Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Le Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) a approuvé toutes les infections et procédures de souris dans le cadre du protocole numéro 20170081, qui a expiré le 06/09/2020, et le 20-0031, qui expire le 18/03/2023. Les soins globaux aux animaux étaient conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches du Canada et au Guide de ressources en soins aux animaux de l’USDA. Les procédures d’euthanasie sont conformes aux Lignes directrices de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux : édition 2020. Graphique 1. Schéma du modèle de souris. La chronologie est mise en évidence pour refléter les phases ou les procédures du modèle décrit dans le protocole. Phase 1 (orange) : Établissement de réservoirs UPEC intracellulaires. Les souris sont inoculées par voie transurétrale avec UPEC et des échantillons d’urine sont prélevés et surveillés pour l’élimination de la bactériurie. Seules les souris qui nettoient la bactériurie passent aux phases suivantes. Phase 2 (vert) : Exposition de la vessie à G. vaginalis. Les souris sont inoculées par voie transurétrale avec G. vaginalis deux fois. La durée entre les deux expositions séquentielles est de 12 h (panneau supérieur) ou de 1 semaine (semaine; panneau inférieur), selon l’analyse en aval souhaitée. Phase 3 (jaune) : UPEC rUTI. L’urine est recueillie quotidiennement après l’exposition à G. vaginalis et surveillée pour la bactériurie UPEC. De plus, les vessies et les reins peuvent être prélevés au critère d’évaluation expérimental pour mesurer les titres tissulaires UPEC. Dans le modèle d’exposition à 1 semaine, l’émergence induite par G. vaginalis de l’UPEC à partir des réservoirs intracellulaires et la clairance ultérieure des voies urinaires se reflètent également dans une diminution des titres de tissu de la vessie UPEC (par rapport aux souris exposées au PBS, voir la figure 3D). Cette diminution des titres de la vessie n’était pas évidente dans le modèle d’exposition de 12 heures, probablement parce qu’il faut plus de temps pour que suffisamment d’émergence et de clairance du réservoir se produisent pour réduire considérablement les titres tissulaires. Procédure A: La cytologie urinaire est généralement effectuée à 1 dpi (ou même plus tôt) pendant la phase 1 pour examiner l’infection aiguë à l’UPEC et pendant la phase 3 pour évaluer la teneur en PMN de l’urine, qui est en corrélation avec l’émergence de l’UPEC. Les échantillons d’urine prélevés à d’autres moments peuvent être analysés de la même manière. Procédure B : La microscopie électronique à balayage de la vessie (MEB) pour examiner l’exfoliation urothéliale est généralement réalisée dans le modèle de 12 h à 3 h après la deuxième exposition à G. vaginalis (15 h après l’administration de la première exposition au temps 0). D’autres points temporels peuvent également être évalués, tels que 6 à 24 heures après l’inoculation UPEC, comme indiqué dans la phase 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 1. Établir des réservoirs intracellulaires au repos UPEC chez la souris Préparez les cathéters urinaires (voir 44,45,46,47 pour les vidéos de cette étape). Filer 30 Aiguilles de calibre avec une longueur de tube PE10 s’étendant de la base de l’aiguille à plusieurs mm au-delà de la pointe de l’aiguille. Veillez à ne pas percer le tube avec la pointe de l’aiguille. Alternativement, utilisez des canules intraveineuses pédiatriques46. Placez les cathéters préparés dans une boîte de Pétri et stérilisez à la lumière UV pendant au moins 30 min. Remplacez le couvercle de la boîte de Pétri et fixez-le pour le stockage jusqu’à ce que nécessaire. Préparer l’inoculum UPEC (Jour -3 à 0) Jour -3: Streak UTI89kanR à partir de -80 °C stock de congélation sur une plaque de gélose Luria-Bertani (LB). Incuber la plaque à 37 °C pendant 18-24 h.REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’ajouter de la kanamycine au milieu de croissance de l’inoculum car la résistance à la kanamycine est intégrée de manière stable dans UTI89kanR. Jour -2: Inoculer 20 mL de bouillon LB dans une fiole stérile de 125 mL avec une seule colonie d’UTI89kanR. N’utilisez pas une fiole plus petite, car cette méthode de culture est importante pour