JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Обогащенные конусом культуры из сетчатки куриных эмбрионов для изучения клеточных взаимодействий между палочками и конусами

Published: March 20, 2021
doi:
10.3791/61998
, , , , ,
1Department of Genetics – Sorbonne Université, INSERM, CNRS,Institut de la Vision

Summary

Описан способ получения первичных культур колбочка фоторецепторов из сетчатки куриных эмбрионов и его использование для скрининга высокого содержания.

Abstract

Дневное зрение человека опирается на функцию колбочных фоторецепторов в центре сетчатки, ямки. Пациенты, страдающие наиболее распространенной формой наследственной дегенерации сетчатки, пигментным ретинитом, теряют ночное зрение из-за мутационной потери палочковых фоторецепторов, явления, за которым следует прогрессирующая потеря функции и смерть колбочка, приводящая к слепоте. Генетики идентифицировали много генов с мутациями, вызывающими это заболевание, но первые выявленные мутации поставили под сомнение механизмы вторичной конусной дегенерации и то, как доминантная мутация в гене родопсина, кодирующая визуальный пигмент, экспрессируемый исключительно в палочках, может вызвать дегенерацию конуса.

Этот результат трансплантации в генетической модели заболевания привел к концепции клеточных взаимодействий между палочками и колбочками и неклеточной автономной дегенерации колбок во всех генетических формах пигментного ретинита.

Колбочки составляют 5% всех фоторецепторов у человека и только 3% у мышей, поэтому их изучение затруднено у этих видов, но колбочка превосходит по численности стержни у видов птиц. Мы адаптировали 96-колодезные пластины для культивирование предшественников сетчатки куриных эмбрионов на 29 стадии их развития. В этих первичных культурах колбчики составляют 80% клеток после дифференцировки in vitro. Клетки дегенерируют в течение одной недели при отсутствии сыворотки. Здесь мы опишем методы и их стандартизацию.

Эта обогащенная конусом система культивирования использовалась для идентификации фактора жизнеспособности конуса эпителия (EdCVF) путем скрининга высокого содержания пигментированной библиотеки кДНК пигментированного эпителия крыс. Рекомбинантный EdCVF предотвращает дегенерацию колбочих.

Introduction

Сетчатка видов позвоночных двойственная, с палочковыми фоторецепторами для зрения тусклого света и колбочными фоторецепторами для дневного света, цвета и остроты зрения. Острота зрения приматов зависит от области в центре сетчатки, называемой ямкой, которая обогащена колбойками, но в целом колбки составляют только 5% всех фоторецепторов. Следовательно, анализ колбок у приматов сетчатки и особенно культуры колбок технически сложен. Все другие виды млекопитающих не имеют ямки, и процент колбочка низок для грызунов, которые чаще всего используются в исследованиях сетчатки. Это не относится к видам птиц, для которых колбки доминируют в сетчатке этих хорошо видящих видов птиц. Динозавры, которые доминировали в экосистеме, когда млекопитающие впервые появились во время эволюции, находятся у филогенетического происхождения птиц1. Как следствие такой конкуренции между динозаврами и ранними млекопитающими, млекопитающие в основном ведут ночной образ жизни со сетчаткой, в которой доминируют стержни. Лишь позже в ходе эволюции суточное зрение некоторых видов млекопитающих, к числу которых принадлежат приматы, стало эволюционным преимуществом. Тем не менее, предкам период остается атавизмом ночного узкого места в эволюции зрения млекопитающих2,3.

Изучая дифференцировку клеток сетчатки, Адлер и Хэтли показали, что фоторецепторы составляют примерно 70% дифференцированных клеток сетчатки в культурах, полученных из курицы на эмбриональном дне (ЭД) 6 или стадии 294. Из-за распространенности колбок в куриной сетчатке культуры клеток сетчатки из куриных эмбрионов ED6 были разработаны как обогащенные шишкамикультуры 5.

