטות על ידי מוטות. רק מאוחר יותר במהלך האבולוציה הפך החזון היורנלי של מיני יונקים מסוימים, ביניהם שייכים הפרימטים, ליתרון אבולוציוני. עם זאת, תקופת האבות נותרה כאטביזם של צוואר הבקבוק הלילי באבולוציה של חזון היונקים2,3.

בעת לימוד בידול תאי הרשתית, אדלר והאטלי הראו כי פוטורצפטורים מייצגים כ -70% מהתאים המובחנים ברשתית בתרבויות שמקורן בעוף ביום העוברי (אד) 6 או שלב 294. בגלל השכיחות של קונוסים ברשתית העוף, תרבויות של תאים ברשתית מעוברים עוף ED6 פותחו כמו תרבויות מועשרות חרוט5.

החשיבות של חדות ראייה בתיווך חרוט לאדם היא אמת. אנשים מושפעים ממחלות גנטיות או הזדקנות שמשנות את תפקוד הקונוסים מוגבלים מאוד. זה קידם גוף גדול מאוד של מחקרים על ניוון רשתית בירושה (IRD) במטרה למצוא טיפולים למחלות מסנוורות אלה6,7. ההצלחה הראשונה, שהושגה באמצעות וקטור הקשור לאדנו רקומביננטי (AAV) לטיפול בצורה חמורה של IRD Leber אמורוזיס מולד (LCA), היא הוכחת רעיון לריפוי גנטי8. זיהוי הגנים שהמוטציות שלהם מפעילות את IRD פותח את האפשרות לרפא מחלות אלה באמצעות ריפוי גנטי. עם זאת, מחלות אלה נובעות מוטציות יותר מ 200 גנים שונים9. אפילו במקרה של צורות רצסיביות אוטוזומליות של IRD, כאשר הצגתו מחדש של העותק הרגיל של הגן החולני יכולה לשחזר את התפקוד החזותי, העלות הכלכלית של כל התפתחות אינדיבידואלית מעדיפה את הנפוצים ביותר המזיקים לאלה הפחות נפוצים ולאלה שעבורם המקור הגנטי עדיין לא ידוע. עובדה זו הובילה את החוקרים לחשוב על טיפולים כלליים יותר. מוות תאי אפופטי הופיע כמסלול נפוץ, ויעד טיפולי של מחלות אלה המתקדמות על ידי ניוון של פוטורצפטורים, כולל עבור צורות דומיננטיות אוטוזומליות10,11. עם זאת, ההצלחות של גישה כזו חסרות. עבור הצורה הנפוצה ביותר של IRD, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), המסלול המשותף הוא אובדן משני של תפקוד בסופו של דבר ואחריו ניוון של קונוסים12,13. מניעת אובדן תפקוד החרוט תשמר את החזון המרכזי של הגומה ללא תלות במוטציות הסיבתיות14.

בשלב המוקדם של RP, אובדן מוטות מפעילה ירידה בביטוי של גורם הכדאיות חרוט נגזר מוט (RdCVF), מקודד על ידי הגן דמוי גרעין 1 (NXNL1), אשר קוטע את איתות חילוף החומרים ו redox בין מוטות וקונוסים15. הממשל של AAV רקומביננטי קידוד שני המוצרים של הגן NXNL1, הגורם הטרופי RdCVF ואת האנזים תיורדוקסין RdCVFL, יכול תיאורטית למנוע אובדן ראיית חרוט בכל הצורות הגנטיות של RP16. הראינו כי מוצר הגן NXNL1, RdCVFL, בא לידי ביטוי בתרבויות מועשרות חרוט עוף17 ושם הוא ממלא תפקיד מגן18. RdCVF ואת הגן NXNL1 זוהו על ידי הקרנת תוכן גבוה של ספריית cDNA רשתית באמצעות הישרדות של תאים מתרבות מועשרת חרוט כמו קריאה19. הקרנו את המקבילה של 210,000 שיבוטים בודדים של הספרייה באמצעות 8 בדיקות מקבילות לכל שיבוט. זה מייצג מספר גדול מאוד של בדיקות הדורשות גישה קלה לחומר הביולוגי, הרשתית של עוברי עוף. מצאנו כי היה קל יחסית להשיג ביצי עוף עובריות על בסיס שבועי מכיוון שהן מיוצרות באופן נרחב לתעשיית האגרו לתרנגולות מטילות ביצים ותרנגולות המייצרות בשר. לאחר סטנדרטיזציה זהירה של התרבויות המועשרות בקונוסים, המערכת מספקת דרך קלה, איתנה וניתן לשחזור לבדוק אלפי מולקולות על יכולתן לשמר את יכולתן לשמור על יכולת הקיום של הקונוסים. תאים אלה הם גם נוחים מניפולציות גנטיות20 כי תועלת לחקר התמרכות האות וניתוחים ביוכימיים21,22,23.

