재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

워싱턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 프로토콜 번호 20170081의 일부로 모든 마우스 감염 및 절차를 승인했으며, 이는 2020 년 6 월 9 일 만료되었으며 20-0031 년 3 월 18 일 만료되었습니다. 동물의 전반적인 보살핌은 국가 연구위원회 및 USDA 동물 관리 자원 가이드의 실험실 동물 관리 및 사용을위한 가이드와 일치했습니다. 안락사 절차는 동물 안락사에 대한 AVMA 지침: 2020 에디션과 일치합니다. 그림 1. 마우스 모델의 회로도. 타임라인은 프로토콜에 설명된 모델의 단계 또는 절차를 반영하도록 강조 표시됩니다. 1 단계 (오렌지) : 세포 내 UPEC 저수지 구축. 마우스는 UPEC로 경요도 접종되고 소변 샘플은 박테리아뇨의 클리어런스를 위해 수집되고 모니터링됩니다. 박테리아뇨를 제거하는 마우스 만이 후속 단계로 진행됩니다. 2 단계 (녹색) : G. 질에 방광 노출. 마우스는 G. 질염으로 두 번 경요도로 접종됩니다. 두 순차적 노출 사이의 지속 시간은 원하는 다운스트림 분석에 따라 12시간(상단 패널) 또는 1주(wk; 하단 패널)입니다. 3 단계 (노란색) : UPEC rUTI. 소변은 G. 질 노출 후 매일 수집되며 UPEC 박테리아뇨를 모니터링합니다. 추가적으로, 방광 및 신장은 UPEC 조직 역가를 측정하기 위해 실험 종점에서 수집될 수 있다. 1 wk 노출 모델에서, G. 질리-유도된 세포내 저장소로부터의 UPEC의 출현 및 요로로부터의 후속 클리어런스는 또한 UPEC 방광 조직 역가의 감소에 반영된다 (PBS 노출 마우스와 비교하여, 도 3D 참조). 방광 역가의 이러한 감소는 12시간 노출 모델에서 명백하지 않았으며, 아마도 조직 역가를 유의하게 감소시키기 위해 충분한 저장소 출현 및 클리어런스가 일어나기 위해 더 많은 시간이 요구되기 때문일 것이다. 절차 A : 소변 세포학은 일반적으로 급성 UPEC 감염을 검사하기 위해 1 단계 동안 1 dpi (또는 그 이전)를 수행하고 UPEC 출현과 관련된 소변 PMN 함량을 평가하기 위해 3 단계 동안 수행됩니다. 다른 시점에서 수집된 소변 샘플은 유사하게 분석될 수 있다. 절차 B: 비뇨생식기 박리를 검사하기 위한 방광 주사 전자 현미경(SEM)은 전형적으로 두 번째 G. 질 노출 후 3h에서 12시간 모델에서 수행된다(시간 0에서 첫 번째 노출을 투여한 후 15시간). 다른 시간점들, 예컨대 단계 1에 나타낸 바와 같이 UPEC 접종 후 6-24 h와 같은 평가될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1. 마우스에 UPEC 정지 세포 내 저장소를 구축하십시오. 요로 카테터를 준비하십시오 (이 단계의 비디오는 44,45,46,47 참조). 바늘 바닥에서 바늘 끝을 넘어 몇 mm까지 연장되는 PE10 튜브 길이의 스레드 30 게이지 바늘. 바늘 끝으로 튜브에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 또는 소아 정맥 내 캐뉼라(46)를 사용하십시오. 준비된 카테터를 페트리 접시에 넣고 적어도 30 분 동안 자외선으로 살균하십시오. 페트리 접시 뚜껑을 교체하고 필요할 때까지 보관하십시오. UPEC 접종 준비 (하루 -3 ~ 0 일) 제-3일: UTI89kanR 을 -80°C 냉동고 스톡으로부터 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트 상에 스트리킹한다. 