JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61967
, , ,
1Department of Molecular Microbiology,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Abstract

Terugkerende urineweginfecties (rUTI) veroorzaakt door uropathogene Escherichia coli (UPEC) komen vaak voor en zijn duur. Eerdere artikelen die modellen van urineweginfecties bij mannelijke en vrouwelijke muizen beschrijven, hebben de procedures voor bacteriële inenting en inventarisatie in urine en weefsels geïllustreerd. Tijdens een eerste blaasontsteking bij C57BL/6-muizen stelt UPEC latente reservoirs in blaasepitheelcellen vast die aanhouden na klaring van UPEC-bacteriurie. Dit model bouwt voort op deze studies om rUTI te onderzoeken die wordt veroorzaakt door de opkomst van UPEC vanuit latente blaasreservoirs. De urogenitale bacterie Gardnerella vaginalis wordt in dit model gebruikt als de trigger van rUTI omdat het vaak aanwezig is in de urogenitale kanalen van vrouwen, vooral in de context van vaginale dysbiose die is geassocieerd met UTI. Daarnaast wordt ook een methode voor in situ blaasfixatie gevolgd door scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse van blaasweefsel beschreven, met mogelijke toepassing op andere studies waarbij de blaas betrokken is.

Introduction

Urineweginfecties (UTI) leggen wereldwijd een aanzienlijke zorgbelasting op, die elk jaar de kwaliteit van leven van miljoenen mensen beïnvloedt, vooral vrouwen1. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) zijn de meest voorkomende oorzaak van UTI1. Veel patiënten (ongeveer 20-30%) die UTI ontwikkelen, zullen binnen 6 maanden een recidiverende UTI (rUTI) ervaren, ondanks de door antibiotica gemedieerde klaring van de initiële infectie2. Helaas lijdt maar liefst 5% van de premenopauzale vrouwen elk jaar aan 3 of meer rUTI 3,4. Sequentiële episodes van rUTI kunnen worden veroorzaakt door persistentie van dezelfde UPEC-stam uit het indexgeval 5,6,7,8. Gegevens van menselijke monsters en muismodellen suggereren dat rUTI van dezelfde stam kan worden veroorzaakt door UPEC die zich in rustige reservoirs in de blaas bevindt. Bij mensen werd UPEC gedetecteerd in epitheelcellen en blaasbiopten van patiënten met UTI 9,10,11,12,13. Studies bij C57BL/6-muizen hebben aangetoond dat sommige stammen van UPEC rustige intracellulaire reservoirs in de blaas kunnen vestigen, zoals gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie en door homogenisatie en kweek van blaasweefsel, die maandenlang worden gehandhaafd na oplossing van bacteriurie 14,15,16. Behandeling van de blaas met middelen die exfoliatie van het blaasepitheel (urotheel) induceren, bijvoorbeeld protaminesulfaat17 of chitosan18, veroorzaken de opkomst van UPEC uit reservoirs om rUTI te veroorzaken. Deze gegevens suggereren dat bij vrouwen die blaas-UPEC-reservoirs herbergen van een eerdere infectie, blaasblootstellingen die leiden tot urotheliale exfoliatie rUTI kunnen veroorzaken.

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de vaginale microbiota bijdraagt aan urineweginfectie19,20. Gardnerella vaginalis is een frequent lid van zowel de vaginale als de urinaire microbiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. In de vagina is de aanwezigheid van hoge niveaus van G. vaginalis geassocieerd met een microbiële dysbiose die bekend staat als bacteriële vaginose (BV), die ~ 30% van de vrouwentreft 30,31,32. Vrouwen met BV lopen een hoger risico op het ervaren van UTI in vergelijking met vrouwen met een vaginale gemeenschap gedomineerd door Lactobacillus 33,34,35,36,37. In muismodellen veroorzaakt G. vaginalis epitheliale exfoliatie zowel in de vagina38 als in de blaas39. Bij C57BL/6-muizen met UPEC-blaasreservoirs resulteren twee opeenvolgende blaasblootstellingen aan G. vaginalis – maar niet aan PBS – in het opnieuw opduiken van UPEC uit reservoirs om UPEC-rUTI te veroorzaken. De opkomst blijkt uit het verschijnen van UPEC-titers in urine van muizen die eerder UPEC-bacteriurie hadden opgelost en een daaropvolgende afname van UPEC-blaashomogenaattiters bij opoffering in vergelijking met PBS-blootgestelde controledieren39. Interessant is dat er geen blijvende kolonisatie door G. vaginalis in de blaas is. In de overgrote meerderheid van de gevallen zijn twee korte blootstellingen, elk met minder dan 12 (h) levensvatbare G. vaginalis in de urine, voldoende om urotheliale exfoliatie uit te lokken en rUTI te bevorderen.

Dit protocol beschrijft een muismodel van rUTI veroorzaakt door UPEC in intracellulaire blaasreservoirs, met behulp van G. vaginalis blaasinenting om het recidief te veroorzaken. De vooruitgang die met dit model wordt bereikt, is dat G. vaginalis een klinisch relevante biologische trigger van rUTI is in vergelijking met eerder gebruikte chemische agentia. Verder maakt de relatief kortstondige overleving van G. vaginalis in de urinewegen van de muis het mogelijk om de impact van voorbijgaande microbiële blootstellingen op het urotheel te onderzoeken, zoals zou kunnen optreden na seksuele activiteit. Naast het schetsen van het rUTI-model, beschrijft dit protocol ook methoden voor urinecytologie en in situ blaasfixatie en beeldvorming van het urotheel door scanning elektronenmicroscopie (SEM).

Dit protocol van G. vaginalis-geïnduceerde recidiverende UPEC UTI maakt gebruik van UPEC stam UTI89 met een kanamycineresistentiecassette (UTI89kanR)40. Niet alle geteste stammen van UPEC waren in staat om intracellulaire bacteriële gemeenschappen te vormen tijdens de acute infectiefase bij muizen41 en het is nog niet bekend of alle stammen van UPEC het vermogen hebben om latente intracellulaire reservoirs te vormen. Reservoirvorming moet worden bevestigd voorafgaand aan het gebruik van andere UPEC-stammen in het model. Dit protocol maakt gebruik van een spontaan streptomycine-resistent G. vaginalis isolaat, JCP8151BSmR38. Inductie van rUTI door JCP8151BSmR vereist twee opeenvolgende G. vaginalis-inentingen, gegeven 12 uur of 7 dagen (d) uit elkaar39. Of andere G. vaginalis-stammen al dan niet exfoliatie en/of UPEC-rUTI induceren, moet met dit model nog worden bepaald. Het is essentieel om UPEC- en G. vaginalis-stammen te gebruiken met bekende antibioticaresistentie (zoals kanamycine of spectinomycine voor UPEC en streptomycine voor G. vaginalis) omdat antibiotica aan agarplaten kunnen worden toegevoegd om de groei van endogene muismicrobiota te voorkomen die anders zouden kunnen interfereren met het opsommen van kolonievormende eenheden (CFU) om infectie te controleren. Dit is vooral belangrijk voor het kweken van urinemonsters, omdat muizenurine vaak andere bacteriën bevat die zonder antibiotica op kweekplaten kunnen overwoekeren. De oorsprong van deze endogene bacteriën in muizenurine is onbekend, maar weerspiegelt waarschijnlijk periurethrale en urogenitale bacteriën die worden opgepikt tijdens het verzamelen van urine.