induire l’expression du pilus UPEC de type 1 nécessaire à l’adhésion de la vessie. Incuber statiquement (sans agitation) à 37 °C pendant 18-24 h. N’ajoutez pas d’antibiotiques au milieu de croissance. N’utilisez que des colonies fraîches sur des plaques LB (âgées de 18 à 24 h) pour commencer les cultures liquides. Jour -1 : Sous-culture UTI89kanR en retirant 20 μL de culture (faire tourbillonner doucement la fiole pour remettre en suspension les bactéries décantées) et en ajoutant à 20 mL de bouillon LB frais dans une fiole stérile de 125 mL. Incuber comme à l’étape 2, sauf pour une durée ferme de 18 h. N’ajoutez pas d’antibiotiques au milieu de croissance. Jour 0: Transférer la culture entière dans un tube de 50 mL et tourner à 3200 × g dans une centrifugeuse de table pendant 10 min pour granuler les bactéries. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans 10 mL de PBS. Ajouter 100 μL de la suspension bactérienne concentrée de l’étape 4 à 900 μL de PBS dans une cuvette et déterminer la densité optique à 600 nm (OD600) à l’aide d’un spectrophotomètre qui a été occulté avec PBS. Multiplier la valeur du spectrophotomètre par 10 (pour tenir compte de la dilution) pour déterminer l’OD600 de la suspension (suspension OD). Pour atteindre la concentration d’inoculum souhaitée de 1 x 107 UFC dans 50 μL, diluer (ou concentrer) la suspension UTI89kanR à l’aide de l’équation suivante, dans laquellel’inoculum OD souhaité est de 0,35 (la valeur peut varier pour d’autres souches UPEC) et Y est le volume d’inoculum requis (100 μL par souris pour permettre un supplément pour éliminer les bulles et remplir les cathéters):X mL xsuspension OD = Y mL xINOCULUM ODPar exemple, si la valeur desuspension OD est de 4,7 et que 5 mL d’inoculum sont requis :X mL × 4,7 = 5 × 0,35X = (5 × 0,35) / 4,7X = 0,372 mLPar conséquent, ajouter 372 μL de suspension bactérienne pour obtenir 5 mL (volume final) Utilisez une pipette multicanal pour effectuer des dilutions en série de 1:10 de l’inoculum à 10-6 dans un PBS stérile dans une plaque de 96 puits. Repérez cinq répliques de 10 μL des 6 dilutions sur une plaque LB et LB+kan, laissez sécher les taches et incubez à 37 °C pendant la nuit. La plaque LB sans antibiotiques est utilisée pour s’assurer que l’inoculum n’a pas été contaminé par un autre organisme (qui apparaîtrait comme une morphologie de colonie supplémentaire non présente sur la plaque de sélection des antibiotiques kan). Les deux types de plaques devraient donner le même résultat.REMARQUE: Les plaques doivent être laissées sécher sur la paillasse pendant un jour avant utilisation afin qu’elles absorbent le liquide plaqué sans que les taches ne fusionnent. Compter le nombre total de colonies dans tous les points de la dilution avec des colonies distinguables et utiliser la valeur pour calculer la dose réelle d’inoculum utilisée dans chaque expérience. Ne vous fiez pas simplement aux valeurs OD600 . Inoculer UTI89kanR dans les vessies de souris femelles anesthésiées (Jour 0)REMARQUE: Les enregistrements vidéo de cette procédure ont été publiés précédemment44,46. Reportez-vous à ces documents pour une description plus complète. Voir rubrique 5 de ce protocole pour plus de détails sur le cathétérisme de souris. Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane selon les méthodes approuvées par l’IACUC. En attendant que les souris soient anesthésiées, remplissez la seringue à tuberculine avec de l’inoculum UTI89kanR , puis fixez un cathéter préparé. Appuyez sur le piston pour vider l’air du cathéter, puis tamponnez le cathéter dans un lubrifiant chirurgical stérile. Positionnez la souris sur le dos et confirmez l’anesthésie en serrant fermement le repose-pieds de la souris et en observant l’absence de réflexe ou de réponse. Localisez la vessie (ressemble à un pois dans le bas-ventre) entre les index de chaque main. Exprimez l’urine en déplaçant les doigts les uns vers les autres pour appliquer une légère pression pressante sur la vessie. Insérez le cathéter à travers l’urètre de la souris dans la vessie et délivrez lentement 50 μL d’inoculum. Attendez quelques secondes, puis retirez doucement le cathéter en tirant droit. Remettez la souris dans sa cage et surveillez jusqu’à ce qu’elle se rétablisse de l’anesthésie. Répétez les étapes 1.3.1 – 1.3.5 avec des souris supplémentaires, en changeant le cathéter entre chaque cage (5 souris). Si vous le souhaitez, la même procédure peut être utilisée pour inoculer un groupe témoin de souris atteintes de PBS, par exemple pour montrer qu’une autre souche de G. vaginalis provoque une rUTI (au-dessus du niveau spontané / de fond). 