플레이트를 37°C에서 18-24시간 동안 인큐베이션한다.참고: 카나마이신 내성이 UTI89kanR에 안정적으로 통합되기 때문에 카나마이신을 접종 성장 배지에 첨가할 필요는 없다. 제-2일: 멸균된 125 mL 플라스크에 LB 브로스 20 mL를 UTI89kanR의 단일 콜로니로 접종한다. 이러한 배양 방법은 방광 접착에 필요한 UPEC 타입 1 필루스의 발현을 유도하는데 중요하기 때문에 더 작은 플라스크를 사용하지 마십시오. 37°C에서 18-24시간 동안 정적으로 (흔들림 없이) 인큐베이션한다. 성장 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오. LB 플레이트 (18-24 시간 이전)에 신선한 식민지 만 사용하여 액체 배양을 시작하십시오. 제1일-1일: UTI89kanR 20 μL의 배양물을 제거하고(침전된 박테리아를 재현탁시키기 위해 플라스크를 부드럽게 소용돌이치게 함) 멸균된 125 mL 플라스크에 신선한 LB 브로스 20 mL를 첨가하였다. 확고한 18 h 지속 기간을 제외하고 단계 2에서와 같이 인큐베이션한다. 성장 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오. 제0일: 전체 배양물을 50 mL 튜브로 옮기고 3200 × g 에서 탁상용 원심분리기에서 10분 동안 스핀하여 박테리아를 펠릿화한다. 흡인물 상청액을 박테리아 펠렛을 PBS 10 mL에 재현탁시켰다. 단계 4에서 900 μL의 PBS까지 농축된 박테리아 현탁액 100 μL를 큐벳에 첨가하고, PBS로 블랭킹된 분광광도계를 사용하여 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도를 결정하였다. 분광 광도계 값에 10을 곱하여 (희석을 고려하여) 현탁액 (OD현탁액)의OD600을 결정하십시오. 50 μL에서 1 x 107 CFU의 원하는 접종 농도를 달성하기 위해, 다음 방정식을 사용하여 UTI89kanR 현탁액을 희석 (또는 농축)하고, 여기서 원하는 OD접종 물은 0.35 (값은 다른 UPEC 균주에 대해 변할 수 있음) 및 Y는 필요한 접종물의 부피 (기포를 제거하고 카테터를 채우기 위해 추가로 허용하기 위해 마우스 당 100 μL)이다.X mL x OD현탁액 = Y mL x OD접종물예를 들어, OD현탁액 값이 4.7이고 5 mL의 접종이 필요한 경우:X mL × 4.7 = 5 × 0.35X = (5 × 0.35) / 4.7X = 0.372 mL따라서 박테리아 현탁액 372 μL를 첨가하여 5 mL (최종 부피)를 만드십시오. 다중 채널 피펫을 사용하여 접종물의 1:10 연속 희석액을 96-웰 플레이트에서 멸균 PBS 중에서 10-6 으로 만든다. 모든 6개의 희석물을 LB 및 LB+kan 플레이트 상에 5개의 10 μL 반복실험으로 스팟하고, 스팟을 건조시키고, 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 항생제가없는 LB 플레이트는 접종물이 다른 유기체에 의해 오염되지 않았 음을 보장하기 위해 사용됩니다 (이는 kan 항생제 선택 플레이트에 존재하지 않는 추가적인 콜로니 형태학으로 나타날 것입니다). 두 플레이트 유형 모두 동일한 결과를 산출해야합니다.참고 : 플레이트는 사용하기 하루 전에 벤치 탑에서 건조시켜 반점이 합착되지 않고 도금 된 액체를 흡수 할 수 있도록해야합니다. 