G. vaginalis is een facultatieve anaerobe bacterie en daarom beschrijft dit protocol het kweken van G. vaginalis JCP8151BSmR in een anaerobe kamer. Als er geen anaerobe kamer beschikbaar is, kunnen andere methoden voor het handhaven van anaerobe groeiomstandigheden (zoals een GasPak-zakje in een luchtdichte container) worden gebruikt. Als alternatief zullen sommige stammen van G. vaginalis (waaronder JCP8151BSmR) groeien in een standaard weefselkweekincubator (5% CO2). Net zoals het gebruik van andere G. vaginalis-stammen dan JCP8151BSmR testen vereist om ervoor te zorgen dat de bacteriën zich in dit model op dezelfde manier gedragen, vereist het veranderen van groeiomstandigheden empirische bepaling van ideale duur voor kweek (op platen en in vloeistof) en optische dichtheid (OD) 600-equivalenten om de gewenste levensvatbare entconcentraties te bereiken. Bovendien is het niet bekend of groeistoornissen de pathobiologie van G. vaginalis beïnvloeden.

Ten slotte, bij het overwegen om dit model te gebruiken, moeten onderzoekers zich ervan bewust zijn dat het grotere aantallen dieren per groep kan vereisen dan typische UTI-muismodellen. Dit komt deels omdat inductie van rUTI vereist dat de muizen de UPEC-bacteriurie oplossen die wordt veroorzaakt door de initiële infectie van de blaas. Dus elke muis die bacteriurie niet wist te verwijderen (een fenotype dat meestal wijst op aanhoudende nierinfectie) is niet opgenomen in de rUTI-fase van het protocol. Het aantal muizen dat nodig is om deze studies aan te drijven, wordt ook beïnvloed door de snelheid van “spontane” UPEC-opkomst in de urine (gemiddeld 12-14%). Ten slotte hebben verschillende muizenstammen verschillende neigingen voor het ontwikkelen van chronische bacteriurie versus intracellulaire reservoirvorming42,43. Als in dit model andere muizenstammen dan C57BL/6 worden gebruikt, moet worden bevestigd dat de dieren rustige UPEC-intracellulaire reservoirs ontwikkelen.