2. Surveillance de l’élimination de la bactériurie UPEC (jours 1 à 28) REMARQUE: La vidéo de la procédure de collecte d’urine a été publiée précédemment44. Prélever l’urine (minimum 10 μL) de toutes les souris par palpation de la vessie comme décrit44 à 1 d après l’infection et chaque semaine pendant 4 semaines (7, 14, 21 et 28 d après l’infection). L’urine doit être cultivée dans les quelques heures suivant la collecte afin de surveiller l’infection à l’UPEC. Conserver l’urine à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit plaquée. L’urine peut également être utilisée pour la cytologie (voir rubrique 4). Parfois, si la vessie est très enflammée, 10 μL d’urine ne peuvent pas être obtenus; dans ce cas, le PBS peut être ajouté jusqu’à 10 μL, mais le titre bactérien urinaire et les scores de cytologie doivent être ajustés en conséquence (par exemple, si seulement 5 μL d’urine sont collectés et 5 μL de PBS sont ajoutés, multipliez les titres et les scores par 2). Avec une pipette multicanal, effectuez des dilutions en série de 1:10 à 10-6 dans un PBS stérile dans une plaque de 96 puits. Utilisez une pipette multicanal P10 pour repérer 10 μL des 6 dilutions de la colonne 1 dans une orientation verticale sur le bord gauche d’une plaque LB contenant le marqueur de sélection antibiotique approprié. Jetez les embouts. Répétez le placage avec les échantillons restants (colonne 2, puis colonne 3, etc.). Une seule plaque peut accueillir 5 échantillons côte à côte. Cela produit une plaque avec une matrice de 5 × 6 points, avec des dilutions croissantes de haut en bas et une augmentation du nombre d’échantillons de gauche à droite (Figure 2A). Laissez sécher les taches sur la paillasse, puis incubez à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, comptez le nombre de colonies à l’endroit le moins dilué où les colonies sont distinctes (figure 2B) et utilisez ce nombre pour calculer l’UFC/mL :Nombre de colonies dans une seule tache d’urine × facteur de dilution × 100 = UFC/mL d’urine Tracez les titres d’urine UTI89kanR à l’aide d’un logiciel de représentation graphique (Figure 2C). Identifier les souris qui n’ont pas d’infection urinaire détectabledans l’urine à 28 d (~ 65-80% des souris C57BL / 6). Ces souris abritent des réservoirs intracellulaires quiescents et sont utilisées dans la phase expérimentale ultérieure pour examiner l’induction d’infections urinaires récurrentes. Ceux qui ont des bactéries dans l’urine à 28 d ne sont pas inclus dans les étapes suivantes. 3. Exposition de la vessie à G. vaginalis Assignez des souris à des groupes d’exposition (Jour 29). L’objectif principal de cette étape est d’éviter d’avoir toutes les souris avec une bactériurie plus prolongée ensemble dans le même groupe d’exposition, car on ne sait pas si cela affecte la probabilité d’infection urinaire. À l’aide des données sur l’UFC urinaire (figure 2D), catégorisez les souris en fonction du moment où la bactériurie UTI89kanR n’était plus détectable (figure 2E). Randomiser les souris de chaque catégorie dans les groupes d’inoculation G. vaginalis ou PBS; Par exemple, la moitié des souris qui ont dégagé avant le jour 7 obtiennent G. vaginalis et la moitié aura PBS; la moitié des souris qui ont éliminé entre les jours 8 et 14 auront G. vaginalis et la moitié aura le PBS, etc. (comme dans la figure 2E). Préparer l’inoculum de G. vaginalis (toutes les étapes effectuées dans une chambre anaérobie)REMARQUE: Les temps d’incubation de culture idéaux varient selon les différentes souches de G. vaginalis, certaines souches entrant dans la phase stationnaire et commençant même à mourir plus rapidement que d’autres. Ceci est particulièrement important étant donné que G. vaginalis tué (JCP8151B) était incapable de déclencher rUTI39. Ainsi, les temps d’incubation doivent être déterminés empiriquement pour une souche donnée avant d’effectuer des expériences chez la