חוקרי רשתית פיתחו שיטות חלופיות כמו השימוש בקו תא חרוט 661W24,25,26. עם זאת, זהותו של קו תא זה נשארת שנויה במחלוקת27,28. התאים 661W היו משובטים מגידולים ברשתית של קו עכבר מהונדס המבטא את אנטיגן T SV40 גדול תחת שליטה של מקדם חלבון רטינול מחייב האינטרפוטור האנושי. SV40 אנטיגן T גדול מתווך טרנספורמציה סלולרית והנצחה. כתוצאה מכך, יש לדווח על מסלול איתות המזוהה באמצעות תאי 661W בהקשר של קו תאים שעבר המרה ומונצח, הנבדל במובנים רבים מקונוסים באתרו. במובן זה, מערכת התרבות המועשרת בקונוסים מורכבת מתאי עצב ראשוניים, הקונוסים הרלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

אמנם ניתן להשיג תרבות טהורה של פוטורצפטורים באמצעות קטעים vibratome של הרשתית העכבר, אחוז נמוך מאוד של קונוסים ברשתית החיצונית של מכרסמים עושה גישה זו אינה מתאימה לייצור תרבויות מועשר חרוט29. רשתית החזירים אינה מכילה גומה, אך יש בה אזור שנקרא אזור מרכזי המועשר מאוד בקונוסים30. השיעור הגבוה של קונוסים במכרסמים הבסיסיים ברשתית, כמו Arvicanthis ansorgei ו Psammomys אובססיבי31,32, מציע פתרון אפשרי אבל דורש רבייה של מינים אקזוטיים כאלה. עיני חזיר בוגרות, שנאספו מבתי מטבחיים מקומיים, יכולות לשמש לייצור תרבות מעורבת של מוטות וקונוסים ששימשו ללימוד הישרדות פוטורצפטור33. פתרון אלגנטי הוא לטהר מראש קונוסים מרשת החזיר באמצעות גלילה עם אגלוטינין בוטנים (PNA) לקטין, אשר נקשר באופן סלקטיבי לקונוסים34. עם זאת, קשה ליישם שיטה זו בקנה מידה גדול בשל מורכבותה.

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPS) מציעים את הגישה המבטיחה ביותר להשגת אוכלוסיית תאי פוטורצפטור חרוט שניתן להשתמש בהם להשתלת רשתית אך ניתן גם להתאים לתרבות מועשרת חרוט35,36. מאז גורם שעתוק NRL נדרש עבור rod-photoreceptors37, Nrl-/- העכבר יש רשתית הנשלטת על ידי קונוסים גל קצר (S-קונוסים). ניתן להשתמש בהשבתה כדי לייצר הכנה מועשרת S-חרוט על ידי בידול של אדם מ- iPS38,39. גישה אפשרית נוספת היא לקדם בידול חרוט באמצעות הורמון בלוטת התריס איתות40. בעוד שיטות חדשניות לייצור תרבויות מועשרות חרוט מן iPS האנושי מתגלים, עוברי עוף לספק שיטה מוכחת הנוכחי19.