Protocol

Het Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) heeft alle muisinfecties en -procedures goedgekeurd als onderdeel van protocolnummer 20170081, dat is verlopen op 06/09/2020 en 20-0031, dat verloopt op 18-03-2023. De algehele verzorging van de dieren was consistent met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council en de USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasieprocedures zijn in overeenstemming met de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren: editie 2020. Figuur 1. Schema van muismodel. De tijdlijn wordt gemarkeerd om de fasen of procedures van het model weer te geven die in het protocol worden beschreven. Fase 1 (oranje): Het opzetten van intracellulaire UPEC-reservoirs. Muizen worden transurethraal ingeënt met UPEC en urinemonsters worden verzameld en gecontroleerd op klaring van bacteriurie. Alleen muizen die bacteriurie opruimen, gaan door naar de volgende fasen. Fase 2 (groen): Blaasblootstelling aan G. vaginalis. Muizen worden transurethraal geïnoculeerd met G. vaginalis twee keer. De tijdsduur tussen de twee opeenvolgende blootstellingen is 12 uur (bovenpaneel) of 1 week (wk; onderste paneel), afhankelijk van de gewenste downstream-analyse. Fase 3 (geel): UPEC rUTI. Urine wordt dagelijks verzameld na blootstelling aan G. vaginalis en gecontroleerd op UPEC-bacteriurie. Bovendien kunnen blazen en nieren worden verzameld op het experimentele eindpunt om UPEC-weefseltiters te meten. In het 1 week blootstellingsmodel worden G. vaginalis-geïnduceerde opkomst van UPEC uit intracellulaire reservoirs en daaropvolgende klaring uit de urinewegen ook weerspiegeld in een afname van UPEC-blaasweefseltiters (vergeleken met PBS-blootgestelde muizen, zie figuur 3D). Deze afname van blaastiters was niet duidelijk in het 12 h blootstellingsmodel, vermoedelijk omdat er meer tijd nodig is om voldoende reservoiropkomst en -klaring te laten optreden om weefseltiters aanzienlijk te verminderen. Procedure A: Urinecytologie wordt meestal 1 dpi (of zelfs eerder) uitgevoerd tijdens fase 1 om acute UPEC-infectie te onderzoeken en tijdens fase 3 om het PMN-gehalte van de urine te beoordelen, wat correleert met upec-opkomst. Urinemonsters verzameld op andere tijdstippen kunnen op dezelfde manier worden geanalyseerd. Procedure B: Blaasscanning elektronenmicroscopie (SEM) om urotheliale exfoliatie te onderzoeken wordt meestal uitgevoerd in het 12 h-model op 3 h na de tweede G. vaginalis-blootstelling (15 h na toediening van de eerste blootstelling op tijdstip 0). Andere tijdstippen kunnen ook worden beoordeeld, zoals 6-24 uur na UPEC-inenting zoals getoond in fase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1. Zet UPEC-rustige intracellulaire reservoirs op bij muizen Bereid urinekatheters voor (zie 44,45,46,47 voor video’s van deze stap). Draad 30 Gauge naalden met een lengte van PE10-buizen die zich uitstrekken van de naaldbasis tot enkele mm voorbij de naaldpunt. Zorg ervoor dat u de slang niet doorprikt met de naaldpunt. Als alternatief, gebruik pediatrische intraveneuze canules46. Plaats voorbereide katheters in een petrischaaltje en steriliseer met UV-licht gedurende ten minste 30 minuten. Vervang het deksel van de petrischaal en bewaar het voordat het nodig is. Bereid UPEC-entmateriaal voor (dag -3 tot 0) Dag -3: Streak UTI89kanR van -80 °C diepvriesbouillon op een Luria-Bertani (LB) agarplaat. Incubeer plaat bij 37 °C gedurende 18-24 uur.OPMERKING: Het is niet nodig om kanamycine toe te voegen aan de groeimedia van het entmateriaal omdat de kanamycineresistentie stabiel is geïntegreerd in UTI89kanR. Dag -2: Ent 20 ml LB-bouillon in een steriele kolf van 125 ml met een enkele kolonie UTI89kanR. Gebruik geen kleinere kolf omdat deze kweekmethode belangrijk is om expressie van de UPEC type 1 pilus te induceren die nodig is voor blaashechting. Incubeer statisch (zonder schudden) bij 37 °C gedurende 18-24 uur. Voeg geen antibiotica toe aan het groeimedium. Gebruik alleen verse kolonies op LB-platen (18-24 uur oud) om vloeistofculturen te starten. Dag -1: Subcultuur UTI89kanR door 20 μL cultuur te verwijderen (draai de kolf voorzichtig om bezonken bacteriën te resuspenderen) en voeg toe aan 20 ml verse LB-bouillon in een steriele kolf van 125 ml. Incubeer zoals in stap 2, behalve voor een stevige duur van 18 uur. Voeg geen antibiotica toe aan het groeimedium. Dag 0: Breng de hele cultuur over in een buis van 50 ml en draai met 3200 × g in een tafelcentrifuge gedurende 10 minuten naar pelletbacteriën. Aspirateer supernatant en resuspend de bacteriële pellet in 10 ml PBS. Voeg 100 μL van de geconcentreerde bacteriële suspensie van stap 4 tot 900 μL PBS toe in een cuvette en bepaal de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) met behulp van een spectrofotometer die is leeggemaakt met PBS. Vermenigvuldig de spectrofotometerwaarde met 10 (om rekening te houden met de verdunning) om de OD600 van de suspensie (OD-suspensie) te bepalen. Om de gewenste entculumconcentratie van 1 x 107 CFU in 50 μL te bereiken, verdunt (of concentreert) u de UTI89 kanR-suspensie met behulp van de volgende vergelijking, waarbij het gewensteOD-entmateriaal 0,35 is (waarde kan variëren voor andere UPEC-stammen) en Y is het volume entmateriaal dat nodig is (100 μL per muis om extra mogelijk te maken voor het elimineren van bellen en het vullen van de katheters):X ml xOD-suspensie = Y ml xOD-entmateriaalAls deOD-suspensiewaarde bijvoorbeeld 4,7 is en 5 ml entmateriaal vereist is:X ml × 4,7 = 5 × 0,35X = (5 × 0,35) / 4,7X = 0,372 mlVoeg daarom 372 μL bacteriële suspensie toe om 5 ml (eindvolume) te maken Gebruik een meerkanaals pipet om 1:10 seriële verdunningen van het entmateriaal uit te voeren tot 10-6 in steriel PBS in een 96-well plaat. Spot vijf replica’s van 10 μL van alle 6 verdunningen op een LB- en LB+kanplaat, laat de vlekken drogen en incubeer ‘s nachts bij 37 °C. De LB-plaat zonder antibiotica wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat het entmateriaal niet is besmet door een ander organisme (dat zou verschijnen als een extra koloniemorfologie die niet aanwezig is op de kan antibioticumselectieplaat). Beide plaattypen moeten hetzelfde resultaat opleveren.OPMERKING: Platen moeten een dag voor gebruik op het tafelblad kunnen drogen, zodat ze de vergulde vloeistof absorberen zonder dat vlekken samensmelten. Tel het totale aantal kolonies op alle plekken van de verdunning met onderscheidbare kolonies en gebruik de waarde om de werkelijke entdosis te berekenen die in elk experiment wordt gebruikt. Vertrouw niet alleen op de OD600-waarden . Ent UTI89kanR in de blazen van verdoofde vrouwelijke muizen (dag 0)OPMERKING: Video-opnamen van deze procedure zijn eerder gepubliceerd 44,46. Raadpleeg deze artikelen voor een meer grondige beschrijving. Zie paragraaf 5 van dit protocol voor meer informatie over muiskatheterisatie. Verdoof muizen met isofluraaninhalatie volgens IACUC-goedgekeurde methoden. In afwachting van muizen om verdoofd te worden, vult u de tuberculinespuit met UTI89 kanR-entmateriaal en brengt u vervolgens een voorbereide katheter aan. Druk de zuiger in om lucht uit de katheter te verwijderen en dep de katheter vervolgens in steriel chirurgisch smeermiddel. Plaats de muis op zijn rug en bevestig de verdoving door stevig in het voetkussen van de muis te knijpen en de afwezigheid van een reflex of reactie te observeren. Lokaliseer de blaas (voelt als een erwt in de onderbuik) tussen de wijsvingers van elke hand. Druk urine af door vingers naar elkaar toe te bewegen om een zachte knijpdruk op de blaas uit te oefenen. Breng de katheter door de urethra van de muis in de blaas en lever langzaam 50 μL entmateriaal af. Wacht een paar seconden en verwijder vervolgens voorzichtig de katheter door er recht uit te trekken. Breng de muis terug naar zijn kooi en controleer totdat hij herstelt van de anesthesie. Herhaal stap 1.3.1 – 1.3.5 met extra muizen en vervang de katheter tussen elke kooi (5 muizen). Indien gewenst kan dezelfde procedure worden gebruikt om een controlegroep muizen met PBS in te enten, bijvoorbeeld om een andere stam van G. vaginalis lokt rUTI uit (over het spontane / achtergrondniveau). 