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Immunologia e infezioni

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61967
, , ,
1Department of Molecular Microbiology,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

Ein Mausmodell der uropathogenen transurethralen E. coli (UPEC) -Inokulation zur Etablierung latenter intrazellulärer Blasenreservoirs und einer anschließenden Blasenexposition gegenüber G. vaginalis zur Induktion einer rezidivierenden UPEC-Harnwegsinfektion ist nachgewiesen. Ebenfalls demonstriert werden die Aufzählung von Bakterien, die Urinzytologie und die In-situ-Blasenfixierung und -verarbeitung für die Rasterelektronenmikroskopie.

Abstract

Rezidivierende Harnwegsinfektionen (rUTI), die durch uropathogene Escherichia coli (UPEC) verursacht werden, sind häufig und kostspielig. Frühere Artikel, die Modelle der Harnwegsinfektion bei männlichen und weiblichen Mäusen beschreiben, haben die Verfahren zur bakteriellen Inokulation und Aufzählung in Urin und Gewebe veranschaulicht. Während einer anfänglichen Blaseninfektion bei C57BL/6-Mäusen etabliert UPEC latente Reservoirs in Blasenepithelzellen, die nach Clearing der UPEC-Bakteriurie bestehen bleiben. Dieses Modell baut auf diesen Studien auf, um rUTI zu untersuchen, die durch das Auftreten von UPEC aus latenten Blasenreservoirs verursacht werden. Das urogenitale Bakterium Gardnerella vaginalis wird in diesem Modell als Auslöser von rUTI verwendet, da es häufig in den urogenitalen Trakten von Frauen vorhanden ist, insbesondere im Zusammenhang mit vaginaler Dysbiose, die mit Harnwegsinfektionen in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wird eine Methode zur In-situ-Blasenfixierung mit anschließender Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Analyse des Blasengewebes beschrieben, mit einer möglichen Anwendung auf andere Studien mit der Blase.

Introduction

Harnwegsinfektionen (UTI) stellen weltweit eine erhebliche Belastung für die Gesundheitsversorgung dar und beeinträchtigen jedes Jahr die Lebensqualität von Millionen von Menschen, insbesondere von Frauen,1. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) sind die häufigste Ursache fürHarnwegsinfektionen 1. Viele Patienten (ca. 20-30%), die eine Harnwegsinfektion entwickeln, werden trotz antibiotikavermittelter Clearance der Erstinfektion innerhalb von 6 Monaten eine rezidivierende Harnwegsinfektion (rUTI) erleben2. Leider leiden bis zu 5% der prämenopausalen Frauen jedes Jahran 3 oder mehr rUTI 3,4. Sequenzielle Episoden von rUTI können durch Persistenz desselben UPEC-Stammes aus dem Indexfall 5,6,7,8 verursacht werden. Daten aus menschlichen Proben und Mausmodellen deuten darauf hin, dass rUTI mit gleichem Stamm durch UPEC verursacht werden könnte, die sich in ruhenden Reservoirs in der Blase befindet. Beim Menschen wurden UPEC in Epithelzellen und Blasenbiopsien von Patienten mit Harnwegsinfektionen 9,10,11,12,13 nachgewiesen. Studien an C57BL/6-Mäusen haben gezeigt, dass einige UPEC-Stämme ruhende intrazelluläre Reservoirs in der Blase aufbauen können, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie und durch Homogenisierung und Kultur von Blasengewebe nachgewiesen wurden, die monatelang nach Auflösung der Bakteriurie14,15,16 aufrechterhalten werden. Die Behandlung der Blase mit Mitteln, die ein Peeling des Blasenepithels (Urothel) induzieren, z. B. Protaminsulfat17 oder Chitosan18, lösen das Auftreten von UPEC aus Reservoirs aus, um rUTI zu verursachen. Diese Daten deuten darauf hin, dass bei Frauen, die Blasen-UPEC-Reservoirs aus einer früheren Infektion beherbergen, Blasenexpositionen, die zu einem Urothelpeeling führen, rUTI auslösen können.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die vaginale Mikrobiota zur Harnwegsinfektion beiträgt19,20. Gardnerella vaginalis ist ein häufiges Mitglied sowohl der vaginalen als auch der urinalen Mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. In der Vagina ist das Vorhandensein hoher G. vaginalis-Spiegel mit einer mikrobiellen Dysbiose verbunden, die als bakterielle Vaginose (BV) bekannt ist und ~ 30% der Frauen30,31,32 betrifft. Frauen mit BV haben ein höheres Risiko, an Harnwegsinfektionen zu erkranken, verglichen mit Frauen mit einer vaginalen Gemeinschaft, die von Lactobacillus33,34,35,36,37 dominiert wird. In Mausmodellen verursacht G. vaginalis ein epitheliales Peeling sowohl in der Vagina38 als auch in der Blase39. Bei C57BL/6-Mäusen, die UPEC-Blasenreservoirs beherbergen, führen zwei aufeinanderfolgende Blasenexpositionen gegenüber G. vaginalis – aber nicht gegenüber PBS – zu einem Wiederauftreten von UPEC aus Reservoirs, um UPEC rUTI zu verursachen. Das Auftreten wird durch das Auftreten von UPEC-Titern im Urin von Mäusen belegt, die zuvor die UPEC-Bakteriurie aufgelöst hatten, und eine anschließende Abnahme der UPEC-Blasenhomogenattiter bei der Aufopferung im Vergleich zu PBS-exponierten Kontrolltieren39. Interessanterweise gibt es keine dauerhafte Besiedlung durch G. vaginalis in der Blase. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle reichen zwei kurze Expositionen mit jeweils weniger als 12 (h) lebensfähigem G. vaginalis im Urin aus, um ein urotheliales Peeling auszulösen und die rUTI zu fördern.

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell von rUTI, das durch UPEC verursacht wird, das sich in intrazellulären Blasenreservoirs befindet, wobei die Blasenimpfung von G. vaginalis verwendet wird, um das Wiederauftreten auszulösen. Der Fortschritt, den dieses Modell erzielt, besteht darin, dass G. vaginalis im Vergleich zu bisher verwendeten chemischen Mitteln ein klinisch relevanter biologischer Auslöser von rUTI ist. Darüber hinaus ermöglicht das relativ kurzlebige Überleben von G. vaginalis in den Harnwegen der Maus die Untersuchung der Auswirkungen vorübergehender mikrobieller Expositionen auf das Urothel, wie sie nach sexueller Aktivität auftreten könnten. Neben der Skizzierung des rUTI-Modells beschreibt dieses Protokoll auch Methoden zur Urinzytologie und in situ Blasenfixierung und Bildgebung des Urothels mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM).

Dieses Protokoll der G. vaginalis-induzierten rezidivierenden UPEC UTI verwendet den UPEC-Stamm UTI89 mit einer Kanamycin-Widerstandskassette (UTI89kanR)40. Nicht alle getesteten UPEC-Stämme waren in der Lage, während des akuten Infektionsstadiums bei Mäusen 41 intrazelluläre Bakteriengemeinschaften zu bilden, und es ist noch nicht bekannt, ob alle UPEC-Stämme die Fähigkeit haben, latente intrazelluläreReservoirs zu bilden. Die Reservoirbildung sollte vor der Verwendung anderer UPEC-Stämme im Modell bestätigt werden. Dieses Protokoll verwendet ein spontanes Streptomycin-resistentes G. vaginalis-Isolat, JCP8151BSmR38. Die Induktion von rUTI durch JCP8151BSmR erfordert zwei aufeinanderfolgende G. vaginalis-Impfungen, die entweder 12 h oder 7 Tage (d) im Abstandvon 39 gegeben sind. Ob andere G. vaginalis-Stämme ein Peeling und/oder UPEC rUTI induzieren, muss mit diesem Modell noch bestimmt werden. Es ist wichtig, UPEC- und G. vaginalis-Stämme mit bekannter Antibiotikaresistenz (wie Kanamycin oder Spectinomycin für UPEC und Streptomycin für G. vaginalis) zu verwenden, da Antibiotika zu Agarplatten hinzugefügt werden können, um das Wachstum endogener Mausmikrobiota zu verhindern, die sonst die Aufzählung koloniebildender Einheiten (CFU) zur Überwachung der Infektion stören könnten. Dies ist besonders wichtig für die Kultivierung von Urinproben, da Mausurin häufig andere Bakterien enthält, die ohne Antibiotika auf Kulturplatten überwachsen können. Der Ursprung dieser endogenen Bakterien im Mausurin ist unbekannt, spiegelt aber wahrscheinlich periurethrale und urogenitale Bakterien wider, die während der Urinsammlung aufgenommen wurden.