Важность конусно-опосредопосредооченной остроты зрения для человека является трюизмом. Люди, страдающие генетическими или стареющими заболеваниями, которые изменяют функцию конуса, сильно ограничены. Это способствовало очень большому объему исследований наследственных дегенераций сетчатки (IRD) с целью поиска методов лечения этих ослепляющих заболеваний6,7. Первый успех, полученный с использованием рекомбинантного аденоацепциированного вектора (AAV) для терапии тяжелой формы ВРОЖДЕННОГО АМАВРОЗА ЛЕБЕРА (LCA), является доказательством концепции генной терапии8. Идентификация генов, мутации которых запускают IRD, открывает возможность излечения этих заболеваний с помощью генной терапии. Тем не менее, эти заболевания являются результатом мутаций в более чем 200 различных генах9. Даже в случае аутосомно-рецессивных форм IRD, когда реинтродукция нормальной копии болезненного гена может восстановить зрительную функцию, экономические издержки каждого отдельного развития благоприятствуют наиболее распространенным в ущерб менее распространенным и тем, для которых генетическое происхождение остается неизвестным. Этот факт заставил исследователей задуматься о более общих методах лечения. Апоптотическая гибель клеток появилась как общий путь и терапевтическая мишень этих заболеваний, прогрессирующей за счет дегенерации фоторецепторов, в том числе для аутосомно-доминантных форм10,11. Однако успехи такого подхода отсутствуют. Для наиболее распространенной формы IRD, пигментного ретинита (RP), общим путем является вторичная потеря функции, в конечном итоге сопровождаемая дегенерацией колбок12,13. Предотвращение потери конусной функции позволит сохранить центральное зрение ямки независимо от причинных мутаций14.

На ранней стадии RP потеря стержней вызывает снижение экспрессии фактора жизнеспособности конуса, полученного из стержня (RdCVF), кодируемого геном нуклеоредоксин-подобного 1(NXNL1),который прерывает метаболическую и окислительно-восстановительную передачу сигналов между палочками и колбочками15. Введение рекомбинантного AAV, кодируя два продукта гена NXNL1, трофический фактор RdCVF и фермент тиоредоксин RdCVFL, теоретически может предотвратить потерю зрения конуса во всех генетических формах RP16. Мы показали, что генный продукт NXNL1, RdCVFL, экспрессируется вкультурах, обогащенных куриными шишки 17 и где он играет защитную роль18. RdCVF и ген NXNL1 были идентифицированы путем скрининга с высоким содержанием библиотеки кДНК сетчатки с использованием выживания клеток из культуры, обогащенной конусом, как показания19. Мы проверили эквивалент 210 000 отдельных клонов библиотеки, используя 8 параллельных тестов для каждого клона. Это представляет собой очень большое количество тестов, требующих легкого доступа к биологическому материалу, сетчатке куриных эмбрионов. Мы обнаружили, что относительно легко получить эмбриональные куриные яйца на еженедельной основе, потому что они широко производятся для агропромышленности для кур-несушек и кур, производящих мясо. После тщательной стандартизации культур, обогащенных конусами, система обеспечивает простой, надежный и воспроизводимый способ тестирования тысяч молекул на их способность сохранять жизнеспособность конуса. Эти клетки также поддаются генетическим манипуляциям20, которые приносят пользу изучению сигнальной трансдукции и биохимическим анализам21,22,23.

Исследователи сетчатки разработали альтернативные методы, как использование колбочка клеточной линии 661W24,25,26. Тем не менее, идентичность этой клеточной линии остается спорной27,28. Клетки 661W были клонированы из опухолей сетчатки трансгенной линии мыши, которая экспрессирует большой Т-антиген SV40 под контролем человеческого интерфоторецепторного ретинол-связывающего промотора белка. Большой Т-антиген SV40 опосредует клеточную трансформацию и увековечивание. Как следствие, сигнальный путь, идентифицированный с использованием клеток 661W, должен быть представлен в контексте преобразованной и увековеченной клеточной линии, которая во многом отличается от колбочка in situ. В этом отношении система культуры, обогащенная конусами, состоит из первичных нейронов, колбок, которые более физиологически значимы.