구별 가능한 콜로니로 희석의 모든 스팟에서 콜로니의 총 수를 계산하고 값을 사용하여 각 실험에 사용 된 실제 접종 용량을 계산하십시오. 단순히 OD600 값에 의존하지 마십시오. UTI89kanR 을 마취 된 암컷 마우스의 방광에 접종하십시오 (Day 0)참고: 이 절차의 비디오 녹화는 이전에게시되었습니다 44,46. 보다 자세한 설명은 이 논문을 참조하십시오. 마우스 카테터 삽입에 대한 자세한 내용은 이 프로토콜의 섹션 5를 참조하십시오. IACUC가 승인 한 방법에 따라 이소 플루란 흡입으로 마우스를 마취하십시오. 마우스가 마취되기를 기다리는 동안, UTI89kanR 접종물로 투베르쿨린 주사기를 채운 다음 준비된 카테터를 부착한다. 플런저를 눌러 카테터에서 공기를 비운 다음 카테터를 멸균 수술 윤활제에 담그십시오. 마우스를 뒤쪽에 놓고 마우스 풋패드를 단단히 쥐어 짜내고 반사 또는 반응의 부재를 관찰하여 마취를 확인합니다. 각 손의 검지 사이에 방광 (하복부의 완두콩처럼 느껴짐)을 찾습니다. 손가락을 서로 향하게 움직여 소변을 표현하여 방광에 부드러운 압박감을 가합니다. 마우스 요도를 통해 카테터를 방광에 넣고 50 μL의 접종물을 천천히 전달하십시오. 몇 초 정도 기다린 다음 카테터를 똑바로 잡아당겨 부드럽게 제거합니다. 마우스를 케이지로 돌려 놓고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 추가 마우스와 함께 1.3.1 – 1.3.5 단계를 반복하여 각 케이지 (5 마우스) 사이의 카테터를 변경하십시오. 원하는 경우, 동일한 절차가 PBS로 마우스의 대조군을 접종하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 G. 질 리스의 또 다른 균주가 rUTI를 이끌어내는 것을 보여주기 위해 (자발적/배경 수준 이상). 2. UPEC 세균뇨증의 통관 모니터링 (1일~28일) 참고: 소변 수집 절차의 비디오는 이전에44에 게시되었습니다. 감염 후 1 d에서 그리고 매주 4 wk (감염 후 7, 14, 21 및 28 d) 동안44에 기재된 바와 같이 방광 촉진에 의해 모든 마우스로부터 소변 (최소 10 μL)을 수집한다. 소변은 UPEC 감염을 모니터링하기 위해 수집 후 몇 시간 이내에 배양해야합니다. 플레이팅될 때까지 소변을 4°C에서 보관하십시오. 소변은 또한 세포학에 사용될 수 있습니다 (섹션 4 참조). 때때로 방광에 염증이 심하면 10 μL의 소변을 얻을 수 없습니다. 이 경우 PBS는 최대 10 μL까지 첨가될 수 있지만, 소변 세균 역가 및 세포학 점수는 그에 따라 조정되어야 한다(예를 들어, 단지 5 μL 소변이 수집되고 5 μL PBS가 첨가되는 경우, 역가 및 스코어를 2로 곱함). 다중 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에서 멸균 PBS에서 1:10 연속 희석액을 10-6으로 만듭니다. P10 다중 채널 피펫을 사용하여 관련 항생제 선택 마커를 함유하는 LB 플레이트의 왼쪽 가장자리에 수직 배향으로 컬럼 1로부터의 모든 6개의 희석물 중 10 μL를 스팟팅한다. 팁을 버리십시오. 나머지 샘플(컬럼 2, 컬럼 3 등)으로 도금을 반복합니다. 단일 플레이트는 5 개의 샘플을 나란히 수용 할 수 있습니다. 이렇게 하면 5 × 6 스폿 매트릭스가 있는 플레이트가 생성되며, 위에서 아래로 희석이 증가하고 샘플 수가 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다(그림 2A). 