从鸡胚胎的直膜到研究棒到锥细胞相互作用的锥形丰富文化

该议定书得到了皮埃尔大学和玛丽居里大学动物实验伦理委员会和法国研究部（许可证编号：APAFIS#1028 2015070211275177）的批准。动物实验是在以下授权下进行的：”A-75-1863年自动化证书”。巴黎警察局（2011年11月9日至2016年11月8日）。 1. 受精卵的孵化 收集每周受精卵（菌株I 657，红色标签），自然获得，在工业孵化场。 受精卵被母鸡”产卵”后，将受精卵保持在17°C（其生物零度）。 对于每种培养物，在20°C下孵育7个受精卵24小时，然后在37°C时136小时，在潮湿的腔室中间歇性地恢复卵位（从一侧到对面的渐进运动2小时，4小时周期）。 2. 鸡胚胎的恢复 用消毒剂（例如，附着A快车）清洗七个鸡蛋的表面。 要打破蛋壳，在壳的顶部用大直钳打个洞。然后切开壳，把帽子从鸡蛋上取下，作为软煮鸡蛋。 用弯曲的钳子轻轻地从蛋壳中提取每个胚胎，然后将其转移到含有无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的培养皿中，该盐水以前加热到 37 °C。 轻轻地，取出环绕胚胎的信封（胆汁或胆囊膜）。 通过与汉堡和汉密尔顿42的视觉比较，验证每个胚胎的发育阶段。 在第29个 发育阶段选择两个胚胎（图1）。翅膀在肘部弯曲。衣领明显突出。该法案比第28阶段 更为突出。 激发这些选定胚胎的眼睛，并以二氧化碳独立介质（生命技术）转移它们。注意：胚胎处于第29阶段，而不是第28或30阶段（图1）：这就是为什么有必要孵育至少7个鸡蛋，即使只有两个将最终使用。胆汁很薄，很难区分，但它与胚胎非常接近，所以它必须去除而不接触胚胎。 3. 视网膜解剖 用弯曲的钳子斩首并诱导选定的胚胎。 将四只眼睛转移到 CO2独立介质中。此介质包含 0.9 m 卡Cl2 和 0.65 mM 毫克2。 将眼睛与角膜朝下定位，视神经面向实验者。用两个直钳在视神经上钻一个洞。 在网状膜和色素上皮之间插入每个钳子的分支（图2）。拉上每个钳子，旋转眼睛，从视网膜分离上皮。取出角膜，然后是镜片和静脉。 在含有林格介质的培养皿中以 pH 7.2 传输四个视网膜。注意：确保只有视网膜保留并去除任何微量的视网膜和残留的视网膜色素上皮。 4. 准备视网膜细胞悬架 使用两个直钳将四个视网膜切成非常小的碎片。 用林格的介质清洗视网膜两次。 使用林格介质进行第二次洗涤后，让小灵汀娜碎片落在管子底部，并取出林格的介质。在 37 °C 下用 trypsin 溶液（0.25% w/v）治疗视网膜片件 20 分钟。 通过连续吸力在 10 分钟后分散溶液。使用巴斯德移液器放电，并检查视网膜碎片的分离情况。停止反应，添加文化介质补充10%灭活胎儿小牛血清。 在加入 DNase 后，立即使用巴斯德移液器连续吸附和放电，用 0.05 毫克 DNase I. 分离细胞簇和 DNA，从而孵育细胞悬浮。 用化学定义培养介质 （CDCM） 清洗视网膜细胞悬架两次：Dulbecco 的改良鹰介质和 M199 介质的体积相等，并辅以 100 μg/mL 亚油酸/BSA， 0.86 μM 胰岛素， 0.07 μM 转移林， 2.0 μM 黄体酮， 0.28 μM 前列腺素， 0.29 μM Na2SeO3， 182 μM 普特雷斯辛， 3 m 牛磺酸， 4.7 μM 西蒂丁 5+二磷胆素， 2.7 μM 青霉素 5+二磷乙醇胺， 0.55 μM 氢皮质松， 0.03 μM 三磷霉素， 1 mM 丙酮钠和 20 μM 根塔霉素. 5. 视网膜细胞播种 在37°C时，用透明底处理两个黑色96井培养板2小时，多L-lysine在32.25微克/厘米2。 用 M199 文化介质冲洗这些板两次。将细胞颗粒在 1 mL 的 CDCM 中恢复。 添加到细胞悬架的 10μL 的别名中，尝试泛蓝色来染色活细胞。将细胞悬浮标本添加到血细胞计（马拉塞兹细胞计数室）中。 在显微镜下，数一数血细胞仪四行（即40平方）的染色细胞，然后计算一行的平均细胞数。应用以下方法计算悬浮细胞的浓度：悬浮的细胞/mL 数 = 连续（10 平方）x 10 的细胞平均数，血细胞仪 x 稀释的正方形数与 trypan blue x 1，000（以细胞/mL 表示结果）。 使用 CDCM 将细胞悬浮到两个浓度（5.6 x 104细胞/mL 和 1.12 x10 5细胞/mL），对应于两个电镀密度（1 x 105细胞/厘米2和 2 x10 5细胞/cm2）。 种子 50 μL 的两个细胞悬架到两个预处理的黑色 96 井培养板。用多通道移液器从板的右侧向左分配板中的细胞，使每个柱子之间均匀，使细胞的分布是均匀的。 添加分子库的 50 μL（例如，cDNA 库中的条件介质，见下文），使用预先定义的模式（表 1）进行筛选。 在 5% CO 2 下的 37°C 下孵化板7 天，无需更换介质。 6. 计算可行细胞 在板的每口井中，加入2.7微米钙素AM和0.3毫米同源性乙酸钠。注：钙素穿透大分子不可渗透的细胞，作为同质体。在活细胞的细胞质中，钙化物被内源性酯酶水解，在485纳米兴奋时以520纳米的速度发光，成为荧光。同源体与死细胞上的DNA结合。DNA-同源体结合导致红色荧光在520纳米激发后以635纳米发出。 在没有光线的情况下，在室温下将盘子孵化1小时。 阅读自动板读取器上的荧光，该读数由装有汞灯的倒置显微镜组成，该显微镜配有两个 485 和 520 nm 的激发滤光片、520 和 635 nm 的两个排放过滤器、一个目标 （x10）、一个由处理器控制的电动舞台和一个充电耦合设备摄像头 （CCD）。此计数平台由变形软件19 控制。它使在96井板的每个井中同时获得活细胞和死细胞的荧光图像成为可能，从井A1到A12井，然后B12向B1，C1对C12等（表一）。 使用负控件的 18 口井计算单个单元的平均面积 A （表 I）。 数一数板中每个井中的细胞，并应用以下经验公式 A x 29/ 20.7 以防止细胞双倍（两个细胞的分组）被计算在内。按分子对圆锥体的保护作用进行评分，作为我们测试分子的 4 口井中平均细胞数与负控制 18 口井中平均细胞数之间的比率（参见表1和补充图 1）。 将 1 x 105 细胞/cm2 播种的板的结果与 2 x 105 细胞/cm2 播种的板的结果相结合，以评估每个分子筛选的潜在保护（生存率）。