Хотя можно получить чистую культуру фоторецепторов с помощью вибратомного сечения сетчатки мыши, очень низкий процент колбочка во внешней сетчатке грызунов делает этот подход непригодным для получения обогащенных конусами культур29. Сетчатка свиньи не содержит ямки, но имеет область, называемую областью centralis, которая очень обогащена шишами30. Высокая доля колбочек в суточных грызунах сетчатки, таких как Arvicanthis ansorgei и Psammomys obsesus31,32,предлагает возможное решение, но требует разведения таких экзотических видов. Взрослые глаза свиней, собранные с местных скотобоен, могут быть использованы для получения смешанной культуры стержней и колбочка, которые были использованы для изучения выживания фоторецепторов33. Элегантным решением является предварительная очистка колбочки от сетчатки свиньи с использованием паннинга с лектином арахисового агглютинина (PNA), который избирательно связывается с колбочками34. Тем не менее, этот метод трудно реализовать в больших масштабах из-за его сложности.

Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPS) предлагают наиболее перспективный подход к получению популяции колбочных фоторецепторных клеток, которые могут быть использованы для трансплантации сетчатки, но которые также могут быть адаптированы к обогащенной конусом культуре35,36. Поскольку транскрипционный фактор NRL необходим для палочко-фоторецепторов37,у Nrl-/- мыши сетчатка, в которой преобладают коротковолновые колбочки (S-колбочки). Инактивация может быть использована для получения S-конусного обогащенного препарата путем дифференциации человека от iPS38,39. Другим возможным подходом является содействие дифференциации конуса с использованием сигналов гормонов щитовидной железы40. В то время как появляются новые методы получения обогащенных конусами культур из человеческих iPS, куриные эмбрионы обеспечивают современный проверенный метод19.

Культура, обогащенная конусом, сыграла важную роль в идентификации RdCVF путем выраженияклонирования 19. Эта система также была успешно использована для демонстрации того, что RdCVF стимулирует поглощение глюкозы и ее метаболизм аэробным гликолизом22. Кроме того, обогащенная конусами культура использовалась для подтверждения защитной роли RdCVFL, второго продукта гена NXNL1 23. Совсем недавно эта система использовалась для демонстрации существования защитных молекул, секретируемых пигментированными эпителиальными клетками сетчатки, трансдуцированными OTX241.