스팟을 벤치탑에서 건조시키고, 이어서 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 다음 날, 콜로니가 구별되는 최소 희석 지점에 있는 콜로니의 수를 계산하고(그림 2B), 이 숫자를 사용하여 CFU/mL를 계산합니다.단일 소변 스폿 × 희석 인자 × 100 = CFU/mL 소변에서의 콜로니 수 그래프 소프트웨어를 사용하여 UTI89kanR 소변 역가를 플롯합니다(그림 2C). 28d에서 소변에서 검출 가능한 UTI89kanR 이없는 마우스를 확인하십시오 (C57BL / 6 마우스의 ~ 65-80 %). 이 마우스는 정지 된 세포 내 저장소를 보유하고 있으며 재발 성 UTI의 유도를 검사하기 위해 후속 실험 단계에서 사용됩니다. 28d에서 소변에 박테리아가있는 사람들은 후속 단계에 포함되지 않습니다. 3. G. 질염에 대한 방광 노출 마우스를 노출 그룹에 배정합니다 (Day 29). 이 단계의 주요 목표는 더 장기간의 박테리아뇨를 가진 모든 마우스가 동일한 노출 그룹에서 함께 갖는 것을 피하는 것인데, 이는 이것이 rUTI의 가능성에 영향을 미치는지 여부는 알 수 없기 때문이다. 소변 CFU 데이터(도 2D)를 사용하여, UTI89kanR 세균뇨가 더 이상 검출가능하지 않은 시점을 기준으로 마우스를 분류한다(도 2E). 마우스를 각 카테고리로부터 G. 질 또는 PBS 접종 그룹 중 하나로 무작위화하고; 예를 들어, 7 일째 전에 클리어 한 마우스의 절반은 G. 질염 을 얻고 절반은 PBS를 얻습니다. 8일에서 14일 사이에 클리어한 마우스의 절반은 G. 질염 을 얻을 것이고, 절반은 PBS 등을 얻을 것이다( 도 2E에서와 같이). G. 질 접종 준비 (혐기성 챔버에서 수행 된 모든 단계)참고 : 이상적인 배양 시간은 G. vaginalis의 다른 균주에 따라 다르며, 일부 균주는 정지 단계에 들어가고 심지어 다른 균주보다 더 빨리 죽기 시작합니다. 이것은 죽인 G. 질염 (JCP8151B)이 rUTI39를 촉발시킬 수 없다는 점을 고려할 때 특히 중요하다. 따라서, 인큐베이션 시간은 마우스에서 실험을 수행하기 전에 주어진 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. G. vaginalis 의 다른 / 모든 균주가이 모델에서 동일한 효과를 유발하는지 여부는 알 수 없습니다. 줄무늬 G. 질 균주를 -80°C 냉동고 스톡에서 NYCIII 플레이트 상으로 (항생제 없음). 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 혐기적으로 인큐베이션한다. 혐기성 챔버에서, 5 mL의 혐기성 NYCIII 배지를 NYCIII 플레이트로부터 1 μL 루풀한 세포 (단일 콜로니가 불충분함)로 접종하고, 18시간 동안 혐기성 조건 하에서 37°C에서 정적으로 배양배양한다. 성장 배지에 항생제를 포함하지 마십시오. 분광광도계를 이용하여 배양물의OD600 을 결정한다. 배양물의 정의된 부피(X)를 9600 × g 에서 1분 동안 원심분리하고, 배지를 흡인한다. 다음 방정식을 사용하여 50 μL에서 108 CFU를 달성하기 위해 원하는 접종물 OD를 달성하기 위해 펠렛을 재현탁시키는 PBS의 부피 (Y)를 계산하십시오.X mL × OD배양 물 = Y에 대한 Y mL × OD접종물 해결Y = (X ml × OD배양물) / OD접종물참고: JCP8151BSmR에 대한 OD접종은 5이지만 이것은 다른 G. 