2. Controle van de klaring van UPEC-bacteriurie (dagen 1 tot en met 28) OPMERKING: Video van de urineverzamelingsprocedure is eerder gepubliceerd44. Verzamel urine (minimaal 10 μL) van alle muizen door blaaspalpatie zoals beschreven44 bij 1 d na infectie en wekelijks gedurende 4 weken (7, 14, 21 en 28 d na infectie). Urine moet binnen enkele uren na verzameling worden gekweekt om upec-infectie te controleren. Bewaar urine bij 4 °C tot het verguld is. Urine kan ook worden gebruikt voor cytologie (zie rubriek 4). Af en toe als de blaas erg ontstoken is, kan 10 μL urine niet worden verkregen; in dit geval kan PBS worden opgeteld tot 10 μL, maar de urine bacteriële titer en cytologie scores moeten dienovereenkomstig worden aangepast (bijvoorbeeld, als slechts 5 μL urine wordt verzameld en 5 μL PBS wordt toegevoegd, vermenigvuldig titers en scores met 2). Maak met een meerkanaals pipet 1:10 seriële verdunningen tot 10-6 in steriele PBS in een 96-well plaat. Gebruik een P10 meerkanaals pipet om 10 μL van alle 6 verdunningen uit kolom 1 te herkennen in een verticale oriëntatie aan de linkerkant van een LB-plaat die de relevante antibioticaselectiemarker bevat. Gooi tips weg. Herhaal de beplating met de resterende monsters (kolom 2, vervolgens kolom 3, enz.). Een enkele plaat biedt plaats aan 5 monsters naast elkaar. Dit levert een plaat op met een 5 × 6-spotmatrix, met toenemende verdunningen van boven naar beneden en toenemende monsteraantallen van links naar rechts (figuur 2A). Laat de plekken op de benchtop drogen en incubeer vervolgens een nacht bij 37 °C. Tel de volgende dag het aantal kolonies op de minst verdunde plek waar de kolonies verschillend zijn (figuur 2B) en gebruik dit getal om CFU/ml te berekenen:Aantal kolonies in enkele urinevlek × verdunningsfactor × 100 = CFU / ml urine Plot UTI89kanR urinetiters met behulp van grafieksoftware (figuur 2C). Identificeer muizen die geen detecteerbare UTI89kanR in de urine hebben bij 28 d (~ 65-80% van de C57BL / 6-muizen). Deze muizen herbergen rustige intracellulaire reservoirs en worden in de daaropvolgende experimentele fase gebruikt om de inductie van terugkerende urineweginfecties te onderzoeken. Degenen met bacteriën in de urine op 28 d worden niet opgenomen in de volgende stappen. 3. Blaasblootstelling aan G. vaginalis Wijs muizen toe aan blootstellingsgroepen (dag 29). Het primaire doel van deze stap is om te voorkomen dat alle muizen met meer langdurige bacteriurie samen in dezelfde blootstellingsgroep zitten, omdat het onbekend is of dit de kans op rUTI beïnvloedt. Gebruik de urine-CFU-gegevens (figuur 2D) en categoriseer de muizen op basis van het tijdstip waarop UTI89kanR-bacteriurie niet langer detecteerbaar was (figuur 2E). Randomiseer de muizen uit elke categorie in de G. vaginalis – of PBS-inentingsgroepen; bijvoorbeeld, de helft van de muizen die vóór dag 7 zijn verdwenen, krijgt G. vaginalis en de helft krijgt PBS; de helft van de muizen die tussen dag 8 en 14 zijn geklaard, krijgt G. vaginalis en de helft krijgt PBS, enz. (zoals in figuur 2E). Bereid G. vaginalis inoculum voor (alle stappen uitgevoerd in een anaerobe kamer)OPMERKING: Ideale kweekincubatietijden variëren tussen verschillende stammen van G. vaginalis, waarbij sommige stammen de stationaire fase ingaan en zelfs sneller beginnen te sterven dan andere. Dit is vooral belangrijk omdat de gedode G. vaginalis (JCP8151B) niet in staat was om rUTI39 te activeren. De incubatietijden moeten dus empirisch worden bepaald voor een bepaalde stam voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten bij muizen. Het is onbekend of andere/alle stammen van G. vaginalis dezelfde effecten zullen veroorzaken in dit model. Streak G. vaginalis stam van -80 °C diepvriesvoorraad op een NYCIII plaat (zonder antibiotica). Incubeer plaat bij 37 °C anaeroob gedurende 24 uur. In de anaerobe kamer ent u 5 ml anaerobe NYCIII-media met een lus van 1 μL cellen (een enkele kolonie is onvoldoende) uit de NYCIII-plaat en incubeer de cultuur statisch bij 37 °C onder anaerobe omstandigheden gedurende 18 uur. Neem geen antibiotica op in het groeimedium. Bepaal de OD600 van de cultuur met behulp van een spectrofotometer. Centrifugeer een bepaald volume (X) cultuur bij 9600 × g gedurende 1 min en adem de media op. Bereken het volume (Y) van PBS om de pellet opnieuw te suspenseren om het gewenste entmateriaal OD te bereiken om 108 CFU in 50 μL te bereiken met behulp van de volgende vergelijking:X ml ×OD-cultuur = Y ml ×OD-entmateriaal oplossen voor YY = (X ml × ODcultuur) / ODentmateriaalOPMERKING: HetOD-entmateriaal voor JCP8151BSmR is 5, maar dit moet empirisch worden bepaald voor andere G. vaginalis-stammen . Bijvoorbeeld, als het spinnen van 3 ml van een JCP8151BSmR overnight liquid culture metOD-cultuur = 2,0: Y = (3 ml × 2,0) / 5,0; daarom resuspend pellet in 1,2 ml PBS Resuspensie de bacteriële pellet in PBS tot de gewenste concentratie. Verdun en plaat het entmateriaal (zoals beschreven in het CFU-platingprotocol hierboven) serieel om de werkelijke entdosis te bepalen die in elk experiment is gebruikt. Vertrouw niet alleen op de OD-waarden. Op dag 29-31 na upec-inenting, ent uil verdoofde muizen met G. vaginalis of PBS zoals beschreven in stap 1.3 hierboven. Een PBS-controlegroep is essentieel, omdat het katheteriseren van de blaas mogelijk schade en urotheliale exfoliatie kan veroorzaken die een zekere mate van UPEC-reservoirregeneratie zou kunnen veroorzaken. PBS-geënte muizen dienen daarom als de controle waarmee G. vaginalis-geïnoculeerde muizen worden vergeleken.OPMERKING: De uiteindelijke UPEC-bacteriuriebepaling bij 28 d vereist nachtelijke incubatie van de CFU-plaat. Daarom is de vroegste stap die kan worden uitgevoerd 29 dagen na de eerste UPEC-inenting. Indien nodig kan de blootstelling pas op dag 31 worden gegeven. Onderzoekers moeten consistent zijn tussen experimenten. Herhaal het entvoorbereiding om een tweede G. vaginalis (of PBS-controle) inenting toe te dienen op het gewenste tijdstip, zoals 12 uur of 1 week na de eerste inenting. Een tweede blootstelling is noodzakelijk omdat een enkele inenting met G. vaginalis niet resulteert in significante UPEC-opkomst39. 4. Monitoring upec recurrente UTI Verzamel urine van muizen op de gewenste tijdstippen na elke G. vaginalis-inenting (1, 2 en 3 d na inenting aanbevolen). Serieel verdunnen en plaaturine op selectieve platen (bijv. LB + kanamycine) om UTI89kanR CFU / ml te bepalen. Indien gewenst kunnen urineverdunningen ook worden verguld op selectieve platen (bijv. NYCIII + 1 mg / ml streptomycine) om G. vaginalis CFU / ml te bepalen. G. vaginalis JCP8151BSmR werd echter 12 uur 39 uit de urine van de meeste muizen verwijderd. Daarom zouden eerdere tijdspunten nodig zijn om G. vaginalis bij de meeste muizen te detecteren. Offer op het experimentele eindpunt (bijv. 3 d na de tweede G. vaginalis-inenting) de muizen op volgens goedgekeurde methoden (bijv. Cervicale dislocatie onder isofluraananenesthesie of CO 2-inhalatie) en verzamel blazen en nieren voor CFU-inventarisatie, zoals eerder beschreven 44,46. 