התרבות המועשרת בקונוס סייעה בזיהוי RdCVF על ידי שיבוט ביטוי19. מערכת זו שימשה גם בהצלחה כדי להדגים כי RdCVF מגרה את ספיגת הגלוקוז ואת חילוף החומרים שלה על ידי גליקוליזהאירובית 22. יתר על כן תרבות מועשרת חרוט שימש כדי לאמת את התפקיד המגן של RdCVFL, המוצר השני של הגן NXNL1 23. לאחרונה, מערכת זו שימשה כדי להדגים את קיומו של הגנה על מולקולות המופרשות על ידי תאי אפיתל פיגמנט רשתית transduced עם OTX241.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת פייר ומארי קירי ומשרד המחקר הצרפתי (מספר היתר: APAFIS #1028 2015070211275177). הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת האישור הבא: “אישור d’autorisation d’expérimenter סור les אנימו vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 בנובמבר 2011 – 8 בנובמבר 2016)”. 1. דגירה של ביצים מופרות לאסוף ביצים מופרות שבועיות (זן אני 657, תווית אדומה), המתקבל באופן טבעי, במדגרה תעשייתית. לשמור על הביציות המופריות ב 17 מעלות צלזיוס (האפס הביולוגי שלהם) במעבדה לאחר שהם “מוטלים” על ידי התרנגולת. עבור כל תרבות, דגירה שבע ביצים מופרות במשך 24 שעות ב 20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 136 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם היפוך לסירוגין של הנטייה (תנועה פרוגרסיבית במשך 2 שעות מצד אחד להיפך, מחזור 4 שעות) של הביצים בתא לח. 2. שחזור של עוברי העוף לשטוף את פני השטח של שבע הביצים עם חיטוי (למשל, Pursept A אקספרס). כדי לשבור את קליפת הביצה, לעשות חור בחלק העליון של הקליפה עם צבת ישרה גדולה. ואז לחתוך את הקליפה כדי להסיר את הכובע מן הביצה כמו ביצה רכה. מוציאים בעדינות כל עובר מקליפת הביצה עם מלקחיים מעוגלים, ולאחר מכן מעבירים אותו לצלחת פטרי המכילה מלוח חיץ פוספט סטרילי (PBS) שחומם בעבר ל-37 מעלות צלזיוס. בעדינות, להסיר את המעטפה המקיפה את העוברים (chorion או קרום chorioallantoic). לאמת את שלב ההתפתחות של כל עובר על ידי השוואה חזותית המבורגר המילטון42. בחרו שני עוברים בשלב ה-29 של ההתפתחות (איור 1). הכנפיים מתכופפות במרפקים. הצווארון בולט בעליל. הצעת החוק בולטת יותר מאשר בשלבה-28. האחסנו את עיניהם של עוברים נבחרים אלה והעבירו אותם במדיום בלתי תלוי CO2(טכנולוגיות חיים).התראה: חשוב מאוד שהעובר יהיה בשלב 29, ולא בשלב 28 או 30(איור 1); לכן יש צורך להדגיר לפחות 7 ביצים, גם אם רק שתיים ישמשו סוף סוף. ה chorion הוא דק מאוד, כל כך קשה להבחין, אבל זה קרוב מאוד מן העובר, ולכן יש להסיר אותו מבלי לגעת העובר. 3. ניתוח הרשתית לערוף ולהטמיע את העוברים שנבחרו עם מלקחיים מעוגלים. מעבירים את ארבע העיניים למדיוםדו-חמצני עצמאי. מדיום זה מכיל 0.9 mM CaCl2 ו 0.65 mM MgCl2. מקם את העין עם הקרנית עם הפנים כלפי מטה, עצב הראייה מול הניסוי. לקדוח חור בעצב הראייה באמצעות שתי מלקחיים ישרים. הכנס ענף של כל מלקחיים בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט (איור 2). משוך על כל מלקחיים ולסובב את העין כדי לנתק את האפיתל מן הרשתית. הסר את הקרנית ואחריו את העדשה ואת זגוגית. מעבירים את ארבע הרשתות בצלחת פטרי המכילה את המדיום של רינגר ב-pH 7.2.התראה: ודא כי רק הרשתית נשארת ולהסיר את כל העקבות של אפיתל פיגמנט רשתית שנותרו. 4. הכנת ההשעיה של תאי הרשתית חותכים את ארבע הרשתיות בחתיכות קטנות מאוד באמצעות שני צבת ישר. לשטוף את חתיכות הרשתית פעמיים עם המדיום של רינגר. לאחר הכביסה השנייה עם המדיום של רינגר, תן את חתיכות הרשתית ליפול על החלק התחתון של הצינור ולהסיר את המדיום של צלצול. לטפל חתיכות הרשתית במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם פתרון של טריפסין (0.25% w / v). לפזר את הפתרון לאחר 10 דקות על ידי יניקה רצופה. פריקה באמצעות פיפטה פסטר ולבדוק ניתוק של חתיכות הרשתית. לעצור את התגובה על ידי הוספת מדיה תרבות בתוספת 10% מומת סרום עגל העובר. דגירה את ההשעיה התא עם 0.05 מ ג