G. vaginalis ist ein fakultatives anaerobes Bakterium und daher beschreibt dieses Protokoll den Anbau von G. vaginalis JCP8151BSmR in einer anaeroben Kammer. Wenn keine anaerobe Kammer verfügbar ist, können andere Methoden zur Aufrechterhaltung anaerober Wachstumsbedingungen (z. B. ein GasPak-Beutel in einem luftdichten Behälter) verwendet werden. Alternativ wachsen einige Stämme von G. vaginalis (einschließlich JCP8151B SmR) in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (5% CO2). So wie die Verwendung anderer G. vaginalis-Stämme als JCP8151BSmR Tests erfordert, um sicherzustellen, dass sich die Bakterien in diesem Modell ähnlich verhalten, erfordert die Änderung der Wachstumsbedingungen eine empirische Bestimmung der idealen Dauer für Kultur (auf Platten und in Flüssigkeit) und optische Dichte (OD) 600-Äquivalente, um die gewünschten lebensfähigen Inokulumkonzentrationen zu erreichen. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob die Wachstumsbedingungen die Pathobiologie von G. vaginalis beeinflussen.

Schließlich sollten sich die Forscher bei der Überlegung, ob dieses Modell verwendet werden soll, bewusst sein, dass es eine größere Anzahl von Tieren pro Gruppe erfordern kann als typische UTI-Mausmodelle. Dies liegt zum Teil daran, dass die Induktion von rUTI erfordert, dass die Mäuse die durch die Erstinfektion der Blase verursachte UPEC-Bakteriurie auflösen. Daher ist jede Maus, die keine Bakteriurie (ein Phänotyp, der normalerweise auf eine anhaltende Niereninfektion hinweist) nicht in die rUTI-Phase des Protokolls einbezogen. Die Anzahl der Mäuse, die benötigt werden, um diese Studien durchzuführen, wird auch durch die Rate des “spontanen” UPEC-Auftretens in den Urin beeinflusst (durchschnittlich 12-14%). Schließlich haben verschiedene Mausstämme unterschiedliche Neigungen zur Entwicklung chronischer Bakteriurie im Vergleich zur intrazellulären Reservoirbildung42,43. Bei Verwendung anderer Mausstämme als C57BL/6 in diesem Modell muss bestätigt werden, dass die Tiere ruhende intrazelluläre UPEC-Reservoirs entwickeln.