5. Urinecytologie OPMERKING: Deze procedure kan op elk moment worden uitgevoerd waarop visualisatie van de cellen en / of bacteriën in de urine gewenst is. Zoals aangegeven in figuur 1, wordt urinecytologie meestal uitgevoerd bij 1 dpi (of zelfs eerder) tijdens fase 1 om acute UPEC-infectie te onderzoeken en tijdens fase 3 om de aanwezigheid van polymorfonucleaire (PMN) cellen in urines te beoordelen die UPEC-opkomst vertonen. Voeg 10 μL urine toe aan 90 μL PBS in een cytofunnelcassette met bijgevoegd filter en schuif. (De eenvoudigste methode is om de rest van de 1:10 verdunningen te gebruiken van de 96-well plaat die wordt gebruikt voor urineteelt; deze monsters kunnen tot 24 uur na het kweken van de urine worden gebruikt als ze bij 4 °C worden bewaard). Plaats cassettes in cytocentrifuge en draai op 600-800 x g gedurende 6 minuten met hoge versnelling. Verwijder dia’s en laat een nacht drogen. De volgende dag beitsen met een hematologiekleuringskit (bijv. Wright’s, Giemsa, inclusief fixatief) volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer de dia’s door lichtmicroscopie op de aanwezigheid van PMN’s en epitheelcellen. Indien gewenst kunnen deze worden gescoord met behulp van een kwalitatieve scoringsmaatstaf op basis van de abundantie van elk celtype dat aanwezig is in elk krachtig gezichtsveld (bijv. 0 = geen, 1 = weinig, 2 = matig, 3 = robuust). Zorg ervoor dat het individu dat de dia’s analyseert, blind is voor de experimentele groepen om mogelijke vertekening te minimaliseren. 6. In beeld brengen van blazen door scanning elektronenmicroscopie OPMERKING: Deze procedure kan op elk moment worden uitgevoerd waarop visualisatie van het urotheel gewenst is. Zoals aangegeven in figuur 1 (paarse dozen), worden UPEC-urotheliale interacties het best gevisualiseerd tussen 6 h en 24 uur na UPEC-inenting tijdens de reservoirvormingsfase, en urotheliale exfoliatie veroorzaakt door G. vaginalis kan het best worden gevisualiseerd tussen 3 h en 12 h na de tweede blootstelling aan G. vaginalis . In situ blaasfixatie Bereid fixatief direct voor de blaasoogst door toevoeging van glutaaraldehyde (2,5% definitief) en paraformaldehyde (2% definitief) in 0,15 M natriumcacodylaatbuffer met 2 mM CaCl2 bij pH 7,4. Gebruik paraformaldehyde en glutaaraldehyde uit nieuw geopende glazen ampullen, omdat beide fixatieven na verloop van tijd oxideren in geopende containers.LET OP: Glutaaraldehyde is giftig, irriterend voor de luchtwegen en corrosief; paraformaldehyde is ontvlambaar, carcinogeen, irriterend en reproductief toxine; natriumcacroodylaat is giftig en kankerverwekkend. Om 50 ml fixatieve oplossing te maken, voegt u 6,25 ml 16% paraformaldehyde, 2 ml 50% glutaaraldehyde en 16,75 ml ultrapuur water toe aan 25 ml van een 0,3 M oplossing van natriumcacroodylaat bij pH 7,4 met 4 mM CaCl2. Verwarm het bereide fixatiemiddel tot 37 °C voordat het aan de blaas wordt toegediend. Vul de tuberculine slip-tip spuit met fixatief en breng een katheter aan het uiteinde aan, schuin afschuinend tegenover tegenoverliggende spuitmarkeringen. Knip de overtollige slang 1-2 mm van het uiteinde van de naald af en zorg ervoor dat de naaldpunt niet wordt blootgesteld. Veeg met de spuit om bellen te verwijderen en duw de zuiger om lucht te legen en vul de katheter met fixeermiddel over een microcentrifugebuis om eventuele fixatiemiddelen te verzamelen voor een goede verwijdering. Verdoof en offer de muis op met behulp van een goedgekeurde methode (bijv. Cervicale dislocatie onder anesthesie). Plaats de muis op het ontleedoppervlak met de poten vastgezet (met elastiekjes of pinnen). Open het bekkengebied van de muis met een tang en een chirurgische schaar om de blaas bloot te leggen. Duw voorzichtig het aangrenzende vet opzij, maar laat de blaas op zijn plaats. Houd de spuit met de dominante hand met de naald naar beneden gericht en de naaldafschuining en spuitmarkeringen van u af gericht. Dompel de katheterpunt in steriel smeermiddel. Plaats de katheterpunt bij de urethrale opening en houd de spuitloop weg in een hoek van 30-45° ten opzichte van het muislichaam. Oefen neerwaartse druk uit met een zeer kleine beweging met de klok mee met de punt en breng de katheter voorzichtig in de urethra. Terwijl de katheterpunt de urethra binnenkomt, scharniert u de spuit naar de staart van de muis terwijl u de katheter verder in de urethra blijft schuiven totdat de spuitcilinder evenwijdig is aan het werkoppervlak. De volledige katheternaaldschacht (exclusief de basis) moet de muis binnengaan en de katheterpunt in het blaaslumen plaatsen. Lever langzaam 50-80 μL fixatief af, waardoor de blaas als een ballon opblaast. Houd de katheter op zijn plaats en til de spuit iets op, waarbij u de punt omhoog kantelt. Open met de andere hand een hemostat en schuif een steek onder de katheternaald op het snijpunt van de urethra. Sluit de hemostaat gedeeltelijk totdat deze net contact maakt met de naald. Schuif de katheternaald voorzichtig uit de blaas en klem tegelijkertijd de hemostaat volledig vast en vergrendel deze om verlies van het fixatiemiddel te voorkomen. Pak de hemostaat vast zodat deze parallel loopt aan het werkoppervlak met de blaas erop rustend. Til voorzichtig op en snijd voorzichtig onder de hemostaat (tegenovergestelde kant van de blaas) om de blaas te verwijderen met de hemostaat nog steeds bevestigd. Plaats blaas en bevestigd hemostaat in een Falcon-buis met verwarmd fixatief. Zorg ervoor dat de blaas volledig wordt ondergedompeld in de vloeistof en niet tegen de wanden van de buis wordt gedrukt. Incubeer bij 4 °C gedurende 24 uur. Blaasverwerking en beeldvorming met scanning elektronenmicroscopie (SEM) Sagittally bisect de blaas met een gereinigd, dubbelzijdig scheermesje en maak een tweede snede raakvlakken met de hemostaat om de blaas vrij te maken. Dit resulteert in 2 halve blaas “cups”. Als er nog resterende vetkussens aan de buitenkant van de blaas zijn, verwijder ze dan voorzichtig. Spoel de blaashelften driemaal (elk 10 min) in natriumcacodylaatbuffer (0,15 M, pH 7,4). Kleur het weefsel met 1% osmiumtetroxide in 0,15 M cacodylaatbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Osmium is gevoelig voor licht; voer daarom deze stap uit met het kleurvat gewikkeld in folie om een donkere omgeving te behouden.LET OP: Osmiumtetroxide is giftig en corrosief voor de huid. Doe deze stap in de zuurkast met handschoenen. Spoel de blaashelften drie keer (elk 10 min) in ultrapuur water. Tijdens deze stappen kan geënsceneerde olie soms op het wateroppervlak worden gezien. Aspirateer of pipeer dit af om besmetting tijdens de droogstappen te voorkomen. Droog weefsels uit door onder te dompelen in een gegradeerde ethanolreeks (50, 70, 90, 100 en 100%) gedurende elk 10 minuten. Droog het vaste weefsel met behulp van een kritische-puntdroger die 12 CO 2-uitwisselingen uitvoert met de langzaamste snelheid. Stel alle aanvullende instellingen in op langzaam, behalve de ontluchtingsstap die is ingesteld op snel. Bisect elke blaashelft opnieuw met een schoon dubbelzijdig scheermes om 4 totale stukken te genereren om de kromming van het monster te verminderen voor een efficiëntere coating, voor het gemak van beeldvorming in de SEM en om weefsel bloot te leggen dat mogelijk is gekruld tijdens het drogen. Hecht de blaasstukken aan een geleidend koolstoflijmlipje op een aluminium stomp en schilder een kleine hoeveelheid zilveren lijm rond het onderste contact met een tandenstoker, waarbij u ervoor zorgt dat overtollige lijm niet op het binnenoppervlak van de blaas terechtkomt. Gebruik een hoogvacuüm sputtercoater om de monsterstoot te sputteren met 6 nm iridium. Als de monsters blijven opladen, zorg er dan voor dat een geleidend pad naar het oppervlak wordt geverfd met zilveren verf en een laag met een extra 4 nm iridium. Breng de monsters in beeld met een scanning elektronenmicroscoop. Hoewel de omstandigheden kunnen variëren afhankelijk van de gebruikte microscoop, werkte een versnellende spanning van 3 KeV met een bundelstroom van 200 pA en een werkafstand van 12-13 mm goed op een Zeiss Merlin FE-SEM bij gebruik van de Everhart-Thornley (SE2) elektronendetector.