souris. On ne sait pas si d’autres ou toutes les souches de G. vaginalis déclencheront les mêmes effets dans ce modèle. Souche Streak G. vaginalis à partir de -80 °C de stock de congélation sur une plaque NYCIII (sans antibiotiques). Plaque incubée à 37 °C anaérobie pendant 24 h. Dans la chambre anaérobie, inoculer 5 mL de milieux anaérobies NYCIII avec une boucle de cellules de 1 μL (une seule colonie est insuffisante) à partir de la plaque NYCIII et incuber la culture statiquement à 37 °C dans des conditions anaérobies pendant 18 h. N’incluez pas d’antibiotiques dans le milieu de croissance. Déterminer la DO600 de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre. Centrifuger un volume défini (X) de culture à 9600 × g pendant 1 min et aspirer le milieu. Calculer le volume (Y) de PBS pour suspendre à nouveau la pastille afin d’obtenir l’inoculum OD souhaité pour atteindre 108 UFC dans 50 μL en utilisant l’équation suivante:X mL ×od culture = Y mL × ODinoculum solve pour YY = (X ml ×culture OD) /INOCULUM ODREMARQUE:L’inoculum OD pour JCP8151BSmR est de 5, mais cela doit être déterminé empiriquement pour d’autres souches de G. vaginalis . Par exemple, si vous filez 3 mL d’une culture liquide JCP8151BSmR pendant la nuit avecculture OD = 2,0: Y = (3 mL × 2,0) / 5,0; par conséquent, remettre en suspension des granulés dans 1,2 mL de PBS Remettre en suspension la pastille bactérienne dans le PBS à la concentration souhaitée. Diluer et plaquer en série l’inoculum (comme décrit dans le protocole de placage CFU ci-dessus) pour déterminer la dose réelle d’inoculum qui a été utilisée dans chaque expérience. Ne vous fiez pas simplement aux valeurs OD. Les jours 29 à 31 suivant l’inoculation d’UPEC, inoculent des souris anesthésiées avec G. vaginalis ou PBS comme décrit à l’étape 1.3 ci-dessus. Un groupe témoin PBS est essentiel, car l’acte de cathétérisme de la vessie pourrait éventuellement induire des dommages et une exfoliation urothéliale qui pourraient provoquer un certain degré de réémergence du réservoir UPEC. Les souris inoculées au PBS servent donc de témoin auquel les souris inoculées par G. vaginalis sont comparées.REMARQUE: La détermination finale de la bactériurie UPEC à 28 d nécessite une incubation de nuit de la plaque UFC. Par conséquent, la première étape pouvant être effectuée est de 29 jours après l’inoculation initiale de l’UPEC. Si nécessaire, l’exposition pourrait être donnée jusqu’au jour 31. Les chercheurs doivent être cohérents entre les expériences. Répétez la préparation de l’inoculum pour administrer une deuxième inoculation de G. vaginalis (ou contrôle PBS) au moment souhaité, par exemple 12 h ou 1 semaine après la première inoculation. Une deuxième exposition est nécessaire parce qu’une seule inoculation avec G. vaginalis n’entraîne pas d’émergence significative d’UPEC39. 4. Surveillance des infections urinaires récurrentes upec Recueillir l’urine des souris aux moments souhaités après chaque inoculation de G. vaginalis (1, 2 et 3 d après l’inoculation recommandés). Diluer en série et plaquer l’urine sur des plaques sélectives (p. ex., LB+kanamycine) pour déterminer l’UFC/mL UTI89kanR . Si vous le souhaitez, les dilutions urinaires peuvent également être plaquées sur des plaques sélectives (par exemple, NYCIII + 1 mg / mL de streptomycine) pour déterminer G. vaginalis UFC / mL. Cependant, G. vaginalis JCP8151BSmR a été éliminé de l’urine de la plupart des souris à 12 h 39. Par conséquent, des points temporels plus précoces seraient nécessaires pour détecter G. vaginalis chez la plupart des souris. Au critère d’évaluation expérimental (p. ex., 3 j après la deuxième inoculation de G. vaginalis), sacrifier les souris selon des méthodes approuvées (p. ex., luxation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane ou inhalation de CO2) et recueillir les vessies et les reins pour le dénombrement de l’UFC, comme décrit précédemment 44,46. 