Protocol

Das Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigte alle Mausinfektionen und -verfahren als Teil der Protokollnummer 20170081, die am 06.09.2020 ablief, und 20-0031, die am 18.03.2023 abläuft. Die Gesamtpflege der Tiere entsprach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council und dem USDA Animal Care Resource Guide. Die Euthanasieverfahren stehen im Einklang mit den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: Ausgabe 2020. Abbildung 1. Schematische Darstellung des Mausmodells. Der Zeitplan wird hervorgehoben, um die Phasen oder Verfahren des im Protokoll beschriebenen Modells widerzuspiegeln. Phase 1 (orange): Etablierung intrazellulärer UPEC-Reservoirs. Mäuse werden transurethral mit UPEC geimpft und Urinproben werden gesammelt und auf Clearance von Bakteriurie überwacht. Nur Mäuse, die Bakterien beseitigen, gehen in die nachfolgenden Phasen über. Phase 2 (grün): Blasenexposition gegenüber G. vaginalis. Mäuse werden zweimal transurethral mit G. vaginalis geimpft. Die Zeitspanne zwischen den beiden sequentiellen Belichtungen beträgt entweder 12 h (oberes Panel) oder 1 Woche (wk; unteres Panel), abhängig von der gewünschten nachgelagerten Analyse. Phase 3 (gelb): UPEC rUTI. Der Urin wird täglich nach der Exposition von G. vaginalis gesammelt und auf UPEC-Bakteriurie überwacht. Zusätzlich können Blasen und Nieren am experimentellen Endpunkt gesammelt werden, um UPEC-Gewebetiter zu messen. Im 1-wöchigen Expositionsmodell spiegeln sich das G. vaginalis-induzierte Auftreten von UPEC aus intrazellulären Reservoirs und die anschließende Clearance aus den Harnwegen auch in einer Abnahme der UPEC-Blasengewebetiter wider (im Vergleich zu PBS-exponierten Mäusen, siehe Abbildung 3D). Diese Abnahme der Blasentiter war im 12-Stunden-Expositionsmodell nicht offensichtlich, vermutlich weil mehr Zeit benötigt wird, um eine ausreichende Reservoirentstehung und -clearance zu erreichen, um die Gewebetiter signifikant zu reduzieren. Verfahren A: Die Urinzytologie wird typischerweise 1 dpi (oder sogar früher) während Phase 1 durchgeführt, um eine akute UPEC-Infektion zu untersuchen, und während der Phase, in der der PMN-Gehalt des Urins beurteilt wird, der mit der UPEC-Emergenz korreliert. Urinproben, die zu anderen Zeitpunkten entnommen wurden, können in ähnlicher Weise analysiert werden. Verfahren B: Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Blase zur Untersuchung des Urothelpeelings wird typischerweise im 12-Stunden-Modell bei 3 h nach der zweiten G. vaginalis-Exposition (15 h nach Verabreichung der ersten Exposition zum Zeitpunkt 0) durchgeführt. Andere Zeitpunkte können ebenfalls beurteilt werden, wie z.B. 6-24 h nach der UPEC-Impfung, wie in Phase 1 gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 1. Einrichtung von UPEC-stillen intrazellulären Reservoirs bei Mäusen Bereiten Sie Harnkatheter vor (siehe 44,45,46,47 für Videos dieses Schrittes). Gewinde-30-Gauge-Nadeln mit einer Länge von PE10-Schläuchen, die sich von der Nadelbasis bis zu mehreren mm über die Nadelspitze erstrecken. Achten Sie darauf, den Schlauch nicht mit der Nadelspitze zu durchstechen. Alternativ können Sie pädiatrische intravenöse Kanülen46 verwenden. Vorbereitete Katheter in eine Petrischale geben und mit UV-Licht mindestens 30 min sterilisieren. Ersetzen Sie den Deckel der Petrischale und sichern Sie ihn für die Lagerung, bis er benötigt wird. UPEC-Inokulum vorbereiten (Tag -3 bis 0) Tag -3: Streifen Sie UTI89kanR von -80 °C Gefriermaterial auf eine Luria-Bertani (LB) Agarplatte. Inkubationsplatte bei 37 °C für 18-24 h.HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Kanamycin zu den Inokulum-Wachstumsmedien hinzuzufügen, da die Kanamycin-Resistenz stabil in UTI89-KanR integriert ist. Tag -2: Beimpfen Sie 20 ml LB-Brühe in einem sterilen 125-ml-Kolben mit einer einzelnen Kolonie UTI89kanR. Verwenden Sie keinen kleineren Kolben, da diese Kulturmethode wichtig ist, um die Expression des UPEC-Typ-1-Pilus zu induzieren, der für die Blasenadhäsion notwendig ist. Statisch (ohne Schütteln) bei 37 °C für 18-24 h inkubieren. Fügen Sie dem Wachstumsmedium keine Antibiotika hinzu. Verwenden Sie nur frische Kolonien auf LB-Platten (18-24 h alt), um flüssige Kulturen zu starten. Tag -1: Subkultur UTI89kanR durch Entfernen von 20 μL Kultur (vorsichtig den Kolben schwenken, um abgesetzte Bakterien zu resuspendieren) und Zugabe von 20 ml frischer LB-Brühe in einem sterilen 125 ml Kolben. Inkubieren wie in Schritt 2, mit Ausnahme einer festen Dauer von 18 h. Fügen Sie dem Wachstumsmedium keine Antibiotika hinzu. Tag 0: Die gesamte Kultur in ein 50-ml-Röhrchen überführen und bei 3200 × g in einer Tischzentrifuge für 10 Minuten auf Pelletbakterien drehen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 10 ml PBS. Fügen Sie 100 μL der konzentrierten Bakteriensuspension aus Schritt 4 bis 900 μL PBS in eine Küvette hinzu und bestimmen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer, das mit PBS ausgeblendet wurde. Multiplizieren Sie den Spektralphotometerwert mit 10 (um die Verdünnung zu berücksichtigen), um den OD600 der Suspension (OD-Suspension) zu bestimmen. Um die gewünschte Inokulumkonzentration von 1 x 107 KBE in 50 μL zu erreichen, verdünnen (oder konzentrieren) Sie die UTI89-KanR-Suspension mit der folgenden Gleichung, wobei das gewünschte OD-Inokulum 0,35 beträgt (der Wert kann für andere UPEC-Stämme variieren) und Y das erforderlicheInokulumvolumen ist (100 μL pro Maus, um zusätzliche Blasen zu beseitigen und die Katheter zu füllen):X mL xOD-Suspension = Y mL xOD-InokulumWenn derOD-Suspensionswert beispielsweise 4,7 beträgt und 5 ml Inokulum erforderlich sind:X ml × 4,7 = 5 × 0,35X = (5 × 0,35) / 4,7X = 0,372 mlFügen Sie daher 372 μL Bakteriensuspension hinzu, um 5 ml (Endvolumen) zu erhalten Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 1:10 serielle Verdünnungen des Inokulums auf 10-6 in sterilem PBS in einer 96-Well-Platte vorzunehmen. Spot fünf 10 μL Replikate aller 6 Verdünnungen auf einer LB und LB+kan Platte, lassen Sie die Spots trocknen und inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht. Die LB-Platte ohne Antibiotika wird verwendet, um sicherzustellen, dass das Inokulum nicht von einem anderen Organismus kontaminiert wurde (was als zusätzliche Koloniemorphologie erscheinen würde, die nicht auf der Kan-Antibiotika-Selektionsplatte vorhanden ist). Beide Plattentypen sollten das gleiche Ergebnis liefern.HINWEIS: Die Platten sollten vor dem Gebrauch einen Tag lang auf der Tischplatte trocknen gelassen werden, damit sie die plattierte Flüssigkeit absorbieren, ohne dass Flecken zusammenwachsen. Zählen Sie die Gesamtzahl der Kolonien an allen Stellen der Verdünnung mit unterscheidbaren Kolonien und verwenden Sie den Wert, um die tatsächliche Inokulumdosis zu berechnen, die in jedem Experiment verwendet wird. Verlassen Sie sich nicht einfach auf die OD600 Werte. UTI89kanR in die Blasen von betäubten weiblichen Mäusen impfen (Tag 0)HINWEIS: Videoaufzeichnungen dieses Verfahrens wurden zuvorveröffentlicht 44,46. Beziehen Sie sich auf diese Papiere für eine gründlichere Beschreibung. Weitere Einzelheiten zur Katheterisierung von Mäusen finden Sie in Abschnitt 5 dieses Protokolls. Anästhesieren Sie Mäuse mit Isofluran-Inhalation nach IACUC-zugelassenen Methoden. Während Sie darauf warten, dass Mäuse betäubt werden, füllen Sie die Tuberkulinspritze mit UTI89kanR-Inokulum und befestigen Sie dann einen vorbereiteten Katheter. Drücken Sie den Kolben, um Luft aus dem Katheter zu entfernen, und tupfen Sie den Katheter dann in steriles chirurgisches Gleitmittel. Positionieren Sie die Maus auf dem Rücken und bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie das Maus-Fußpolster fest zusammendrücken und das Fehlen eines Reflexes oder einer Reaktion beobachten. Lokalisieren Sie die Blase (fühlt sich an wie eine Erbse im Unterbauch) zwischen den Zeigefingern jeder Hand. Drücken Sie Urin aus, indem Sie die Finger aufeinander zu bewegen, um einen sanften Quetschdruck auf die Blase auszuüben. Führen Sie den Katheter durch die Harnröhre der Maus in die Blase ein und liefern Sie langsam 50 μL Inokulum. Warten Sie einige Sekunden und entfernen Sie dann vorsichtig den Katheter, indem Sie ihn gerade herausziehen. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und überwachen Sie, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 – 1.3.5 mit zusätzlichen Mäusen und wechseln Sie den Katheter zwischen den einzelnen Käfigen (5 Mäuse). Falls gewünscht, kann das gleiche Verfahren verwendet werden, um eine Kontrollgruppe von Mäusen mit PBS zu impfen, zum Beispiel um einen anderen Stamm von G. vaginalis auszulösen, der rUTI auslöst (über der spontanen / Hintergrundebene). 2. Überwachung der Räumung von UPEC-Bakterien (Tage 1 bis 28) HINWEIS: Das Video des Urinentnahmeverfahrens wurde zuvorveröffentlicht 44. Sammeln Sie Urin (mindestens 10 μL) von allen Mäusen durch Blasenpalpation wie beschrieben 44 bei 1 d nach der Infektion und wöchentlich für 4 Wochen (7,14 , 21 und 28 d nach der Infektion). Urin sollte innerhalb weniger Stunden nach der Sammlung kultiviert werden, um die UPEC-Infektion zu überwachen. Lagern Sie den Urin bei 4 ° C, bis er plattiert ist. Urin kann auch für die Zytologie verwendet werden (siehe Abschnitt 4). Gelegentlich, wenn die Blase stark entzündet ist, können 10 μL Urin nicht erhalten werden; in diesem Fall kann PBS bis zu 10 μL addiert werden, aber die Urinbakterientiter- und Zytologiewerte müssen entsprechend angepasst werden (z. B. wenn nur 5 μL Urin gesammelt und 5 μL PBS hinzugefügt werden, multiplizieren Sie Titer und Scores mit 2). Nehmen Sie mit einer Mehrkanalpipette serielle Verdünnungen von 1:10 auf 10-6 in sterilem PBS in einer 96-Well-Platte vor. Verwenden Sie eine P10-Mehrkanalpipette, um 10 μL aller 6 Verdünnungen aus Spalte 1 in einer vertikalen Ausrichtung am linken Rand einer LB-Platte zu erkennen, die den relevanten Antibiotika-Auswahlmarker enthält. Verwerfen Sie Tipps. Wiederholen Sie die Beschichtung mit den verbleibenden Mustern (Spalte 2, dann Spalte 3 usw.). Eine einzige Platte kann 5 Proben nebeneinander aufnehmen. Dadurch entsteht eine Platte mit einer 5 × 6 Punktmatrix, mit zunehmenden Verdünnungen von oben nach unten und steigenden Probenzahlen von links nach rechts (Abbildung 2A). Lassen Sie die Stellen auf der Tischplatte trocknen und inkubieren Sie dann über Nacht bei 37 ° C. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien an der am wenigsten verdünnten Stelle, an der sich die Kolonien unterscheiden (Abbildung 2B), und verwenden Sie diese Zahl, um die KBE / ml zu berechnen:# der Kolonien im einzelnen Urinfleck × Verdünnungsfaktor × 100 = KBE/ml Urin Plotten Sie UTI89 kanR-Urintiter mit einer Grafiksoftware (Abbildung 2C). Identifizieren Sie Mäuse, die bei 28 d kein nachweisbares UTI89-KanR im Urin haben (~65-80% der C57BL/6-Mäuse). Diese Mäuse beherbergen ruhende intrazelluläre Reservoirs und werden in der anschließenden experimentellen Phase verwendet, um die Induktion von rezidivierenden Harnwegsinfektionen zu untersuchen. Diejenigen mit Bakterien im Urin bei 28 d sind in den nachfolgenden Schritten nicht enthalten. 3. Blasenexposition gegenüber G. vaginalis Weisen Sie Mäuse Expositionsgruppen zu (Tag 29). Das Hauptziel dieses Schritts besteht darin, zu vermeiden, dass alle Mäuse mit längerer Bakteriurie in derselben Expositions-Gruppe zusammen sind, da nicht bekannt ist, ob dies die Wahrscheinlichkeit einer rUTI beeinflusst. Kategorisieren Sie die Mäuse anhand der Urin-CFU-Daten (Abbildung 2D) basierend auf dem Zeitpunkt, zu dem die UTI89-KanR-Bakteriurie nicht mehr nachweisbar war (Abbildung 2E). Randomisieren Sie die Mäuse aus jeder Kategorie entweder in die G. vaginalis – oder PBS-Impfgruppen; z.B. bekommt die Hälfte der Mäuse, die vor Tag 7 geklärt wurden, G. vaginalis und die Hälfte wird PBS bekommen; Die Hälfte der Mäuse, die zwischen den Tagen 8 und 14 geklärt haben, erhalten G. vaginalis und die Hälfte PBS usw. (wie in Abbildung 2E). Bereiten Sie G. vaginalis inoculum vor (alle Schritte werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt)HINWEIS: Die idealen Inkubationszeiten der Kultur variieren zwischen verschiedenen Stämmen von G. vaginalis, wobei einige Stämme in die stationäre Phase eintreten und sogar schneller zu sterben beginnen als andere. Dies ist besonders wichtig, da die getötete G. vaginalis (JCP8151B) nicht in der Lage war, rUTI39 auszulösen. Daher sollten die Inkubationszeiten für einen bestimmten Stamm empirisch bestimmt werden, bevor Experimente an Mäusen durchgeführt werden. Es ist nicht bekannt, ob andere/alle Stämme von G. vaginalis in diesem Modell die gleichen Effekte auslösen. Streak G. vaginalis Stamm von -80 °C Gefriertruhe auf eine NYCIII-Platte (ohne Antibiotika). Platte bei 37 °C anaerob für 24 h inkubieren. Beimpfen Sie in der anaeroben Kammer 5 ml anaerobes NYCIII-Medium mit einer 1 μL-Schleife voller Zellen (eine einzelne Kolonie ist unzureichend) aus der NYCIII-Platte und inkubieren Sie die Kultur statisch bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen für 18 h. Enthalten Sie keine Antibiotika im Wachstumsmedium. Bestimmen Sie den OD600 der Kultur mit einem Spektralphotometer. Zentrifugieren Sie ein definiertes Volumen (X) der Kultur bei 9600 × g für 1 min und aspirieren Sie die Medien. Berechnen Sie das Volumen (Y) von PBS, um das Pellet wieder zu suspendieren, um die gewünschte Inokulum-OD zu erreichen, um 108 KBE in 50 μL zu erreichen, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:X mL ×OD-Kultur = Y mL ×OD-Inokulum lösen für YY = (X ml ×OD-Kultur) /OD-InokulumHINWEIS: DasOD-Inokulum für JCP8151BSmR ist 5, aber dies muss empirisch für andere G. vaginalis-Stämme bestimmt werden. Wenn beispielsweise 3 ml einer JCP8151BSmR-Flüssigkultur über Nacht mitOD-Kultur = 2,0 gedreht werden: Y= (3 mL × 2,0) / 5,0; daher resuspendiertes Pellet in 1,2 mL PBS Resuspendiert das Bakterienpellet in PBS auf die gewünschte Konzentration. Verdünnen und plattieren Sie das Inokulum seriell (wie im obigen CFU-Beschichtungsprotokoll beschrieben), um die tatsächliche Inokulumdosis zu bestimmen, die in jedem Experiment verwendet wurde. Verlassen Sie sich nicht einfach auf die OD-Werte. Am Tag 29-31 nach der UPEC-Impfung betäubte Mäuse mit G. vaginalis oder PBS impfen, wie in Schritt 1.3 oben beschrieben. Eine PBS-Kontrollgruppe ist unerlässlich, da der Akt der Katheterisierung der Blase möglicherweise Schäden und Urothelpeeling verursachen könnte, die ein gewisses Wiederauftauchen des UPEC-Reservoirs hervorrufen könnten. PBS-geimpfte Mäuse dienen daher als Kontrolle, mit der G. vaginalis-inokulierte Mäuse verglichen werden.HINWEIS: Die endgültige UPEC-Bakteriurienbestimmung bei 28 d erfordert eine Inkubation der KFB-Platte über Nacht. Daher kann dieser Schritt frühestens 29 Tage nach der ersten UPEC-Impfung durchgeführt werden. Falls erforderlich, könnte die Exposition bereits am 31. Tag verabreicht werden. Forscher sollten zwischen den Experimenten konsistent sein. Wiederholen Sie die Impfvorbereitung, um eine zweite G. vaginalis (oder PBS-Kontrolle) Impfung zum gewünschten Zeitpunkt zu verabreichen, z. B. 12 h oder 1 Woche nach der ersten Impfung. Eine zweite Exposition ist notwendig, da eine einzige Impfung mit G. vaginalis nicht zu einer signifikanten UPEC-Emergenzführt 39. 4. Überwachung von UPEC rezidivierenden Harnwegsinfektionen Sammeln Sie Urin von Mäusen zu den gewünschten Zeitpunkten nach jeder G. vaginalis-Impfung (1, 2 und 3 d nach der Impfung empfohlen). Serielle Verdünnung und Plattenurin auf selektiven Platten (z. B. LB + Kanamycin) zur Bestimmung von UTI89kanR CFU/ml. Falls gewünscht, können Urinverdünnungen auch auf selektive Platten (z. B. NYCIII + 1 mg / ml Streptomycin) plattiert werden, um G. vaginalis CFU / ml zu bestimmen. G. vaginalis JCP8151BSmR wurde jedoch von 12 h 39 aus dem Urin der meisten Mäuse entfernt. Daher wären frühere Zeitpunkte notwendig, um G. vaginalis bei den meisten Mäusen nachzuweisen. Am experimentellen Endpunkt (z. B. 3 d nach der zweiten G. vaginalis-Impfung) werden die Mäuse nach zugelassenen Methoden (z. B. Zervixdislokation unter Isoflurananästhesie oder CO 2-Inhalation) geopfert und Blasen und Nieren für die CFU-Zählung gesammelt, wie zuvor beschrieben 44,46. 5. Urinzytologie HINWEIS: Dieses Verfahren kann zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden, zu dem eine Visualisierung der im Urin vorhandenen Zellen und/oder Bakterien gewünscht wird. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wird die Urinzytologie typischerweise bei 1 dpi (oder sogar früher) während Phase 1 durchgeführt, um eine akute UPEC-Infektion zu untersuchen, und während Phase 3, um das Vorhandensein von polymorphonukleären (PMN) Zellen in Urinen zu beurteilen, die UPEC-Emergenz aufweisen. Fügen Sie 10 μL Urin zu 90 μL PBS in einer Zytotrichterkassette mit angeschlossenem Filter und Objektträger hinzu. (Die einfachste Methode besteht darin, den Rest der 1:10-Verdünnungen aus der 96-Well-Platte zu verwenden, die für die Urinkultivierung verwendet wird; diese Proben können bis zu 24 h nach der Urinkultivierung verwendet werden, wenn sie bei 4 ° C gelagert werden). Legen Sie Kassetten in die Zytozentrifuge und drehen Sie sie bei 600-800 x g für 6 min mit hoher Beschleunigung. Entfernen Sie die Objektträger und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Am nächsten Tag Färbung mit einem Hämatologie-Färbeset (z. B. Wright’s, Giemsa, einschließlich Fixiermittel) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Analysieren Sie die Objektträger lichtmikroskopisch auf das Vorhandensein von PMNs und Epithelzellen. Falls gewünscht, können diese mit einer qualitativen Scoring-Metrik bewertet werden, die auf der Häufigkeit jedes Zelltyps basiert, der in jedem leistungsstarken Sichtfeld vorhanden ist (z. B. 0 = keine, 1 = wenige, 2 = moderat, 3 = robust). Stellen Sie sicher, dass die Person, die die Objektträger analysiert, für die experimentellen Gruppen blind ist, um mögliche Verzerrungen zu minimieren. 6. Abbildung von Blasen mittels Rasterelektronenmikroskopie HINWEIS: Dieses Verfahren kann zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden, zu dem eine Visualisierung des Urothels gewünscht wird. Wie in Abbildung 1 (violette Kästchen) gezeigt, werden UPEC-Urothel-Interaktionen am besten zwischen 6 h und 24 h nach der UPEC-Impfung während der Reservoirbildungsphase visualisiert, und das durch G. vaginalis ausgelöste Urothelpeeling wird am besten zwischen 3 h und 12 h nach der zweiten G. vaginalis-Exposition visualisiert. In-situ-Blasenfixierung Bereiten Sie das Fixiermittel unmittelbar vor der Blasenernte vor, indem Sie Glutaraldehyd (2,5% endgültig) und Paraformaldehyd (2% endgültig) in 0,15 M Natriumcacodylatpuffer mit 2 mM CaCl2 bei pH 7,4 hinzufügen. Verwenden Sie Paraformaldehyd und Glutaraldehyd aus neu geöffneten Glasampullen, da beide Fixiermittel im Laufe der Zeit in geöffneten Behältern oxidieren.VORSICHT: Glutaraldehyd ist giftig, reizend für die Atemwege und korrosiv; Paraformaldehyd ist brennbar, krebserregend, reizend und ein Fortpflanzungsgift; Natriumcacodylat ist giftig und krebserregend. Um 50 ml Fixierlösung herzustellen, fügen Sie 6,25 ml 16% Paraformaldehyd, 2 ml 50% Glutaraldehyd und 16,75 ml Reinstwasser zu 25 ml einer 0,3 m Lösung Natriumcacodylat bei pH 7,4 mit 4 mM CaCl2 hinzu. Erwärmen Sie das vorbereitete Fixiermittel vor der Verabreichung auf die Blasen. Füllen Sie die Tuberkulin-Slip-Tip-Spritze mit Fixiermittel und befestigen Sie einen Katheter am Ende, der gegenüberliegenden Spritzenmarkierungen zugewandt ist. Schneiden Sie den überschüssigen Schlauch 1-2 mm vom Ende der Nadel entfernt ab und achten Sie darauf, die Nadelspitze nicht freizulegen. Streichen Sie die Spritze, um Blasen zu entfernen, und drücken Sie den Kolben, um Luft zu entleeren, und füllen Sie den Katheter mit Fixiermittel über einem Mikrozentrifugenröhrchen, um ein Fixiermittel für die ordnungsgemäße Entsorgung zu sammeln. Betäuben und opfern Sie die Maus mit einer zugelassenen Methode (z. B. Zervixdislokation unter Narkose). Legen Sie die Maus mit gesicherten Beinen (mit Gummibändern oder Stiften) auf die Sezierfläche. Öffnen Sie den Beckenbereich der Maus mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere, um die Blase freizulegen. Schieben Sie das angrenzende Fett vorsichtig beiseite, lassen Sie die Blase jedoch an Ort und Stelle. Halten Sie die Spritze mit der dominanten Hand, wobei die Nadel nach unten zeigt und die Nadelabschrägung und die Spritzenmarkierungen von Ihnen abgewandt sind. Tauchen Sie die Katheterspitze in steriles Gleitmittel. Positionieren Sie die Katheterspitze an der Harnröhrenöffnung und halten Sie den Spritzenlauf in einem Winkel von 30-45° über dem Mauskörper weg. Üben Sie mit einer sehr kleinen Bewegung im Uhrzeigersinn mit der Spitze Druck nach unten aus und führen Sie den Katheter vorsichtig in die Harnröhre ein. Wenn die Katheterspitze in die Harnröhre eintritt, hängen Sie die Spritze in Richtung des Schwanzes der Maus an, während Sie den Katheter weiter in die Harnröhre schieben, bis sich der Spritzenlauf parallel zur Arbeitsfläche befindet. Der gesamte Katheternadelschaft (ohne Basis) sollte in die Maus eindringen und die Katheterspitze innerhalb des Blasenlumens positionieren. Langsam liefern 50-80 μL Fixiermittel, wodurch sich die Blase wie ein Ballon aufbläht. Halten Sie den Katheter an Ort und Stelle und heben Sie die Spritze leicht an, wobei Sie die Spitze nach oben neigen. Öffnen Sie mit der anderen Hand eine Hämostat und schieben Sie einen Stift unter die Katheternadel am Schnittpunkt der Harnröhre. Schließen Sie die Hämostat teilweise, bis sie nur noch Kontakt mit der Nadel aufnimmt. Schieben Sie die Katheternadel vorsichtig aus der Blase, während Sie gleichzeitig den Hämostat festklemmen und vollständig verriegeln, um den Verlust des Fixiermittels zu verhindern. Greifen Sie den Hämostat so, dass er parallel zur Arbeitsfläche verläuft und die Blase oben ruht. Heben Sie vorsichtig und vorsichtig unter der Hämostat (gegenüberliegende Seite der Blase) an, um die Blase mit dem noch befestigten Hämostat zu entfernen. Legen Sie die Blase und befestigen Sie die Hämostat in einem Falcon-Röhrchen mit erwärmtem Fixiermittel. Stellen Sie sicher, dass die Blase vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist und nicht gegen die Wände des Rohres gedrückt wird. 24 h bei 4 °C inkubieren. Blasenbearbeitung und Bildgebung mit Rasterelektronenmikroskopie (REM) Sägen Sie die Blase mit einer gereinigten, doppelseitigen Rasierklinge und machen Sie einen zweiten Schnitt tangential zur Hämostat, um die Blase freizugeben. Dies führt zu 2 halben Blasen-“Tassen”. Wenn an der Außenseite der Blase verbleibende Fettpads vorhanden sind, entfernen Sie sie vorsichtig. Spülen Sie die Blasenhälften dreimal (jeweils 10 min) in Natrium-Cacodylat-Puffer (0,15 M, pH 7,4). Färben Sie das Gewebe mit 1% Osmiumtetroxid in 0,15 M Cacodylatpuffer für 1 h bei Raumtemperatur. Osmium ist lichtempfindlich; Führen Sie daher diesen Schritt mit dem in Folie eingewickelten Färbegefäß durch, um eine dunkle Umgebung zu erhalten.ACHTUNG: Osmiumtetroxid ist giftig und korrosiv für die Haut. Machen Sie diesen Schritt im Abzug mit Handschuhen. Spülen Sie die Blasenhälften dreimal (jeweils 10 min) in Reinstwasser ab. Während dieser Schritte kann manchmal osmiziertes Öl auf der Wasseroberfläche gesehen werden. Aspirieren oder leiten Sie dies ab, um eine Kontamination während der Trocknungsschritte zu vermeiden. Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie in eine abgestufte Ethanolreihe (50, 70, 90, 100 und 100%) für jeweils 10 Minuten. Trocknen Sie das festsitzende Gewebe mit einem kritischen Punkttrockner, der 12 CO2 -Austausche mit der langsamsten Geschwindigkeit durchführt. Stellen Sie alle zusätzlichen Einstellungen auf langsam ein, mit Ausnahme des Entlüftungsschritts, der auf schnell eingestellt ist. Halbieren Sie jede Blasenhälfte erneut mit einem sauberen doppelseitigen Rasierer, um insgesamt 4 Stücke zu erzeugen, um die Krümmung der Probe für eine effizientere Beschichtung zu reduzieren, die Bildgebung im REM zu erleichtern und Gewebe freizulegen, das sich während des Trocknens gekräuselt haben könnte. Kleben Sie die Blasenstücke auf eine leitfähige Kohlenstoffklebelasche auf einem Aluminiumstumpf und malen Sie eine kleine Menge Silberkleber um den unteren Kontakt mit einem Zahnstocher, wobei Sie darauf achten, dass überschüssiger Klebstoff nicht auf die innere Oberfläche der Blase gelangt. Verwenden Sie einen Hochvakuum-Sputtercoater, um die Probenstümpfe mit 6 nm Iridium zu sputtern. Wenn die Proben weiter aufgeladen werden, stellen Sie sicher, dass ein leitender Weg zur Oberfläche mit silberner Farbe und Beschichtung mit zusätzlichen 4 nm Iridium gemalt wird. Stellen Sie die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop dar. Während die Bedingungen je nach verwendetem Mikroskop variieren können, funktionierte eine Beschleunigungsspannung von 3 KeV mit einem Strahlstrom von 200 pA und einem Arbeitsabstand von 12-13 mm bei einem Zeiss Merlin FE-SEM bei Verwendung des Everhart-Thornley (SE2) Elektronendetektors gut.