של DNase I. לנתק את אשכולות התא ואת ה- DNA על ידי יניקה רצופה פריקה באמצעות פיפטה פסטר מיד לאחר הוספת DNase. לשטוף את ההשעיה תא הרשתית פעמיים עם מדיום תרבות מוגדר כימית (CDCM): נפח שווה של מדיום הנשר שונה של Dulbecco ו M199 מדיה בתוספת 100 מיקרוגרם / מ”ל חומצה לינולאית / BSA, 0.86 מיקרומטר אינסולין, 0.07 מיקרומטר טרנספרין, 2.0 מיקרומטר פרוגסטרון, 0.28 מיקרומטר פרוסטגלנדין, 0.29 מיקרומטרנה 2SeO3, 182 μM putrescine, 3 mM טאורין, 4.7 מיקרומטר ציטידין 5′-דיפוספוגולין, 2.7 מיקרומטר ציטידין 5′-דיפוספוטנולאמין, 0.55 מיקרומטר הידרוקורטיזון, 0.03 מיקרומטר טריודוטירונין, 1 מ”מ נתרן פירובט ו 20 מיקרומטר גנטימיצין. 5. זריעת תאי רשתית פנקו שתי צלחות תרבות שחורות של 96 בארות עם תחתית שקופה למשך שעתיים ב-37°C עם פולי-ל-ליצין ב-32.25 מיקרוגרם/ס”מ2. יש לשטוף את הצלחות פעמיים במדיום התרבות M199. Resuspend גלולת התא ב 1 מ”ל של CDCM. הוסף aliquot של 10 μL של התא השעיה trypan כחול כדי להכתים את התאים החיים. מוסיפים את דגימת ההשעיה של התאים לתוך המוציתומטר (תא ספירת תאים של Malassez). תחת מיקרוסקופ, לספור את התאים המוכתמים עבור ארבע שורות של המוציתומטר (כלומר, 40 ריבועים), ולאחר מכן לחשב את מספר התא הממוצע עבור שורה אחת. לחשב את ריכוז התאים של המתלה על ידי החלת השיטה הבאה: מספר תאים / מ”ל של השעיה = מספר ממוצע של תאים בשורה (10 ריבועים) x 10 המספר הכולל של ריבועים של המוציטופומטר x דילול עם כחול trypan x 1,000 (כדי לבטא את התוצאה כתאים / מ”ל). להביא את התא השעיה לשני ריכוזים (5.6 x 104 תאים / מ”ל ו 1.12 x 105 תאים / מ”ל) המתאים שתי צפיפות ציפוי (1 x 105 תאים / ס”מ2 ו 2 x 105 תאים / ס”מ2) באמצעות CDCM. זרע 50 μL של שני התא השעיות לתוך שתי צלחות תרבות שחורות 96-באר מטופלות מראש. פזר את התאים בלוחות עם פיפטה רב-ערוצית מימין ללוח שמאלה, הומוגניזציה בין כל עמודה, כך שהתפלגות התאים היא הומוגנית. הוסף 50 μL של ספריית המולקולות (למשל, המדיה המותנית מספריית cDNA, ראה להלן) להקרנה באמצעות תבנית מוגדרת מראש (טבלה 1). דגירה הצלחות במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 ללא שינוי של מדיה. 6. ספירת תאים בני קיימא לכל באר של הצלחת, להוסיף 2.7 מיקרומטר של calcein AM ו 0.3 מ”מ של הומודימר אתידיום.הערה: Calcein חודר את התאים אטומים מולקולות גדולות כמו הומודימר אתידיום. בציטופלסמה של תאים חיים, calcein הוא הידרוליזה על ידי אסטרות אנדוגני, הופך פלואורסצנטי על ידי פולט ב 520 ננומטר כאשר נרגש ב 485 ננומטר. אתידיום הומודימר נקשר לדנ”א על תאים מתים. כריכת DNA-homodimer אתידיום גורמת פלואורסצנטיות אדומה להיפלט ב 635 ננומטר לאחר עירור ב 520 ננומטר. הדגירה את הצלחות במשך שעה בטמפרטורת החדר בהיעדר אור. קרא את הפלואורסצנטיות על קורא לוחות אוטומטי המורכב ממיקרוסקופ הפוך המצויד במנורת כספית עם שני מסנני עירור ב- 485 ו- 520 ננומטר, שני מסנני פליטה ב- 520 ו- 635 ננומטר, מטרה (x10), שלב ממונע הנשלט על ידי מעבד ומצלמת מכשיר משולבת טעינה (CCD). פלטפורמת ספירה זו נשלטת על ידי תוכנת מטמורף19. זה מאפשר לרכוש תמונות פלואורסצנטיות של תאים חיים ותאים מתים בו זמנית בכל באר של צלחת 96-באר, החל בארות A1 לכיוון גם A12, אז B12 לכיוון B1, C1 לכיוון C12 וכןהלאה( טבלה I ). חישוב האזור הממוצע A של תא בודד באמצעות 18 הבארות של הפקדים השליליים (טבלה I). לספור את התאים בכל באר של הצלחת ולהחיל את הנוסחה האמפירית הבאה A x 29 / 20.7 כדי למנוע כי תא מכפיל (קיבוץ של שני תאים) נספרים. ניקוד ההשפעה המגנה של הקונוסים על ידי מולקולות כיחס בין מספר התא הממוצע ב 4 בארות שבו בדקנו את המולקולה לעומת מספר התא הממוצע ב 18 בארות של הפקד השלילי (ראה טבלה 1 ואיור משלים 1). שלב את התוצאות של הלוח זרעים ב 1 x 105 תאים / ס”מ2 עם אחד זרע ב 2 x 105 תאים / ס”מ2 כדי להעריך את ההגנה הפוטנציאלית (יחס הכדאיות) על ידי כל מולקולה מוקרן.