Representative Results

Na inenting zijn UPEC-titers detecteerbaar in de urine (figuur 2B). Het niet plaatsen van urinemonsters op selectieve media die kanamycine bevatten, zal waarschijnlijk resulteren in overgroei van endogene muismicrobiota die de urine verontreinigen. Het niveau van UPEC-bacteriurie zal waarschijnlijk hoog zijn op dag 1 en kan in de eerste week toenemen voordat het op latere tijdstippen afneemt (figuur 2C). Ongeveer 65-80% van de muizen heeft geen detecteerbare UPEC in de urine met 28 dpi (figuur 2C, groene cirkel). Deze muizen kunnen worden gebruikt in de volgende stappen van het model. Muizen die bacterieur blijven (figuur 2C, rode ellips) moeten uit het experiment worden verwijderd. Twee opeenvolgende blootstellingen aan G. vaginalis gegeven 12 uur (figuur 3A) of 1 week uit elkaar (figuur 3B) resulteren in het ontstaan van UPEC uit intracellulaire reservoirs om terugkerende bacteriurie te veroorzaken. Zowel het niveau van UPEC-bacteriurie (Mann-Whitney-test) als de fractie muizen met UPEC-rUTI (Fisher’s exacte test) zijn significant hoger bij muizen die zijn blootgesteld aan G. vaginalis in vergelijking met de PBS-controlegroep. Urinecytologieanalyse detecteert PMN’s in de urine van G. vaginalis-blootgestelde muizen die UPEC-opkomst vertoonden (figuur 3C). In het model met twee blootstellingen met een tussenpoos van 1 week zijn UPEC-titers in blaasweefsel lager bij G. vaginalis-blootgestelde muizen in vergelijking met PBS (figuur 3D), vermoedelijk als gevolg van het ontstaan van UPEC uit reservoirs en de daaropvolgende klaring. Visualisatie van in situ-gefixeerd blaasweefsel door SEM onthult grote oppervlakkige paraplu-urotheelcellen die het blaasoppervlak bekleden bij controlemuizen die alleen aan PBS zijn blootgesteld (figuur 4A). Urotheliale exfoliatie wordt aangetoond door een verlies van oppervlakkige paraplucellen, waardoor kleinere onderliggende overgangsepitheelcellen worden onthuld bij muizen die zijn blootgesteld aan G. vaginalis (figuur 4B). Vroeg na de UPEC-inenting tijdens het aanleggen van intracellulaire reservoirs is UPEC zichtbaar op het urotheel en filamentvorming uit exfoliërende cellen (figuur 4C). Figuur 2. Monitoring van UPEC-titers in de urine tijdens fase 1 (reservoirvorming). (A) Schematische beplating van kolonievormende eenheden (CFU). (B) Representatief beeld van UPEC-titers in de urine op LB+kanamycine. Zwarte cirkels geven urinemonstervlekken aan die moeten worden geteld om CFU / ml te berekenen. (C) Tijdsverloop van UPEC-bacteriurie bij C57BL/6-muizen. Elke lijn vertegenwoordigt een individuele muis, die de UPEC-urinetiters in de loop van de tijd volgt. Stippellijn geeft de detectiegrens aan (1000 CFU/ml). Rode ellips duidt op vier muizen (van de 20) die de UPEC-bacteriurie niet konden oplossen en daarom niet zouden worden gebruikt voor het G. vaginalis-geïnduceerde rUTI-model. Omgekeerd duidt de groene cirkel op muizen die UPEC-bacteriurie oplosten en doorgingen naar volgende fasen. (D) Tabel met gegevens die zijn gebruikt om grafiek te genereren in paneel C. Gele, detecteerbare CFU; groen, geen KVE. (E) Randomisatie van muizen in blootstellingsgroepen op basis van het tijdstip waarop UPEC CFU niet langer in de urine werd gedetecteerd (“Dag opgelost”). De muisnummers in de linkerkolom van paneel D zijn dezelfde muisnummers als in paneel E. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. G. vaginalis veroorzaakt UPEC rUTI. UPEC-titers in de urine na twee opeenvolgende blootstellingen van urinewegen aan PBS (cirkels) of G. vaginalis (Gvag; vierkanten) gegeven 12 h (A) of 1 week (B) uit elkaar. Elk symbool vertegenwoordigt een individuele muis. De hoogste CFU/mL UPEC gedetecteerd van elke muis tussen 1-3 d na de tweede blootstelling worden uitgezet. Muizen zonder detecteerbare bacteriurie worden uitgezet op de detectiegrens (stippellijn). (C) Urinecytologie analyse met UPEC (pijlpunten) en polymorfonucleaire (PMN) cellen (pijlen). Schaalbalk = 20 μm. (D) UPEC-titers in blaasweefsel verzamelden 3 d na twee opeenvolgende blootstellingen aan urinewegen met een tussenpoos van 1 week. Elk symbool vertegenwoordigt een andere muis en nullen worden uitgezet op de detectiegrens (stippellijn). In A, B en D bevinden de vakken zich in het eerste en derde kwartiel met de mediaan gemarkeerd en snorharen van min tot max. Mann-Whitney U-tests * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4. SEM-analyse van in situ gefixeerde blazen. Blazen werden verzameld van muizen 3 uur na twee blootstellingen (12 uur uit elkaar) aan PBS (A) of G. vaginalis (C). Stippellijnen illustreren een enkele urine-epitheelcel, die kleiner is in G. vaginalis-blootgestelde blazen omdat de grote oppervlakkige cellen zijn weg geëxfolieerd en het onderliggende overgangsepitheel onthullen. (B) Blaas verzameld 6 uur na de eerste inenting met UPEC, tijdens fase 1 van het model, met urotheliale exfoliatie en extracellulaire UPEC. (D) Voorbeeld van onoplosbare vetdruppels die op het blaasoppervlak aanwezig zijn. Schaalbalken zijn 20 μm in de hoofdafbeeldingen en 2 μm in de inzet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De eerste kritieke stap in dit model om muizen te identificeren die de UPEC-bacteriurie niet hebben opgeruimd tijdens de primaire UTI-fase. Deze muizen moeten uit het experiment worden verwijderd omdat ze anders de tarieven van UPEC-bacteriurie na blootstelling aan G. vaginalis zouden verstoren. Na de eerste UPEC-inenting moet wekelijks urine worden verzameld om de bacteriële klaring te controleren. Ongeveer 65-80% van de C57BL/6 muizen zal binnen 4 weken een UTI89kanR-infectie verwijderen. Andere inteeltmuisstammen hebben verschillende neigingen voor UPEC-klaring42,43 en reservoirvorming en zijn daarom mogelijk niet geschikt voor dit model. Het tweede kritieke punt is dat empirische studies hebben vastgesteld dat twee opeenvolgende inentingen van G. vaginalis (12 uur of 1 week uit elkaar) nodig zijn om een significante reservoiropkomst te veroorzaken boven de spontane opkomst op de achtergrond die optreedt bij controlemuizen die alleen aan PBS worden blootgesteld. Andere tijdsduur tussen de twee opeenvolgende blootstellingen is niet getest, maar zou vergelijkbare resultaten kunnen opleveren. Het is belangrijk op te merken dat een vermindering van upec-blaastiters alleen werd waargenomen in het model waarin G. vaginalis-blootstellingen 1 week na elkaarwerden gegeven 39. Hoewel meer dan twee blootstellingen kunnen worden toegediend, suggereert empirisch bewijs dat herhaalde katheterisatie alleen de opkomst verhoogt, wat de interpretatie van de resultaten kan verstoren of grotere aantallen dieren kan vereisen om verschillen tussen blootstellingsgroepen en controles te onderscheiden. Ten slotte heeft de in situ blaasfixatiemethode verschillende kritieke stappen. Enige vaardigheid is vereist om ervoor te zorgen dat het fixatiemiddel in de geklemde blazen blijft. Leeggelopen blazen zullen moeilijker in beeld te brengen zijn door SEM. Het is ook essentieel om zeer voorzichtig te zijn bij het inenten van het fixatief in de blaas, omdat het schrapen van het urotheel met de fixatief-bevattende katheter urotheliale exfoliatie kan induceren, onafhankelijk van wat wordt veroorzaakt door G. vaginalis. Alle concentraties die in de fixatieve cocktail worden genoemd, zijn eindconcentraties. Onjuiste verhoudingen hiervan kunnen leiden tot onvoldoende fixatie en zwelling of krimp van de cellen. Fixatieven moeten worden verwarmd tot fysiologische temperaturen om temperatuurschok in cellen en weefsels te voorkomen. Opwarming zorgt ook voor een lichte verbetering van de diffusiesnelheid van fixatieven door plasmamembranen. Hoewel osmiumkleuring vaak kan worden weggelaten voor monsters die zijn voorbereid voor SEM-analyse, is het een essentiële stap in dit protocol om lipiden te stabiliseren en scheuren van cellulaire membranen tijdens het drogen van kritieke punten te voorkomen.