Protocol

Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Пьера и Марии Кюри и министерством исследований Франции (номер разрешения: APAFIS#1028 2015070211275177). Эксперименты на животных проводились под следующим разрешением: «Certificat d’autorisation d’expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Префектура полиции Парижа (9 ноября 2011 года — 8 ноября 2016 года)». 1. Инкубация оплодотворенных яйцеклеток Собирают еженедельно оплодотворенные яйца (штамм I 657, красная этикетка), полученные естественным путем, в промышленном инкубатории. Поддерживайте оплодотворенные яйцеклетки при 17°C (их биологический ноль) в лаборатории после того, как они будут «отложены» курицей. Для каждой культуры инкубируют семь оплодотворенных яиц в течение 24 часов при 20 °C, а затем 136 часов при 37 °C с прерывистым возвратом склона (прогрессирующее движение в течение 2 часов из одной стороны в противоположную, 4-часовой цикл) яиц в увлажненной камере. 2. Восстановление куриных эмбрионов Вымойте поверхность семи яиц дезинфицирующим средством (например, экспрессом Pursept A). Чтобы разбить яичную скорлупу, сделайте отверстие в верхней части скорлупы крупными прямыми плоскогубцами. Затем нарежьте скорлупу, чтобы снять шляпку с яйца в виде яйца всмятку. Осторожно извлеките каждый эмбрион из яичной скорлупы изогнутыми щипцами, а затем перенесите его в чашку Петри, содержащую стерильный фосфатный буферный физиологический раствор (PBS), предварительно нагретый до 37 °C. Аккуратно удалите оболочку, которая окружает эмбрионы (хорион или хориоаллантоическую мембрану). Проверьте стадию развития каждого эмбриона путем визуального сравнения с Гамбургером и Гамильтоном42. Отобрать два эмбриона на29-й стадии развития(рисунок 1). Крылья сгибаются в локтях. Воротник заметно выделяется. Законопроект более заметен, чем на28-м этапе. Энуклеат глаз этих отобранных эмбрионов и перенос их вСО2-независимую среду(life technologies).ВНИМАНИЕ: Очень важно, чтобы эмбрион находился на стадии 29, а не на стадии 28 или 30(рисунок 1); именно поэтому необходимо высиживать не менее 7 яиц, даже если окончательно будут использованы только два. Хорион очень тонкий, поэтому его трудно отличить, но он очень близок от эмбриона, поэтому его приходится удалять, не касаясь эмбриона. 3. Рассечение сетчатки Обезглавливают и энуклеируют отобранные эмбрионы изогнутыми щипцами. Перенесите четыре глаза вCO2-независимую среду. Эта среда содержит 0,9 мМ CaCl2 и 0,65 мМ MgCl2. Расположите глаз роговицей лицом вниз, зрительный нерв лицом к экспериментатору. Просверлите отверстие в зрительном нерве с помощью двух прямых щипцов. Вставьте ветвь каждого щипца между сетчаткой и пигментным эпителием(рисунок 2). Потяните за каждый щипц и поверните глаз, чтобы отсоедить эпителий от сетчатки. Удалите роговицу, затем хрусталик и стекловидное стекло. Перенесите четыре сетчатки в чашку Петри, содержащую среду Рингера при рН 7,2.ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что осталась только сетчатка, и удалите любые следы стекловидного и оставшегося пигментированного эпителия сетчатки. 4. Приготовление суспензии клеток сетчатки Разрежьте четыре сетчатки на очень маленькие кусочки, используя два прямых плоскогубцев. Дважды вымойте кусочки сетчатки средой Рингера. После второго промывания средой Рингера дайте кусочкам сетчатки упасть на дно трубки и удалите среду Рингера. Обработать кусочки сетчатки в течение 20 минут при 37 °C раствором трипсина (0,25% мас./об.). Диспергировать раствор через 10 мин путем последовательного всасывания. Разгрузка с помощью пипетки Пастера и проверка на диссоциацию кусочков сетчатки. Остановите реакцию, добавив культуральную жиму, дополненную 10% инактивированной сывороткой для телят плода. Инкубируют клеточную суспензию с 0,05 мг ДНКазы I. Диссоциируют клеточные кластеры и ДНК путем последовательного всасывания и разрядки с помощью пипетки Пастера сразу после добавления ДНКазы. Промыть суспензию клеток сетчатки дважды химически определенной культуральной средой (CDCM): равный объем модифицированной среды Eagle Medium от Dulbecco и среды M199, дополненной 100 мкг/мл линолевой кислоты/BSA, 0,86 мкМ инсулина, 0,07 мкМ трансферрина, 2,0 мкМ прогестерона, 0,28 мкМ простагландина, 0,29 мкМ Na2SeO3,182 мкМ путресцина, 3 мМ таурина, 4,7 мкМ цитидина 5′-дифосфохолина, 2,7 мкМ цитидина 5′-дифосфоэтаноламина, 0,55 мкМ гидрокортизона, 0,03 мкМ трийодтиронина, 1 мМ пирувата натрия и 20 мкМ гентамалин. 