Representative Results

אנו מתארים כאן כיצד ניתן להשתמש במערכת התרבות המועשרת בקונוסים כדי לזהות חרוט חדשני המגן על חלבונים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להקרין ספריית cDNA מנורמלת עשויה אפיתל פיגמנטי choroid ו הרשתית מ 400 עיניים של 8 שבועות חולדות לונג אוונס43. ספריה זו מכילה 6.0 x 106 יחידות עצמאיות היוצרות יחידות (CFUs) וגודל הכנסה משוכפל ממוצע של 2.1 קילו-בייס (kb), עם יותר מ- 99% מהשיבוטים הרקומביננטיים. בריכות של 100 שיבוטים מאותה ספרייה היו מוחצבים באופן ארעי (0.1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד) לתאי COS-1 והבינוני המותנה (CM) של COS-1 נקצר לאחר הדגירה במשך 48 שעות ב- DMEM ללא סרום. ממברנות או אקסוזומים לא הוסרו על ידי ultracentrifugation. חמישים מיקרוליטרים של כל CM נוספו 4 בארות של שני לוחות 96-באר: אחד זרע ב 2 x 105 תאים / ס”מ2, השני ב 4 x 105 תאים / ס”מ2. CM מתאי COS-1 שהודבקו עם pcDNA3.1 הווקטור הריק ששימש לבניית הספריה שימש כפקד שלילי (טבלה 1). בסך הכל הוערכו 2,112 סטים של 100 שיבוטים המתאימים ל-211,200 שיבוטים בודדים בארבע בארות תרבות ובשני תנאי זריעה של תרבויות מועשרות חרוטים. שני התנאים תואמים לשתי צפיפויות חיסון שונות במקצת המאפשרות להעריך את פעילות המגן בצורה מדויקת יותר, בסך הכל 1,689,600 בארות תרבות. בין 42 בריכות של שיבוטים עם יחס גדול מ 2, בריכות 0080 ו 0073 יש יחס הכדאיות 16 ו 14 פעמים גבוה יותר לאחר 7 ימים של תרבות מאשר שליטה שלילית, pcDNA3.1(איור משלים 1). ניתוח זה חיוני כדי לזהות את מאגרי העניין. כל בריכה נבחרת של 100 שיבוטים חולקה ל-16 סטים של 10 שיבוטים ממלאי הגליצרול שלהם. בריכות משנה אלה הוכנו ונבדקו על פי אותה שיטה בסבב הקרנה שני (כלומר, בסך הכל 3,200 בארות תרבות). תת-הבריכה 0073-09 העניקה את יחס הכדאיות החזק ביותר (איור 2A משלים) וחולקה כדי לייצר 16 שיבוטים בודדים שנבדקו בסיבוב שלישי של הקרנה על תרבויות מועשרות בקונוסים. השיבוט 0073-09-37 בולט בבירור מהאחרים עם יחס כדאיות השווה ל-2.5 (איור משלים 2B). ציר y יש קנה מידה שונה גם אם צפיפות הזריעה היה זהה באיור משלים 2A. ראינו את זה בדרך כלל כאשר מבחנים חוזרים על עצמם מדי שבוע במשך חודשים. לאחר הניתוח, תוצאות אלה מאשרות כי שיבוט 0073-09-37 יש השפעה חזקה לשחזור על הישרדות חרוט. הבדיקה חזרה על עצמה באופן עצמאי (איור 3A),וההוספה של 1.8 קילו-ב’ הייתה ברצף (איור 3B). ניתוח ביואינפורמטי גילה שהשיבוט 0073-09-37, כי קראנו אפיתל נגזר גורם הכדאיות חרוט (EdCVF), מכיל שלוש מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), אחד ביותר במעלה הזרם (ORF1) מקודד עבור 84 שאריות של חלק C-מסוף של חלבון החולדה חלבון אבץ אצבע חלבון-180 (ZFP180, NP_653358) של 727 חומצות אמינו44. שני ORFs האחרים (ORF2 ו ORF3) הם הרבה פחות שמורים היטב בעכברים ונעדרים יונקים אחרים. כאשר נבדק באופן עצמאי, רק ORF1 מפעיל אפקט מגן