5. Cytologie urinaire REMARQUE: Cette procédure peut être effectuée à n’importe quel moment où la visualisation des cellules et / ou des bactéries présentes dans l’urine est souhaitée. Comme l’indique la figure 1, la cytologie urinaire est généralement effectuée à 1 dpi (ou même plus tôt) pendant la phase 1 pour examiner l’infection aiguë par l’ECPU et pendant la phase 3 pour évaluer la présence de cellules polymorphonucléaires (PMN) dans les urines qui présentent l’émergence de l’ECUP. Ajouter 10 μL d’urine à 90 μL de PBS dans une cassette de cytofunnel avec filtre attaché et glissière. (La méthode la plus simple consiste à utiliser le reste des dilutions 1:10 de la plaque de 96 puits utilisée pour la culture de l’urine; ces échantillons peuvent être utilisés jusqu’à 24 h après la culture de l’urine s’ils sont conservés à 4 °C). Placez les cassettes dans une cytocentrifugation et tournez à 600-800 x g pendant 6 min avec une forte accélération. Retirer les lames et laisser sécher pendant la nuit. Le lendemain, tacher avec un kit de coloration hématologique (par exemple, Wright’s, Giemsa, y compris fixateur) selon le protocole du fabricant. Analyser les lames par microscopie optique pour détecter la présence de PMN et de cellules épithéliales. Si vous le souhaitez, ceux-ci peuvent être notés à l’aide d’une mesure de notation qualitative basée sur l’abondance de chaque type de cellule présent dans chaque champ de vision de haute puissance (par exemple, 0 = aucun, 1 = peu, 2 = modéré, 3 = robuste). Assurez-vous que la personne qui analyse les diapositives est aveuglée par les groupes expérimentaux afin de minimiser les biais potentiels. 6. Imagerie des vessies par microscopie électronique à balayage REMARQUE: Cette procédure peut être effectuée à n’importe quel moment où la visualisation de l’urothélium est souhaitée. Comme l’indique la figure 1 (boîtes violettes), les interactions UPEC-urothéliales sont mieux visualisées entre 6 h et 24 h après l’inoculation UPEC pendant la phase de formation du réservoir, et l’exfoliation urothéliale déclenchée par G. vaginalis est mieux visualisée entre 3 h et 12 h après la deuxième exposition à G. vaginalis . Fixation in situ de la vessie Préparer le fixateur immédiatement avant la récolte de la vessie en ajoutant du glutaraldéhyde (2,5 % final) et du paraformaldéhyde (2 % final) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,15 M avec 2 mM deCaCl2 à pH 7,4. Utilisez le paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde provenant d’ampoules en verre nouvellement ouvertes, car les deux fixateurs s’oxydent au fil du temps dans des récipients ouverts.ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique, irritant respiratoire et corrosif; le paraformaldéhyde est inflammable, cancérigène, irritant et toxique pour la reproduction; le cacodylate de sodium est toxique et cancérigène. Pour obtenir 50 mL de solution fixative, ajouter 6,25 mL de paraformaldéhyde à 16 %, 2 mL de glutaraldéhyde à 50 % et 16,75 mL d’eau ultrapure à 25 mL d’une solution de cacodylate de sodium à 0,3 M à pH 7,4 avec 4 mM deCaCl2. Réchauffer le fixateur préparé à 37 °C avant de l’administrer à la vessie. Remplissez la seringue à pointe glissante de tuberculine avec un fixateur et fixez un cathéter à l’extrémité, en biseau orienté vers les marques opposées de la seringue. Coupez l’excès de tuyau à 1-2 mm de l’extrémité de l’aiguille, en prenant soin de ne pas exposer la pointe de l’aiguille. Faites glisser la seringue pour enlever les bulles et poussez le piston pour vider l’air et remplissez le cathéter de fixateur sur un tube de microcentrifugation pour recueillir tout fixateur pour une élimination appropriée. Anesthésier et sacrifier la souris à l’aide d’une méthode approuvée (p. ex. luxation cervicale sous anesthésie). Placez la souris sur la surface de dissection avec les jambes attachées (avec des élastiques ou des épingles). Ouvrez la région pelvienne de la souris avec une pince et une paire de ciseaux chirurgicaux pour exposer la vessie. Écartez soigneusement la graisse adjacente, mais laissez la vessie en place. Tenez la seringue avec la main dominante avec l’aiguille pointant vers le bas et le biseau de l’aiguille et les marques de seringue face à vous. Trempez l’extrémité du cathéter dans un lubrifiant stérile. Placez l’extrémité du cathéter à l’ouverture urétrale, en tenant le barillet de la seringue à un angle de 30 à 45 ° au-dessus du corps de la souris. Appliquez une pression vers le bas en utilisant un très petit mouvement dans le sens des aiguilles d’une montre avec la pointe et insérez doucement le