5. Посев клеток сетчатки Обработать две черные 96-луночные культуральные пластины с прозрачным дном в течение 2 часов при 37 °C поли-L-лизином при 32,25мкг/см2. Промыть эти пластины дважды питательной средой M199. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл CDCM. Добавьте к аликвоте 10 мкл клеточной суспензии трипан синего цвета, чтобы окрасить живые клетки. Добавьте образец суспензии клеток в гемоцитометр (клеточная счетная камера Малассеза). Под микроскопом подсчитайте окрашенные клетки для четырех рядов гемоцитометра (т.е. 40 квадратов), а затем вычислите среднее число клеток для одной строки. Рассчитайте концентрацию клеток суспензии, применив следующий метод: Количество ячеек/мл суспензии = среднее количество ячеек подряд (10 квадратов) x 10 общее количество квадратов гемоцитометра x разбавление трипановым синим x 1000 (для выражения результата в виде клеток/мл). Доведите клеточную суспензию до двух концентраций (5,6x 10 4 клеток/мл и 1,12 x10 5 клеток/мл), соответствующих двум плотностям покрытия (1 x 105 клеток/см2 и 2 x 105 клеток/см2) с помощью CDCM. Посеять 50 мкл двухклеточных суспензий в две предварительно обработанные черные 96-скважинные культуральная пластины. Распределите ячейки по пластинам многоканальной пипеткой справа от пластины слева, гомогенизируя между каждой колонкой, чтобы распределение ячеек было однородным. Добавьте 50 мкл библиотеки молекул (например, условных сред из библиотеки кДНК, см. ниже) для скрининга с использованием предопределенного шаблона(таблица 1). Инкубировать пластины в течение семи дней при 37°C при 5% CO2 без изменения среды. 6. Подсчет жизнеспособных клеток К каждой скважине пластины добавляют 2,7 мкМ кальциина АМ и 0,3 мМ гомодимера этидия.ПРИМЕЧАНИЕ: Кальцеин проникает в клетки, которые непроницаемы для больших молекул в виде гомодимера этидия. В цитоплазме живых клеток кальциин гидролизуется эндогенными эстеразами, становится флуоресцентным, испуская при 520 нм при возбуждении при 485 нм. Гомодимер этидия связывается с ДНК на мертвых клетках. Связывание этидия с ДНК-гомодимером вызывает красную флуоресценцию при 635 нм после возбуждения при 520 нм. Инкубировать пластины в течение 1 часа при комнатной температуре при отсутствии света. Считывание флуоресценции на автоматизированном пластинчатом считывателе, состоящем из перевернутого микроскопа, оснащенного ртутной лампой с двумя фильтрами возбуждения на 485 и 520 нм, двумя фильтрами излучения на 520 и 635 нм, объективом (x10), моторизованной ступенью, управляемой процессором и камерой устройства с зарядовой связью (ПЗС). Эта счетная платформа управляется программным обеспечением Metamorph19. Это позволяет получать флуоресцентные изображения живых клеток и мертвых клеток одновременно в каждой скважине 96-скважинной пластины, начиная от скважин А1 к скважине А12, затем В12 к В1, С1 к С12 и так далее(Таблица I). Рассчитать среднюю площадь А одной ячейки, используя 18 скважин отрицательных контрольных элементов(Таблица I). Подсчитайте ячейки в каждой скважине пластины и примените следующую эмпирическую формулу A x 29 / 20.7, чтобы предотвратить подсчет дублетов клеток (группировки двух ячеек). Оценить защитное действие колбок по молекулам как отношение между средним числом клеток в 4 скважинах, где мы тестировали молекулу, и средним числом клеток в 18 скважинах отрицательного контроля (см. Таблицу 1 и Дополнительный рисунок 1). Объедините результаты посеянных пластин при 1 х 105 клеток/см2 с результатами, посеянных при 2 х 105 клетках/см2, чтобы оценить потенциальную защиту (коэффициент жизнеспособности) каждой экранируемой молекулы.