על הקונוסים (איור משלים 3). ORF1 יוצר כחלבון היתוך גלוטתיון S-transferase (GST)(איור 4A). חלבון EdCVF טוהר ותג GST הוסר (איור 4B). EdCVF מסוגל למנוע ניוון חרוטים במערכת התרבות המועשרת בקונוסים (איור 4C). איור 1: עוברי עוף בשלבים28,29 ו-30th של התפתחות. חצים W: כנף, ג: צווארון ו- B: הצעת חוק. סרגל קנה מידה 1 ס”מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: ניתוח הרשתית של עובר העוף אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: גורם הכדאיות של חרוט (EdCVF), שיבוט 0073-09-37. א. כדאיות מוגברת בתרבות מועשרת בקונוסים. ב. ב. הרצף של שיבוט cDNA 0073-09-37. הרצף עם קו תחתון GAATTC הוא אתר ההגבלה של EcoRI המשמש לבניית הספריה. שני קודונים GTG מודגש הם אתרי ייזום תרגום נדירים עבור EdCVF שמקורם וקטור. ניתוח סטטיסטי לפי מבחן סטודנט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: פעילות EdCVF רקומביננטית. ב. ב. חלבון EdCVF רקומביננטי מטוהר. ג. ג. פעילות טרופית של GST-EdCVF על חרוט בתרבות. ניתוח סטטיסטי באמצעות המבחן של טוקי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור משלים 1: היחס בין מספר התא הממוצע עבור מאגר cDNA לבין הפקד השלילי, המדיום המותנה של תאי COS-1 שהודבקו בווקטור הריק pcDNA3.1 במהלך סבב ההקרנה הראשון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.  משלים איור 2: מספר התאים החיים. א. סבב ההקרנה השני עם בריכות משנה של בריכת 0073. ב. ב. הסיבוב השלישי של ההקרנה עם שיבוטים מבודדים. CN: המדיום המותנה של תאי COS-1 מודבק עם הווקטור הריק, pcDNA3.1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור משלים 3: פעילות טרופית של שלוש מסגרות הקריאה הפתוחות של השיבוט המבודד 0073-09-37. ניתוח סטטיסטי באמצעות המבחן של דאנט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1 1 1 1 2 מספר NC 2 2 2 3 3 מספר NC B מספר NC 3 3 4 4 4 מספר NC 4 5 5 5 5 C 6 מספר NC 6 6 6 7 7 מספר NC 7 7 8 8 D 8 8 מספר NC 9 9 9 9 10 מספר NC 10 10 10 E 11 11 11 מספר NC 11 12 12 12 12 מספר NC 13 13 נ 13 13 14 14 מספר NC 14 14 15 15 15 מספר NC 15 G 16 16 16 16 17 מספר NC 17 17 17 18 18 מספר NC H 18 18 19 19 19 19 מספר NC 20 20 20 מספר NC 20 פקדים שליליים של NC 1-20 מיקומים של הבריכות שנבדקו ב-quadruplicate טבלה 1: תוכנית צלחת 96 באר להקרנת תוכן גבוה

Discussion

בין הפרמטרים הרבים שעשויים להגביל את הייצור של תרבות מועשרת חרוט מעוברים עוף, הצעד הקריטי הראשון הוא לזהות במדויק את שלב ההתפתחות של העוברים בביצים שבקעו. זה נצפתה כי תרבות של תאים מן הרשתית של עוברים ב ED8 (השלבה -34) מייצרת רק 35% פוטורצפטורים, עם 65% הנותרים עשויים נוירונים אחרים4. לא משנה מה הלוגיסטיקה להחיל כדי לקבל את הביצים שבקעו, יש צורך לכוונן את הטמפרטורה ואת זמן הדגירה, ולבחון בזהירות את העוברים לעומת תמונות התייחסות של כל שלבי ההתפתחות42,45.