cathéter dans l’urètre. Lorsque la pointe du cathéter pénètre dans l’urètre, articulez la seringue vers la queue de la souris tout en continuant à faire glisser le cathéter plus loin dans l’urètre jusqu’à ce que le barillet de la seringue soit parallèle à la surface de travail. L’arbre entier de l’aiguille du cathéter (à l’exclusion de la base) doit entrer dans la souris, en positionnant la pointe du cathéter dans la lumière de la vessie. Délivrez lentement 50 à 80 μL de fixateur, ce qui provoque le gonflage de la vessie comme un ballon. Maintenez le cathéter en place et soulevez légèrement la seringue en inclinant la pointe vers le haut. Avec l’autre main, ouvrez un hémostat et faites glisser une broche sous l’aiguille du cathéter à l’intersection de l’urètre. Fermez partiellement l’hémostat jusqu’à ce qu’il entre en contact avec l’aiguille. Faites glisser doucement l’aiguille du cathéter hors de la vessie tout en serrant et en verrouillant complètement l’hémostat pour éviter la perte du fixateur. Saisissez l’hémostat de sorte qu’il soit parallèle à la surface de travail avec la vessie reposant sur le dessus. Soulevez doucement et soigneusement coupé sous l’hémostat (côté opposé de la vessie) pour retirer la vessie avec l’hémostat encore attaché. Placez la vessie et l’hémostat attaché dans un tube Falcon contenant un fixateur chauffé. Assurez-vous que la vessie est complètement immergée dans le liquide et non pressée contre les parois du tube. Incuber à 4 °C pendant 24 h. Traitement et imagerie de la vessie avec microscopie électronique à balayage (MEB) Coupez la vessie en deux avec une lame de rasoir double face nettoyée et faites une deuxième coupe tangentielle à l’hémostat pour libérer la vessie. Il en résulte 2 « tasses » de demi-vessie. S’il reste des coussinets de graisse à l’extérieur de la vessie, retirez-les doucement. Rincer les moitiés de la vessie trois fois (10 min chacune) dans un tampon de cacodylate de sodium (0,15 M, pH 7,4). Tacher le tissu avec 1% de tétroxyde d’osmium dans un tampon de cacodylate de 0,15 M pendant 1 h à température ambiante. L’osmium est sensible à la lumière; par conséquent, effectuez cette étape avec le récipient de coloration enveloppé dans du papier d’aluminium pour maintenir un environnement sombre.ATTENTION : Le tétroxyde d’osmium est toxique et corrosif pour la peau. Faites cette étape dans la hotte avec des gants. Rincez les moitiés de la vessie trois fois (10 min chacune) à l’eau ultrapure. Au cours de ces étapes, l’huile osmique peut parfois être vue à la surface de l’eau. Aspirez ou mèchez-le pour éviter toute contamination pendant les étapes de séchage. Déshydrater les tissus en les immergeant dans une série d’éthanol gradué (50, 70, 90, 100 et 100 %) pendant 10 min chacun. Séchez le tissu fixe à l’aide d’un sécheur à point critique effectuant12 échanges de CO 2 à la vitesse la plus lente. Réglez tous les paramètres supplémentaires sur lent, à l’exception de l’étape de ventilation qui est réglée sur rapide. Coupez à nouveau chaque moitié de vessie en deux avec un rasoir double face propre pour générer 4 pièces totales afin de réduire la courbure de l’échantillon pour un revêtement plus efficace, pour faciliter l’imagerie dans le MEB et pour exposer les tissus qui peuvent s’être recourbés pendant le séchage. Collez les morceaux de vessie à une languette adhésive conductrice en carbone sur un talon en aluminium et peignez une petite quantité d’adhésif argenté autour du contact inférieur avec un cure-dent, en prenant soin d’empêcher l’excès d’adhésif de s’évacuer sur la surface interne de la vessie. Utilisez un enduit de pulvérisation à vide poussé pour recouvrir les tiges d’échantillon de 6 nm d’iridium. Si les échantillons continuent de se charger, assurez-vous qu’un chemin conducteur est peint jusqu’à la surface avec de la peinture argentée et recouvrez de 4 nm supplémentaires d’iridium. Imagez les échantillons avec un microscope électronique à balayage. Bien que les conditions puissent varier en fonction du microscope utilisé, une tension d’accélération de 3 KeV avec un courant de faisceau de 200 pA et une distance de travail de 12-13 mm a bien fonctionné sur un Zeiss Merlin FE-SEM lors de l’utilisation du détecteur d’électrons Everhart-Thornley (SE2).