Dit protocol kan worden aangepast om andere UPEC- en/of G. vaginalis-stammen te testen op hun vermogen om reservoirs te vormen en hun opkomst te activeren. Andere experimentele factoren kunnen ook worden toegevoegd, zoals blootstelling aan andere vaginale bacteriën (bijv. Lactobacillus crispatus PVAS100) of hitte-gedode G. vaginalis, die geen van beide pathologie aantonen in dit model39. Bij het selecteren van andere bacteriestammen om te testen, is het belangrijk om een consistente groei aan te tonen, zodat een standaard entafconcentratie in alle experimenten kan worden gebruikt. De groei van JCP8151BSmR is geoptimaliseerd in een anaerobe kamer. Deze stam kan waarschijnlijk worden gekweekt in een anaeroob GasPak-systeem, maar dit vereist optimalisatie om robuuste bacteriegroei te garanderen. Ten slotte is het mogelijk om de timing van bepaalde stappen in het model te wijzigen. Urine kan bijvoorbeeld worden verzameld op eerdere tijdstippen tijdens de UPEC-reservoirvormingsfase om CFU- of gastheerresponsen te controleren. Een nadelig effect van het verzamelen van urinemonsters op vroege tijdstippen (3, 6, 12 hpi) op de progressie van infectie of het opzetten van reservoirs is niet waargenomen in dit model. Er is gemeld dat upec-reservoirs optreden na twee JCP8151BSmR-doses van 12 uur of 1 week, maar andere tijdsintervallen zijn nog niet getest. Het kan ook mogelijk zijn om de totale tijdsduur voor het model te verkorten door de UPEC-reservoirvormingsfase te verminderen tot 2 weken (in plaats van 4 weken), omdat veel van de muizen tegen die tijd bacteriurie hebben. Eerdere studies die de opkomst van UPEC onderzochten na blootstelling aan de blaas aan chemische exfolianten gebruikten een 1 of 2 wk UPEC-reservoirvormingsfase17,18. Het verminderen van de tijd voor de klaring van UPEC-bacteriurie kan echter ten koste gaan van de eis dat meer dieren uit het experiment worden geruimd. Ten slotte kan SEM-analyse van de blaas op extra tijdstippen worden uitgevoerd om de duur van het effect van G. vaginalis op het urotheel te observeren.

Met betrekking tot het oplossen van problemen zijn er enkele belangrijke overwegingen specifiek met betrekking tot de SEM-analyse van de blaas. Afhankelijk van de gebruikte muisachtergrond en de hoeveelheid aanwezige ontsteking, zullen sommige blazen zich presenteren met zeer dunne wanden. Deze blazen hebben de neiging om meer te krullen tijdens het drogen van kritieke punten en kunnen resulteren in een cowrie-schaalachtige vorm. Als dit gebeurt, is de beste methode om de schaalvormige blaas in tweeën te snijden langs de gekrulde interface en vervolgens een tweede keer om het grootste deel van het overhangende weefsel te verwijderen. Snijden werkt het beste met een PTFE-gecoat dubbelrand scheermesje. Overtollig vet kan soms oplossen tijdens de osmiumkleuringsstappen. Dit kan resulteren in ongewenste onoplosbare vetdruppels die mogelijk niet afspoelen tijdens de spoel- en uitdrogingsstappen en die zich tijdens het daaropvolgende drogen op het blaasoppervlak kunnen nestelen. Deze druppels kunnen verschijnen als kleine bolletjes of schijfachtige structuren verspreid over het monster (figuur 4D). Dit kan worden verzacht door ervoor te zorgen dat er zoveel mogelijk vetweefsel uit de omgeving van de blaas wordt verwijderd. Platina kan worden vervangen door iridiumcoating, maar diktes moeten tot een minimum worden beperkt om het maskeren van fijne structurele details te verminderen. Het gebruik van een roterende fase tijdens het coaten wordt ten zeerste aanbevolen.