Representative Results

Здесь мы описываем, как система культивированной конусом может быть использована для идентификации новых белков, защищающих конус. Мы использовали этот протокол для скрининга нормализованной библиотеки кДНК, состоящей из пигментированного эпителия сосудистой оболочки и сетчатки из 400 глаз 8-недельных крыс Лонг-Эванса43. Эта библиотека содержит 6,0 x 106 независимых колоний, образующих единицы (КОЕ) и имеет средний размер клонированной вставки 2,1 килобаза (кб), с более чем 99% рекомбинантных клонов. Пулы из 100 клонов из этой библиотеки были временно трансфектированы (0,1 мкг плазмидной ДНК) в клетки COS-1, а кондиционированная среда (CM) COS-1 была собрана после инкубации в течение 48 часов в DMEM без сыворотки. Мембраны или экзосомы не удалялись ультрацентрифугированием. Пятьдесят микролитров каждого СМ были добавлены к 4 скважинам двух 96-луночных пластин: одна засеяна на 2х 10 5 клеток/см2,другая на 4 х 105 клеток /см2. CM из клеток COS-1, трансфектированных пустым вектором pcDNA3.1, использованным для построения библиотеки, использовался в качестве отрицательного контроля(таблица 1). В общей сложности 2 112 наборов из 100 клонов, соответствующих 211 200 отдельным клонам, были оценены в четырех культурных колодцах и для двух условий посева обогащенных конусами культур. Эти два условия соответствуют двум несколько различным плотностям прививки, что позволяет более точно оценить защитную активность, в общей сложности 1 689 600 культурных скважин. Среди 42 пулов клонов с соотношением больше 2 пулы 0080 и 0073 имеют коэффициент жизнеспособности в 16 и 14 раз выше после 7 дней культивирования, чем отрицательный контроль, pcDNA3.1(Дополнительный рисунок 1). Этот анализ имеет важное значение для выявления пулов, представляющих интерес. Каждый выбранный пул из 100 клонов был разделен на 16 наборов по 10 клонов из их глицеринового запаса. Эти подгруппы были подготовлены и испытана в соответствии с тем же методом во втором раунде скрининга (т.е. в общей сложности 3 200 культурных скважин). Подгруппа 0073-09 дала самый сильный коэффициент жизнеспособности(дополнительный рисунок 2A)и была подразделена для получения 16 отдельных клонов, которые были протестированы в третьем раунде скрининга на культурах, обогащенных конусами. Клон 0073-09-37 явно выделяется на других с коэффициентом жизнеспособности, равным 2,5(Дополнительный рисунок 2B). Ось y имеет другую шкалу, даже если плотность посева была такой же, как на дополнительном рисунке 2A. Мы часто видели это, когда анализы повторяются еженедельно в течение нескольких месяцев. После анализа эти результаты подтверждают, что клон 0073-09-37 оказывает надежное и воспроизводимое влияние на выживание конуса. Тест повторяли независимо(рисунок 3A),а вставку 1,8 кб секвенировали(рисунок 3B). Биоинформатический анализ показал, что клон 0073-09-37, который мы назвали фактором жизнеспособности конуса эпителия (EdCVF), содержит три открытых кадра считывания (ORF), один из которых наиболее восходящий (ORF1) кодирует 84 остатка С-концевой части белка крысы цинкового пальца-180 (ZFP180, NP_653358) из 727 аминокислот44. Два других ORF (ORF2 и ORF3) гораздо менее хорошо сохраняются у мышей и отсутствуют у других млекопитающих. При независимом тестировании только ORF1 оказывает защитное действие на колбок(дополнительный рисунок 3). ORF1 продуцировали в виде белка слияния глутатион S-трансферазы (GST)(рисунок 4A). Белок EdCVF очищали, а метку GST удаляли(рисунок 4B). EdCVF способен предотвращать конусную дегенерацию в системе культур, обогащенной конусами(рисунок 4C). Рисунок 1:Куриные эмбрионы на 28-й,29-й и 30-й стадиях развития. Стрелки W: крыло, C: воротник и B: клюв. Шкала 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2:Рассечение сетчатки куриного эмбриона Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3:Коэффициент жизнеспособности конуса эпителия (EdCVF), клон 0073-09-37. А. Повышенная жизнеспособность на конусной обогащенной культуре. В. Последовательность клона кДНК 0073-09-37. Подчеркнутая последовательность GAATTC представляет себя сайтом ограничения EcoRI, используемым для создания библиотеки. Два кодона GTG, выделенные жирным шрифтом, являются необычными сайтами инициации перевода для EdCVF, происходящими из вектора. Статистический анализ по студенческому тесту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4:Рекомбинантная активность EdCVF. A. Последовательность EdCVF при слиянии с глутатион S-трансферазой (GST). В. Очищенный рекомбинантный белок EdCVF. С. Трофическая активность GST-EdCVF на конусе в культуре. Статистический анализ с использованием теста Туки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1: Соотношение среднего числа клеток для пула кДНК и отрицательного контроля, кондиционированной среды клеток COS-1, трансфекционированных пустым вектором pcDNA3.1 во время первого раунда скрининга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.  Дополнительно Рисунок 2: Количество живых клеток. А. Второй раунд скрининга с подгруппами пула 0073. В. Третий раунд скрининга с изолированными клонами. CN: кондиционированная среда клеток COS-1, трансфекционированных пустым вектором, pcDNA3.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок3: Трофическая активность трех открытых кадров считывания изолированного клона 0073-09-37. Статистический анализ с использованием теста Даннетта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ля 1 1 1 1 2 ЧПУ 2 2 2 3 3 ЧПУ си ЧПУ 3 3 4 4 4 ЧПУ 4 5 5 5 5 до 6 ЧПУ 6 6 6 7 7 ЧПУ 7 7 8 8 ре 8 8 ЧПУ 9 9 9 9 10 ЧПУ 10 10 10 ми 11 11 11 ЧПУ 11 12 12 12 12 ЧПУ 13 13 фа 13 13 14 14 ЧПУ 14 14 15 15 15 ЧПУ 15 соль 16 16 16 16 17 ЧПУ 17 17 17 18 18 ЧПУ ч 18 18 19 19 19 19 ЧПУ 20 20 20 ЧПУ 20 Отрицательный контроль ЧПУ 1-20 позиций пулов, протестированных в четырехкратном размере Таблица 1: План плиты из 96 скважин для отбора высокого содержания