Representative Results

Nach der Impfung sind UPEC-Titer im Urin nachweisbar (Abbildung 2B). Das Versäumnis, Urinproben auf selektiven Medien zu platten, die Kanamycin enthalten, wird wahrscheinlich zu einem Überwachsen der endogenen Mausmikrobiota führen, die den Urin kontaminiert. Das Niveau der UPEC-Bakteriurie wird wahrscheinlich an Tag 1 hoch sein und kann in der ersten Woche ansteigen, bevor es zu späteren Zeitpunkten abnimmt (Abbildung 2C). Etwa 65-80% der Mäuse haben bei 28 dpi keine nachweisbare UPEC im Urin (Abbildung 2C, grüner Kreis). Diese Mäuse können in den nachfolgenden Schritten des Modells verwendet werden. Mäuse, die bakteriell bleiben (Abbildung 2C, rote Ellipse), sollten aus dem Experiment eliminiert werden. Zwei aufeinanderfolgende G. vaginalis-Expositionen im Abstand von 12 h (Abbildung 3A) oder 1 Woche (Abbildung 3B) führen zur Entstehung von UPEC aus intrazellulären Reservoirs, um rezidivierende Bakterien zu verursachen. Sowohl der Spiegel der UPEC-Bakteriurie (Mann-Whitney-Test) als auch der Anteil der Mäuse, die UPEC rUTI (Fishers exakter Test) aufweisen, sind bei Mäusen, die G. vaginalis ausgesetzt sind, im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe signifikant höher. Die zytologische Urinanalyse weist PMNs im Urin von G. vaginalis-exponierten Mäusen nach, die UPEC-Emergenz zeigten (Abbildung 3C). In dem Modell mit zwei Expositionen im Abstand von 1 Woche sind die UPEC-Titer im Blasengewebe bei G. vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS niedriger (Abbildung 3D), vermutlich aufgrund des Auftretens von UPEC aus Reservoirs und der anschließenden Clearance. Die Visualisierung von in situ fixiertem Blasengewebe durch REM zeigt große oberflächliche Umbrella-Urothelzellen, die die Blasenoberfläche bei Kontrollmäusen auskleiden, die nur PBS ausgesetzt sind (Abbildung 4A). Das urotheliale Peeling wird durch einen Verlust oberflächlicher Schirmzellen nachgewiesen, die bei Mäusen, die G . vaginalis ausgesetzt sind, kleinere darunter liegende Übergangsepithelzellen freilegen (Abbildung 4B). Früh nach der UPEC-Inokulation während der Etablierung intrazellulärer Reservoirs sind UPECs auf dem Urothel sichtbar und filamentieren aus Peelingzellen (Abbildung 4C). Abbildung 2. Überwachung der UPEC-Titer im Urin während der Phase 1 (Reservoirbildung). (A) Schematische Darstellung der Beschichtung von koloniebildenden Einheiten (KBE). (B) Repräsentatives Bild von UPEC-Titern im Urin auf LB+Kanamycin. Schwarze Kreise zeigen Urinprobenflecken an, die gezählt werden sollten, um CFU/ml zu berechnen. (C) Zeitlicher Verlauf der UPEC-Bakteriurie bei C57BL/6-Mäusen. Jede Linie stellt eine einzelne Maus dar, die die UPEC-Urintiter im Laufe der Zeit verfolgt. Die gepunktete Linie zeigt die Nachweisgrenze (1000 KBE/ml) an. Die rote Ellipse zeigt vier Mäuse (von 20) an, die die UPEC-Bakteriurie nicht auflösen konnten und daher nicht für das G. vaginalis-induzierte rUTI-Modell verwendet werden würden . Umgekehrt zeigt der grüne Kreis Mäuse an, die die UPEC-Bakteriurie auflösten und zu nachfolgenden Phasen übergingen. (D) Tabelle der Daten, die zur Erstellung von Schaubildern in Tafel C verwendet wurden. Gelbe, nachweisbare KBE; grün, keine KBE. (E) Randomisierung von Mäusen in Expositionsgruppen auf der Grundlage des Zeitpunkts, zu dem UPEC-CFU nicht mehr im Urin nachgewiesen wurden (“Tag aufgelöst”). Die Mausnummern in der linken Spalte von Bedienfeld D sind die gleichen Mausnummern, die in Bedienfeld E angegeben sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3. G. vaginalis löst UPEC rUTI aus. UPEC-Titer im Urin nach zwei aufeinanderfolgenden Harnwegsexpositionen bei PBS (Kreise) oder G. vaginalis (Gvag; Quadrate) im Abstand von 12 h (A) oder 1 Woche (B). Jedes Symbol steht für eine einzelne Maus. Die höchste CFU/ml UPEC, die von jeder Maus zwischen 1-3 d nach der zweiten Exposition nachgewiesen wurde, werden aufgetragen. Mäuse ohne nachweisbare Bakterien werden an der Nachweisgrenze (gepunktete Linie) aufgetragen. (C) Urinzytologische Analyse mit UPEC- (Pfeilspitzen) und polymorphkernigen (PMN) Zellen (Pfeile). Maßstabsleiste = 20 μm. (D) UPEC-Titer im Blasengewebe, die 3 d nach zwei aufeinanderfolgenden Harnwegsexpositionen im Abstand von 1 Woche gesammelt wurden. Jedes Symbol steht für eine andere Maus und Nullen werden an der Nachweisgrenze (gepunktete Linie) dargestellt. In A, B und D befinden sich die Kästchen im ersten und dritten Quartil, wobei der Median markiert ist und die Schnurrhaare von min bis max. Mann-Whitney U Tests * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4. REM-Analyse von in situ fixierten Blasen. Blasen wurden von Mäusen 3 h nach zwei Expositionen (im Abstand von 12 h) bei PBS (A) oder G. vaginalis (C) gesammelt. Gepunktete Linien zeigen eine einzelne Harnepithelzelle, die in G. vaginalis-exponierten Blasen kleiner ist, weil die großen oberflächlichen Zellen ein Peeling abblättern und das darunter liegende Übergangsepithel freilegen . (B) Die Blase wurde 6 h nach der ersten Inokulation mit UPEC während der Phase 1 des Modells gesammelt und zeigte ein urotheliales Peeling und extrazelluläre UPEC. (D) Beispiel für unlösliche Fetttröpfchen auf der Blasenoberfläche. Maßstabsbalken sind 20 μm in den Hauptbildern und 2 μm im Einschub. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Der erste kritische Schritt in diesem Modell, um Mäuse zu identifizieren, die UPEC-Bakterien während der primären UTI-Phase nicht beseitigt haben. Diese Mäuse müssen aus dem Experiment entfernt werden, da sie sonst die Raten der UPEC-Bakteriurie nach der Exposition von G. vaginalis verwirren würden. Nach der ersten UPEC-Impfung sollte wöchentlich Urin gesammelt werden, um die bakterielle Clearance zu überwachen. Etwa 65-80% der C57BL/6-Mäuse werden eine UTI89-kanR-Infektion innerhalb von 4 Wochen beseitigen. Andere Inzuchtmäusestämme haben unterschiedliche Neigungen zur UPEC-Clearance42,43 und zur Reservoirbildung und sind daher möglicherweise nicht für dieses Modell geeignet. Der zweite kritische Punkt ist, dass empirische Studien festgestellt haben, dass zwei aufeinanderfolgende Impfungen von G. vaginalis (entweder 12 h oder 1 Woche auseinander) notwendig sind, um eine signifikante Reservoiremergenz über dem spontanen Hintergrundauftreten auszulösen, das bei Kontrollmäusen auftritt, die nur PBS ausgesetzt sind. Andere Zeiträume zwischen den beiden sequentiellen Expositionen wurden nicht getestet, könnten aber zu ähnlichen Ergebnissen führen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine Reduktion der UPEC-Blasentiter nur in dem Modell beobachtet wurde, in dem G. vaginalis-Expositionen 1 Wochen auseinander39 verabreicht wurden. Während mehr als zwei Expositionen verabreicht werden können, deuten empirische Beweise darauf hin, dass eine wiederholte Katheterisierung allein die Emergenz erhöht, was die Interpretation der Ergebnisse verwirren kann oder eine größere Anzahl von Tieren erfordert, um Unterschiede zwischen Expositionsgruppen und Kontrollen zu unterscheiden. Schließlich hat die In-situ-Blasenfixierungsmethode mehrere kritische Schritte. Etwas Geschick ist erforderlich, um sicherzustellen, dass das Fixiermittel in den geklemmten Blasen verbleibt. Entleerte Blasen werden von REM schwieriger abzubilden sein. Es ist auch wichtig, sehr sanft zu sein, wenn das Fixiermittel in die Blase geimpft wird, da das Abkratzen des Urothels mit dem fixativ enthaltenden Katheter ein Urothelpeeling unabhängig von dem, was durch G. vaginalis ausgelöst wird, induzieren kann. Alle im fixativen Cocktail genannten Konzentrationen sind Endkonzentrationen. Unsachgemäße Verhältnisse von diesen können zu unzureichender Fixierung und Schwellung oder Schrumpfung der Zellen führen. Fixiermittel sollten auf physiologische Temperaturen erwärmt werden, um Temperaturschocks in Zellen und Geweben zu vermeiden. Die Erwärmung bietet auch eine leichte Verbesserung der Diffusionsrate von Fixiermitteln durch Plasmamembranen. Während die Osmiumfärbung bei Proben, die für die REM-Analyse vorbereitet wurden, oft weggelassen werden kann, ist es ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll, um Lipide zu stabilisieren und das Reißen von Zellmembranen während der kritischen Punkttrocknung zu verhindern.

Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um andere UPEC- und/oder G. vaginalis-Stämme auf ihre Fähigkeit zu testen, Reservoirs zu bilden bzw. ihre Entstehung auszulösen. Andere experimentelle Faktoren können ebenfalls hinzugefügt werden, wie die Exposition gegenüber anderen vaginalen Bakterien (z. B. Lactobacillus crispatus PVAS100) oder hitzeabgetötetes G. vaginalis, von denen keiner in diesem Modell39 eine Pathologie zeigt. Bei der Auswahl anderer zu testender Bakterienstämme ist es wichtig, ein konsistentes Wachstum nachzuweisen, so dass in allen Experimenten eine Standard-Inokulumkonzentration verwendet werden kann. Das Wachstum von JCP8151BSmR wurde in einer anaeroben Kammer optimiert. Dieser Stamm könnte wahrscheinlich in einem anaeroben GasPak-System kultiviert werden, aber dies würde eine Optimierung erfordern, um ein robustes Bakterienwachstum zu gewährleisten. Schließlich kann es möglich sein, das Timing bestimmter Schritte im Modell zu ändern. Zum Beispiel kann Urin zu früheren Zeitpunkten während der UPEC-Reservoirbildungsphase gesammelt werden, um die Reaktionen von CFU oder Wirt zu überwachen. Eine nachteilige Wirkung der Entnahme von Urinproben zu frühen Zeitpunkten (3, 6, 12 hpi) auf das Fortschreiten der Infektion oder die Etablierung von Reservoirs wurde in diesem Modell nicht beobachtet. Es wurde berichtet, dass das Auftreten von UPEC-Reservoirs nach zwei JCP8151BSmR-Dosen mit 12 h oder 1 Woche auftritt, aber andere Zeitintervalle wurden noch nicht getestet. Es kann auch möglich sein, die Gesamtdauer für das Modell zu reduzieren, indem die UPEC-Reservoirbildungsphase auf 2 Wochen (statt 4 Wochen) reduziert wird, da viele der Mäuse zu diesem Zeitpunkt Bakterien beseitigen. Frühere Studien, in denen die UPEC-Entstehung nach Blasenexposition gegenüber chemischen Peelings untersucht wurde, verwendeten eine 1- oder 2-wöchige UPEC-Reservoirbildungsphase17,18. Die Verkürzung der Zeit für die UPEC-Bakteriurie-Clearance kann jedoch auf Kosten der Notwendigkeit gehen, mehr Tiere aus dem Versuch zu keulen. Schließlich kann die REM-Analyse der Blase zu zusätzlichen Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Dauer der Wirkung von G. vaginalis auf das Urothel zu beobachten.

In Bezug auf die Fehlerbehebung gibt es einige wichtige Überlegungen speziell in Bezug auf die Blasen-SEM-Analyse. Abhängig vom verwendeten Maushintergrund und der Menge der vorhandenen Entzündung weisen einige Blasen sehr dünne Wände auf. Diese Blasen neigen dazu, sich während der kritischen Punkttrocknung stärker zu kräuseln und können zu einer kaurimuschelartigen Form führen. In diesem Fall ist die beste Methode, die schalenförmige Blase entlang der gekräuselten Grenzfläche in zwei Hälften zu schneiden und dann ein zweites Mal den Großteil des überhängenden Gewebes zu entfernen. Das Schneiden funktioniert am besten mit einer PTFE-beschichteten zweischneidigen Rasierklinge. Überschüssiges Fett kann manchmal während der Osmium-Färbeschritte auflösen. Dies kann zu unerwünschten unlöslichen Fetttröpfchen führen, die sich während der Spül- und Dehydratisierungsschritte möglicherweise nicht abwaschen und sich während der anschließenden Trocknung auf der Blasenoberfläche absetzen können. Diese Tröpfchen können entweder als kleine Kugeln oder als scheibenartige Strukturen auftreten, die über die Probe verstreut sind (Abbildung 4D). Dies kann gemildert werden, indem sichergestellt wird, dass so viel Fettgewebe wie möglich aus der Nähe der Blase entfernt wird. Platin kann durch Iridiumbeschichtung ersetzt werden, aber Dicken sollten auf ein Minimum beschränkt werden, um die Maskierung feiner Strukturdetails zu reduzieren. Die Verwendung eines rotierenden Tisches während der Beschichtung wird dringend empfohlen.