Een beperking van dit model is dat het een groot aantal muizen vereist. Slechts 65-80% van de C57BL/6-muizen zal hun UPEC-bacteriurie opruimen en geschikt zijn voor daaropvolgende G. vaginalis of PBS-inenting (zie figuur 2C). Om 10-12 muizen per groep te verkrijgen (G. vaginalis inenting vs. PBS), moeten ~ 30 muizen in eerste instantie worden geïnfecteerd met UPEC. Verder zijn er waarschijnlijk meerdere experimenten nodig om de biologische replicaties te bereiken die nodig zijn om statistische significantie te detecteren. Wanneer blootstellingen 1 week uit elkaar kregen, trad UPEC-opkomst op bij 14% van de muizen die werden blootgesteld aan PBS (figuur 3B). Het detecteren van een significante toename van UPEC-rUTI bij G. vaginalis blootgestelde muizen ten opzichte van PBS-controles (aangedreven door 0,8; alfa = 0,05 [eenzijdig]) vereist dus het testen van een cumulatief totaal van ten minste 40 muizen voor elke blootstellingsgroep. Een bijkomende overweging is dat deze experimenten duur en arbeidsintensief zijn. Muizen moeten wekelijks worden gecontroleerd op UPEC-klaring en het experimentele tijdsverloop is 4-5 week, afhankelijk van het feit of G. vaginalis tweemaal in een tijdsbestek van 12 uur of tweemaal 1 week uit elkaar wordt gegeven. SEM is arbeidsintensief en kan duur zijn, afhankelijk van de beschikbaarheid van microscoop en servicekosten. Het voorbereiden van de hele blaas op SEM biedt overvloedig materiaal voor analyse, maar het nadeel is dat het analyseren van elke blaas tijdrovend kan zijn. Het is dus waarschijnlijk dat slechts een beperkt aantal blazen kan worden geanalyseerd door SEM in vergelijking met de hogere dieraantallen die worden gebruikt voor urine- en weefseltiters. Bovendien vereist het verkrijgen van hoogwaardige afbeeldingen van de gebogen oppervlakken van de blaas “kopjes” vaardigheid vanwege schaduwen die het zicht kunnen belemmeren. Hoewel blaas SEM een nuttig hulpmiddel is voor het visualiseren van urotheliale exfoliatie, is deze methode grotendeels kwalitatief. Omdat het monster in een ronde vorm is gefixeerd en vanwege het gebruik van glutaaraldehyde in het fixatiemiddel, is screening op fluorescerend tot expressie brengende bacteriën via lichtmicroscopie niet mogelijk. Immunostaining en chemische kleurstoffen zijn onverenigbaar met dit proces vanwege het gebruik van glutaaraldehyde dat de meeste antigenen en osmium zal kruisen en dat antigeenplaatsen zal maskeren en het weefsel donkerder zal maken. Dat gezegd hebbende, is de SEM-techniek nuttig voor parameters die kwantitatief kunnen worden geëvalueerd zonder het gebruik van extra sondes, zoals celgrootte48,49.

Dit model biedt verschillende voordelen die verder gaan dan eerder beschreven methoden. Het maakt het onderzoek mogelijk van mechanismen van UPEC rUTI veroorzaakt door opkomst uit blaasreservoirs, in tegenstelling tot herintroductie in de blaas vanuit een externe bron. Andere modellen van rUTI als gevolg van opkomst uit blaasreservoirs gebruiken chemische middelen (protaminesulfaat of chitosan) om urotheliale exfoliatiete veroorzaken 17,18, wat geen triggers van rUTI bij vrouwen zou zijn. G. vaginalis is een veel voorkomende urogenitale bacterie die is gedetecteerd in urine die rechtstreeks uit de blaas wordt verzameld via katheterisatie of suprapubische aspiratie bij sommige vrouwen23,26. Dit feit, in combinatie met de bekende associatie tussen BV (waarbij G. vaginalis overgroeit in de vagina) en UTI, suggereert dat G. vaginalis een klinisch plausibele trigger van rUTI is. Ten slotte behoudt de in situ blaasfixatiemethode de ultrastructuur van de blaas en beperkt schade, zodat de blaaslagen niet van elkaar scheiden. Eerdere methoden voor het visualiseren van het urotheel hebben traditioneel de gebruiker aseptisch geoogst, bisect, stretch en pin de blaas op een dissectiebak voordat de uitgerekte blaas wordt ondergedompeld in fixatief48. Deze methode resulteert in een zeer plat monster, maar zorgt niet voor een gelijkmatige of natuurlijke uitrekking van het weefsel en kan resulteren in gebieden die over en onder uitgerekt zijn (wat resulteert in zeer gerimpeld weefsel) en kan blaaslaagscheiding veroorzaken. Bovendien kunnen deze fysieke manipulaties van de blaas om het weefsel uit te rekken en vast te pinnen schade veroorzaken, waaronder urotheliale exfoliatie. Een andere methode is om intacte blazen onder te dompelen in fixatief voordat ze in paraffine worden ingebed en dunne secties krijgen met een microtoom. Dunne secties zijn van onschatbare waarde voor immunohistochemische experimenten om bacteriën en gastheereiwitlokalisatie te onderzoeken, maar een dunne sectie maakt visualisatie van het urotheliale oppervlak niet mogelijk. Met deze SEM-methode kan het oppervlak van de gehele blaas in één keer worden onderzocht.

Zoals beschreven, omvatten toekomstige toepassingen van dit model het testen van andere UPEC-stammen om te bepalen of ze intracellulaire reservoirs vormen en het testen van andere G. vaginalis-stammen om te beoordelen of ze exfoliatie en UPEC-opkomst veroorzaken om rUTI te veroorzaken. Andere muizenstammen dan C57BL / 6-muizen kunnen ook worden getest, hoewel muizen met een hoge neiging tot het ontwikkelen van chronische cystitis (zoals muizen op de C3H-achtergrond) niet worden aanbevolen, omdat te veel muizen uit het experiment zouden moeten worden geruimd. Een bijkomend voordeel van C57BL/6 muizen is dat veel genetische knock-out stammen in de handel verkrijgbaar zijn. Dergelijke stammen bieden de mogelijkheid om de gastheerfactoren te onderzoeken die betrokken zijn bij de vorming en/of opkomst van reservoirs.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Lynne Foster voor technische hulp bij infectie-experimenten, James Fitzpatrick van het Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) voor toegang tot de SEM, Scott Hultgren voor de UTI89kanR UPEC-stam en David Hunstad voor het kritisch lezen van het manuscript.

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE – 1143954), door het Center for Women’s Infectious Disease Research aan de Washington University School of Medicine (Pilot Research Award to NMG), door de American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) and #14POST20020011 (NMG), en door de National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) en NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, project II PI:ALL) en K01 DK110225-01A1 (NMG). Sommige van de dierstudies werden uitgevoerd in een faciliteit die wordt ondersteund door NCRR-subsidie C06 RR015502. Het Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; waar SEM werd uitgevoerd) en MSJ werden ondersteund door de Washington University School of Medicine, het Children’s Discovery Institute van de Washington University en het St. Louis Children’s Hospital (CDI-CORE-2015-505), de Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) en het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

Materials

30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t., et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329 (2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327 (2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586 (2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394 (2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341 (2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283 (2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99 (2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757 (2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  39. Gilbert, N. M., O’Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238 (2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042 (2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892 (2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070 (2010).
  48. O’Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196 (2016).
  49. O’Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457 (2018).

Tags

Recurrent UTIEscherichia ColiGardnerella VaginalisBladder ExposureMouse ModelUrogenital BacteriaBladder ExfoliationAnaerobic CultureBacterial InoculumUrine AnalysisCytospinPMNsEpithelial CellsCatheterizationBladder Exposure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
O’Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image