Discussion

Среди многих параметров, которые могут ограничить производство обогащенной конусами культуры из куриных эмбрионов, первым критическим шагом является точное определение стадии развития эмбрионов в инкубационных яйцах. Было замечено, что культура клеток из сетчатки эмбрионов на ED8 (34-я стадия) продуцируеттолько 35% фоторецепторов, а остальные 65% состоят из других нейронов4. Какой бы ни была логистика, применяемая для получения инкубированных яиц, необходимо точно настроить температуру и время инкубации, а также тщательно изучить эмбрионы по сравнению с эталонными картинами всех стадий развития42,45.

Первоначально система культивируемых культур, обогащенных конусами, была разработана с использованием штамма White Leghorn4. Белый цвет яиц этого сорта не особенно ценится во Франции, поэтому мы использовали штамм курицы, который производит коричневые яйца. Мы использовали штамм I 657, который производится путем скрещивания петухов I 66 с курами JA575. Мы смогли воспроизвести характеристики самобытных культур. Это показывает, что генетический фон курицы не критичен для получения обогащенных конусами культур.

Мы не тестировали эффект индивидуального удаления добавок в культуральной среде, но наблюдали, что инсулин играет решающую роль в соответствии с влиянием инсулина на выживаемость колбок у мыши rd1, модель аутосомно-рецессивного RP46. Трийодтиронин (Т3) может также участвовать в дифференцировке клеток-предшественников сетчатки куриного эмбриона в колбюшки в соответствии с ролью рецептора гормона щитовидной железы в судьбе клеток сетчатки во время развития40. Следовательно, обогащенная конусом система культивирования не может быть использована для идентификации инсулина путем экспрессииклонирования 46.

Система культуры, обогащенная конусами, опирается на культуру первичных нейронов и гораздо более уместна методам, опирающимся на использование увековеченных клеток в качестве клеточной линии 661W24,25,26.

Описанный здесь способ может быть модифицирован путем выполнения предварительной электропорации с плазмидной ДНК20. Перед приготовлением суспензии клеток сетчатки всю сетчатку помещают в камеру изготовленного на заказ электропоратора со 120 мкл 0,5 мкг/мкл плазмидной ДНК в 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА. Пять импульсов по 15 В по 50 мс каждый применяются разделенными интервалом 950мс 22. Попытки доставить интерферирующую РНК (РНК) с использованием ретровирусов компетентной репликации птичьего сращения (RCAS) в культуры, обогащенные конусами, были неудачными47. Это, безусловно, связано с тем, что в отсутствие сыворотки и в культурах низкой плотности клетки-предшественники сетчатки не являются реплицативными, что необходимо для распространения ретровирусов.

Мы разработали систему культур, обогащенную конусами, для выявления трофических факторов, способствующих выживанию конуса, с помощьюэкспрессии клонирования 19. Чтобы сделать это возможным, мы выполнили первый шаг скрининга высокого содержания с использованием кондиционированной среды из пулов из 100 клонов. Даже если кДНА из библиотеки экспрессируются под контролем сильного промотора ЦМВ после трансфекции клеток COS-1, это не дает гарантии, что все белки, кодируемые отдельными цДНК, достигают концентрации, достаточной для того, чтобы быть оцененными положительной путем анализа жизнеспособности. Это серьезное ограничение. В этом смысле любой скрининг не является на самом деле исчерпывающим. Кроме того, даже если перемягонные белки не были удалены из кондиционированной среды, конфигурация анализа неблагоприятна для идентификации недиффузионных факторов. Альтернативой было бы скрининг отдельных клонов после получения последовательности cDNAs, чтобы избежать дублирования при анализе во много раз одного и того же белка-кандидата. Это было инициировано секвенированием библиотек кДНК сетчатки, которые мы использовали43. Хотя этот подход и рационален, он также имеет свои ограничения. Биоинформационный анализ последовательностей кДНК будет непреодолимо навязывать, помимо уменьшения избыточности, приоритет скрининга определенных клонов на основе знаний. Это не будет вредным, если, наконец, вся библиотека будет проверена, даже если время, необходимое для этого, будет значительно удлинено. Но неизменно идентичность последовательности будет влиять на наш взгляд на результаты. Это не будет нейтральным, поскольку интерпретация последовательности, естественно, будет соревноватеться с экспериментальными данными.