Eine Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass es eine große Anzahl von Mäusen benötigt. Nur 65-80% der C57BL/6-Mäuse werden ihre UPEC-Bakteriurie beseitigen und für eine nachfolgende G. vaginalis– oder PBS-Impfung geeignet sein (siehe Abbildung 2C). Um 10-12 Mäuse pro Gruppe (G. vaginalis-Impfung vs. PBS) zu erhalten, sollten ~ 30 Mäuse zunächst mit UPEC infiziert werden. Darüber hinaus sind wahrscheinlich mehrere Experimente erforderlich, um die biologischen Replikate zu erreichen, die zum Nachweis der statistischen Signifikanz erforderlich sind. Wenn die Expositionen im Abstand von 1 Woche verabreicht wurden, trat bei 14 % der Mäuse, die PBS ausgesetzt waren, ein UPEC-Auftreten auf (Abbildung 3B). Daher erfordert der Nachweis eines signifikanten Anstiegs des UPEC rUTI bei G. vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS-Kontrollen (mit einer Leistung von 0,8; alpha=0,05 [einseitig]) das Testen einer kumulativen Gesamtzahl von mindestens 40 Mäusen für jede Expositions-Gruppe. Eine weitere Überlegung ist, dass diese Experimente teuer und arbeitsintensiv sind. Mäuse müssen wöchentlich auf UPEC-Clearance überwacht werden und der experimentelle Zeitverlauf beträgt 4-5 Wochen, je nachdem, ob G. vaginalis zweimal in einem Zeitrahmen von 12 Stunden oder zweimal im Abstand von 1 Woche verabreicht wird. SEM ist arbeitsintensiv und kann je nach Verfügbarkeit des Mikroskops und Servicegebühren teuer sein. Die Vorbereitung der gesamten Blase für SEM bietet reichlich Material für die Analyse, aber der Nachteil ist, dass die Analyse jeder Blase zeitaufwendig sein kann. Daher ist es wahrscheinlich, dass nur eine begrenzte Anzahl von Blasen von REM analysiert werden kann, verglichen mit den höheren Tierzahlen, die für Urin- und Gewebetiter verwendet werden. Darüber hinaus erfordert das Erhalten hochwertiger Bilder der gekrümmten Oberflächen der Blasen-“Tassen” Geschick aufgrund von Schatten, die die Sicht beeinträchtigen können. Obwohl Blasen-REM ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung des Urothel-Peelings ist, ist diese Methode weitgehend qualitativ. Da die Probe in runder Form fixiert ist und aufgrund der Verwendung von Glutaraldehyd im Fixiermittel ein Screening auf fluoreszierend exprimierende Bakterien mittels Lichtmikroskopie nicht möglich ist. Immunfärbende und chemische Farbstoffe sind mit diesem Prozess aufgrund der Verwendung von Glutaraldehyd, das die meisten Antigene und Osmium vernetzt und die Antigenstellen maskiert und das Gewebe verdunkelt, nicht kompatibel. Allerdings ist die REM-Technik nützlich für Parameter, die quantitativ ohne den Einsatz zusätzlicher Sonden ausgewertet werden können, wie z.B. die Zellgröße48,49.

Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, die über die zuvor beschriebenen Methoden hinausgehen. Es ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen von UPEC rUTI, die durch das Auftauchen aus Blasenreservoirs verursacht werden, im Gegensatz zur Wiedereinführung aus einer externen Quelle in die Blase. Andere Modelle von rUTI aufgrund des Auftretens aus Blasenreservoirs verwenden chemische Mittel (Protaminsulfat oder Chitosan), um ein Urothelpeeling zu verursachen17,18, das bei Frauen keine Auslöser von rUTI wäre. G. vaginalis ist ein weit verbreitetes urogenitales Bakterium, das im Urin nachgewiesen wurde, der direkt aus der Blase durch Katheterisierung oder suprapubische Aspiration bei einigen Frauen23,26 gesammelt wurde. Diese Tatsache, gepaart mit der bekannten Assoziation zwischen BV (bei der G. vaginalis in der Vagina überwächst) und UTI, deutet darauf hin, dass G. vaginalis ein klinisch plausibler Auslöser von rUTI ist. Schließlich bewahrt die In-situ-Blasenfixierungsmethode die Blasenultrastruktur und begrenzt Schäden, wodurch sichergestellt wird, dass sich die Blasenschichten nicht voneinander trennen. Frühere Methoden zur Visualisierung des Urothels haben den Benutzer traditionell dazu gebracht, die Blase aseptisch zu ernten, zu halbieren, zu dehnen und auf eine Dissektionsschale zu stecken, bevor er die gestreckte Blase in Fixiermittel48 eintaucht. Diese Methode führt zu einer sehr flachen Probe, gewährleistet jedoch keine gleichmäßige oder natürliche Dehnung des Gewebes und kann zu Bereichen führen, die über- und unterdehnt sind (was zu stark faltigem Gewebe führt) und eine Trennung der Blasenschicht verursachen können. Darüber hinaus können diese physikalischen Manipulationen der Blase, um das Gewebe zu dehnen und zu fixieren, Schäden verursachen, einschließlich Urothelpeeling. Eine andere Methode besteht darin, intakte Blasen in Fixiermittel zu tauchen, bevor sie in Paraffin eingebettet werden und dünne Abschnitte mit einem Mikrotom aufnehmen. Dünne Schnitte sind für immunhistochemische Experimente von unschätzbarem Wert, um die Lokalisation von Bakterien und Wirtsproteinen zu untersuchen, aber ein dünner Schnitt erlaubt keine Visualisierung der Urotheloberfläche. Mit dieser REM-Methode kann die Oberfläche der gesamten Blase auf einmal untersucht werden.

Wie beschrieben, umfassen zukünftige Anwendungen dieses Modells das Testen anderer UPEC-Stämme, um festzustellen, ob sie intrazelluläre Reservoirs bilden, und das Testen anderer G. vaginalis-Stämme , um zu beurteilen, ob sie ein Peeling und UPEC-Emergenz auslösen, um rUTI zu verursachen. Andere Mausstämme jenseits von C57BL/6-Mäusen können ebenfalls getestet werden, obwohl Mäuse mit einer hohen Neigung zur Entwicklung einer chronischen Blasenentzündung (wie Mäuse auf dem C3H-Hintergrund) nicht empfohlen werden, da zu viele Mäuse aus dem Experiment aussortiert werden müssten. Ein weiterer Vorteil von C57BL/6-Mäusen ist, dass viele genetische Knockout-Stämme im Handel erhältlich sind. Solche Stämme bieten die Möglichkeit, die Wirtsfaktoren zu hinterfragen, die an der Reservoirbildung und/oder -entstehung beteiligt sind.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Lynne Foster für die technische Unterstützung bei Infektionsexperimenten, James Fitzpatrick vom Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) für den Zugang zum SEM, Scott Hultgren für den UTI89kanR UPEC-Stamm und David Hunstad für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE – 1143954), vom Center for Women’s Infectious Disease Research an der Washington University School of Medicine (Pilot Research Award an NMG), von der American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) und #14POST20020011 (NMG) und von den National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) und NIDDK unterstützt: R21 DK092586 (ALLE), P50 DK064540-11 (SJH, Projekt II PI:ALL) und K01 DK110225-01A1 (NMG). Einige der Tierversuche wurden in einer Einrichtung durchgeführt, die durch den NCRR-Zuschuss C06 RR015502 unterstützt wurde. Das Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; wo SEM durchgeführt wurde) und MSJ wurden von der Washington University School of Medicine, dem Children’s Discovery Institute der Washington University und dem St. Louis Children’s Hospital (CDI-CORE-2015-505), der Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) und dem National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Materials

30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media
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Riferimenti

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O’Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).
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