במקור, מערכת התרבות מועשרת חרוט פותחה באמצעות זן לגהורןלבן 4. הצבע הלבן של הביצים של זן זה אינו מוערך במיוחד בצרפת, ולכן השתמשנו בזן של עוף המייצר ביצים חומות. ניצלנו את זן I 657, אשר נעשה על ידי חציית I 66 תרנגולים עםJA57 תרנגולות 5. הצלחנו לשחזר את המאפיינים של התרבויות המקוריות. זה מראה כי הרקע הגנטי של העוף אינו קריטי כדי להשיג תרבויות מועשרות חרוט.

לא בדקנו את ההשפעה של הסרה אישית של תוספי מזון במדיום התרבות, אבל ראינו כי אינסולין ממלא תפקיד קריטי בהתאם להשפעת האינסולין על הישרדותם של קונוסים בעכבר rd1, מודל של RP רצסיבי אוטוזומלי46. Triiodothyronine (T3) עשוי גם להשתתף בהבחנה של תאים מבשר רשתית של עובר העוף לתוך קונוסים על פי התפקיד של קולטן הורמון בלוטת התריס בגורל התא ברשתית במהלך הפיתוח40. כתוצאה מכך, לא ניתן להשתמש במערכת התרבות המועשרת בקונוס כדי לזהות אינסולין על ידי שיבוט ביטוי46.

מערכת התרבות מועשרת חרוט מסתמך על התרבות של נוירונים ראשוניים והוא הרבה יותר מתאים שיטות tha להסתמך על השימוש בתאים מונצחים כמו קו התא 661W24,25,26.

השיטה המתוארת כאן ניתן לשנות על ידי ביצוע electroporation הקודם עם DNAפלסמיד 20. לפני הכנת ההשעיה של התא ברשתית, הרשתית כולה ממוקמת בתא של electroporator בהתאמה אישית עם 120 μL של 0.5 מיקרוגרם / μL של DNA פלסמיד ב 10 מ”מ Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. חמישה פולסים של 15 V עבור 50 ms כל אחד מוחלים מופרדים על ידי מרווח 950 ms22. ניסיונות לספק RNA מפריע (RNAi) באמצעות שכפול splice העופות המוסמכים (RCAS) retroviruses לתוך תרבויות מועשר חרוט לא הצליחו47. זה בהחלט בשל העובדה כי בהיעדר סרום ובתרבויות של צפיפות נמוכה, תאים מבשר רשתית אינם משכפלים, דרישה להפצת retroviruses.

פיתחנו את מערכת התרבות מועשרת חרוט לזהות גורמים טרופיים המקדמים הישרדות חרוט באמצעות שיבוט ביטוי19. על מנת להפוך אותו ריאלי, ביצענו צעד ראשון של הקרנת תוכן גבוה באמצעות מדיום מותנה מבריכות של 100 שיבוטים. גם אם cDNAs מהספרייה באים לידי ביטוי תחת שליטה של מקדם CMV חזק לאחר transfection של תאי COS-1, זה לא מציע ערבות כי כל החלבונים המקודדים על ידי cDNAs בודדים להגיע לריכוז מספיק כדי לקבל ציון חיובי על ידי מבחני הכדאיות. זוהי מגבלה עיקרית. במובן זה, כל הקרנה היא לא ממש ממצה. בנוסף, גם אם חלבונים membranous לא הוסרו מן המדיום המותנה, התצורה של ההסתעפות היא שלילית לזיהוי של גורמים שאינם מפוזרים. חלופה אחרת תהיה לסנן שיבוטים בודדים לאחר שהשיגו את הרצף של cDNAs על מנת למנוע כפילויות בבדיקת פעמים רבות את אותו חלבון מועמד. זה היה ביוזמת רצף ספריות cDNA הרשתית השתמשנו43. אמנם רציונלי, גישה זו יש גם את המגבלות שלה. הניתוח הביואינפורמטי של רצפי cDNA יטיל, ללא עוררין, לצד הפחתת היתירות, את סדר העדיפויות של סינון שיבוטים מסוימים המבוססים על ידע. זה לא יהיה מזיק אם סוף סוף, הספרייה כולה תוקרן גם אם הזמן הנדרש לעשות את זה יוארך באופן משמעותי. אבל תמיד, זהות הרצף תשפיע על הדרך שלנו להסתכל על התוצאות. זה לא יהיה ניטרלי שכן הפרשנות של הרצף תהיה באופן טבעי בתחרות עם הנתונים הניסיוניים.