Идентификация EdCVF также показывает, что высокий скрининг контента влечет за собой технические ограничения. С первого раунда скрининга мы выявили два бассейна с высокой активностью(Дополнительный рисунок 1). Пул 0073 привел к успешной идентификации EdCVF, в то время как пул 0080 не проводил такого вывода. Мы не решили проблему, которая могла возникнуть в результате потери активного клона во время подготовки под пулов. В качестве альтернативы, не исключено, даже если не статистически благоприятно, что среди цДНК пула 0080 два белка действовали синергетически и их активность не могла наблюдаться как отдельные клоны.

Идентификация молекул, защищающих колбок, путем скрининга малых молекул является будущим применением системы культур, обогащенной конусами. Такие молекулы будут неоценимы для лечения патологий сетчатки, для которых генная терапия не является наиболее подходящим подходом, как возрастная макулярная дегенерация.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Жака Беллалу, Лорелея Фурнье, Эммануэль Клерен, Фредерика Блонда и антрепризу agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Франция) за их неоценимую помощь. Эта работа была поддержана Inserm, Университетом Сорбонны, Национальным агентством исследований (ANR, Labex Lifesenses), Фондом борьбы со слепотой (США) и IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] при поддержке французских государственных фондов, управляемых ANR в рамках программы Investissements d’Avenir.

Materials

96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) Corning 3603
Calcein AM Thermo-Fisher scientific C1430
CCD Camera Photometrics CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich C0256
CO2 Independant Thermo-Fisher scientific 18045-054
Curved forceps Dutscher 005093
DMEM Media Thermo-Fisher scientific 41966-029
DNAse Sigma-Aldrich D4263
Eggs incubator FarmLine M08 01 3100
Ethidium Homodimer Thermo-Fisher scientific E1169
Fœtal bovine serum Thermo-Fisher scientific 10270-098
Gentamycin Thermo-Fisher scientific 15710-049
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0880
ITS (insulin Transferine selenium) Sigma-Aldrich I1884
large straight pliers Dutscher 005074
Linoleic acid Sigma-Aldrich L8384
M199 medium Thermo-Fisher scientific 31150-022
Metamorph software Metamorph
Microscope NIKON Eclipse TE2000
Motorized stage Martzauzer Mutlicontrol 2000
Optical filter switch Shutter Instrument company Lambda 10-2
PBS 1X Thermo-Fisher scientific 14190-086
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Progesterone Sigma-Aldrich P7556
Pursept A express Fisher scientific 11814110
Putriscine Sigma-Aldrich P5780
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
straight forceps Dutscher 005092
Taurine Sigma-Aldrich T8691
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T6397
Trypan blue Thermo-Fisher scientific 15250-061
Trypsine 0.25 % Thermo-Fisher scientific 25200-056
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Brownstein, C. D. . The Implicit Mind. , (2019).
  2. Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
  3. Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
  4. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  5. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
  6. Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
  7. Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. RetNet. . Retinal Information Network. , (2020).
  10. Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
  11. Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
  12. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
  13. Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
  14. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
  15. Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
  16. Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
  17. Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  18. Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
  19. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
  20. Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
  21. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  22. Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
  23. Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
  24. Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
  25. Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
  26. Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
  27. Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
  28. Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
  29. Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
  31. Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
  32. Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
  33. Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
  34. Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
  35. Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
  36. Gagliardi, G., Ben M’Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
  37. Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
  38. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  39. Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
  40. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  41. Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
  42. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  43. Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
  44. Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
  45. Stern, C. D., Holland, P. W. . Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
  46. Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
  47. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).

Tags

Cone ReceptorsChicken EmbryoRod-cone InteractionsRetinal DegenerationCone-enriched CulturePrimary Cell CultureHamburger And Hamilton StagesCarbon Dioxide-independent MediumRinger’s MediumTrypsin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Millet-Puel, G., Pinault, M., Cordonnier, M., Fontaine, V., Sahel, J., Léveillard, T. Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (169), e61998, doi:10.3791/61998 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image