הזיהוי של EdCVF גם מראה כי סינון תוכן גבוה כרוך במגבלות טכניות. מהסיבוב הראשון של ההקרנה זיהינו שתי בריכות עם פעילות גבוהה (איור משלים 1). הבריכה 0073 הובילה לזיהוי מוצלח של EdCVF, בעוד בריכה 0080 לא גרמה לממצא כזה. לא פתרנו את הבעיה שעלולה לנבוע מאובדן השיבוט הפעיל במהלך הכנת מאגרי משנה. לחלופין, זה לא נשלל, גם אם לא חיובי מבחינה סטטיסטית, כי בין cDNAs של הבריכה 0080, שני חלבונים פעלו בסינרגיה ופעילותם לא ניתן היה לראות שיבוטים בודדים.

זיהוי מולקולות המגנות על קונוסים על ידי סינון מולקולות קטנות הוא יישום עתידי של מערכת התרבות המועשרת בקונוסים. מולקולות כאלה יהיו יקרות ערך לטיפול בפתולוגיות רשתית שעבורן ריפוי גנטי אינו הגישה המתאימה ביותר כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לז’אק בללו, לורלי פורנייה, עמנואל קלרין, פרדריק בלונד והאגריקולה המנוקדת (EARL Morizeau Dangers, צרפת) על עזרתם רבת הערך. עבודה זו נתמכה על ידי Inserm, אוניברסיטת סורבון, סוכנות לאומית לשפוך לה Recherche (ANR, Labex Lifesenses), קרן הלחימה עיוורון (ארה”ב) ו IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] נתמך על ידי קרנות מדינה צרפתיות המנוהלות על ידי ANR בתוך תוכנית Investissements d’Avenir.

Materials

96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) Corning 3603
Calcein AM Thermo-Fisher scientific C1430
CCD Camera Photometrics CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich C0256
CO2 Independant Thermo-Fisher scientific 18045-054
Curved forceps Dutscher 005093
DMEM Media Thermo-Fisher scientific 41966-029
DNAse Sigma-Aldrich D4263
Eggs incubator FarmLine M08 01 3100
Ethidium Homodimer Thermo-Fisher scientific E1169
Fœtal bovine serum Thermo-Fisher scientific 10270-098
Gentamycin Thermo-Fisher scientific 15710-049
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0880
ITS (insulin Transferine selenium) Sigma-Aldrich I1884
large straight pliers Dutscher 005074
Linoleic acid Sigma-Aldrich L8384
M199 medium Thermo-Fisher scientific 31150-022
Metamorph software Metamorph
Microscope NIKON Eclipse TE2000
Motorized stage Martzauzer Mutlicontrol 2000
Optical filter switch Shutter Instrument company Lambda 10-2
PBS 1X Thermo-Fisher scientific 14190-086
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Progesterone Sigma-Aldrich P7556
Pursept A express Fisher scientific 11814110
Putriscine Sigma-Aldrich P5780
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
straight forceps Dutscher 005092
Taurine Sigma-Aldrich T8691
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T6397
Trypan blue Thermo-Fisher scientific 15250-061
Trypsine 0.25 % Thermo-Fisher scientific 25200-056
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Brownstein, C. D. . The Implicit Mind. , (2019).
  2. Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
  3. Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
  4. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  5. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
  6. Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
  7. Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. RetNet. . Retinal Information Network. , (2020).
  10. Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
  11. Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
  12. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
  13. Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
  14. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
  15. Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
  16. Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
  17. Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  18. Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
  19. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
  20. Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
  21. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  22. Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
  23. Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
  24. Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
  25. Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
  26. Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
  27. Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
  28. Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
  29. Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
  31. Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
  32. Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
  33. Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
  34. Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
  35. Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
  36. Gagliardi, G., Ben M’Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
  37. Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
  38. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  39. Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
  40. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  41. Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
  42. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  43. Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
  44. Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
  45. Stern, C. D., Holland, P. W. . Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
  46. Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
  47. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).

Tags

Cone ReceptorsChicken EmbryoRod-cone InteractionsRetinal DegenerationCone-enriched CulturePrimary Cell CultureHamburger And Hamilton StagesCarbon Dioxide-independent MediumRinger’s MediumTrypsin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Millet-Puel, G., Pinault, M., Cordonnier, M., Fontaine, V., Sahel, J., Léveillard, T. Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (169), e61998, doi:10.3791/61998 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image