질 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 예를 들어, 3 mL의 JCP8151BSmR을 OD 배양으로 밤새 액체배양하여 방사하는 경우 = 2.0:Y=(3 mL × 2.0)/5.0; 따라서 펠렛을 1.2 mL PBS에 재현탁시킨다. 박테리아 펠렛을 PBS에 원하는 농도로 재현탁시킨다. 접종물을 연속적으로 희석하고 플레이트 (상기 CFU 도금 프로토콜에 기재된 바와 같이) 각 실험에 사용된 실제 접종 용량을 결정한다. 단순히 OD 값에 의존하지 마십시오. UPEC 접종 후 29-31일째에, 마취된 마우스를 상기 단계 1.3에 기재된 바와 같이 G. 질 또는 PBS로 접종한다. PBS 대조군은 방광을 카테터화하는 행위가 UPEC 저장소의 어느 정도 재발을 유도 할 수있는 손상 및 비뇨 생식기 박리를 유도 할 수 있기 때문에 필수적입니다. 따라서 PBS-접종된 마우스는 G. vaginalis-접종된 마우스가 비교되는 대조군으로서 작용한다.참고: 28d에서의 최종 UPEC 세균뇨 결정은 CFU 플레이트의 하룻밤 인큐베이션이 필요합니다. 따라서, 이 단계가 수행될 수 있는 가장 빠른 단계는 초기 UPEC 접종 후 29일이다. 필요한 경우, 노출은 31 일째만큼 늦게 주어질 수 있습니다. 연구원은 실험간에 일관성이 있어야합니다. 제2 G. 질염 (또는 PBS 대조군) 접종을 제1 접종 후 12 h 또는 1 wk와 같은 원하는 시점에서 투여하기 위해 접종 제제를 반복한다. 두 번째 노출은 G. 질염을 가진 단일 접종 이 상당한 UPEC 출현(39)을 초래하지 않기 때문에 필요하다. 4. UPEC 재발 UTI 모니터링 각 G. 질 접종 후 원하는 시점에 마우스로부터 소변을 수집하십시오 (1, 2 및 3 d 접종 후 권장 됨). UTI89kanR CFU/mL를 결정하기 위해 선택적 플레이트(예를 들어, LB+카나마이신)에 연속적으로 희석 및 플레이트 소변을 묬. 원하는 경우, 소변 희석물을 선택적 플레이트 (예를 들어, NYCIII + 1 mg/mL 스트렙토마이신)에 플레이팅하여 G. vaginalis CFU/mL를 결정할 수도 있다. 그러나, G. 질 JCP8151BSmR 은 12시간 39분에 의해 대부분의 마우스의 소변으로부터 제거되었다. 따라서 대부분의 마우스에서 G. vaginalis 를 검출하기 위해서는 초기 시점이 필요합니다. 실험 종말점에서(예를 들어, 제2 G. 질내 접종 후 3 d), 승인된 방법(예를 들어, 이소플루란 마취 또는CO2 흡입 하에서의 자궁경부 탈구)에 따라 마우스를 희생시키고, 앞서 기술된 바와 같이 CFU 열거를 위해 방광 및 신장을 수집한다 44,46. 5. 소변 세포학 참고: 이 절차는 소변에 존재하는 세포 및/또는 박테리아의 시각화가 필요한 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 소변 세포학은 일반적으로 급성 UPEC 감염을 검사하기 위해 1상 동안 1dpi(또는 심지어 그 이전)에서 수행되고, UPEC 출현을 나타내는 소변에서 다형핵(PMN) 세포의 존재를 평가하기 위해 3상 동안 수행된다. 90 μL의 PBS에 10 μL의 소변을 부착된 필터 및 슬라이드가 부착된 시토깔때기 카세트에 첨가한다. (가장 간단한 방법은 소변 배양에 사용되는 96-웰 플레이트의 1:10 희석액의 나머지를 사용하는 것입니다. 이러한 샘플은 4 °C에서 보관하면 소변 배양 후 최대 24 시간까지 사용할 수 있습니다). 카세트를 세포 원심 분리기에 넣고 600-800 x g 에서 6 분 동안 높은 가속으로 회전시킵니다. 슬라이드를 제거하고 하룻밤 사이에 말리십시오. 다음날, 제조자의 프로토콜에 따라 혈액학 염색 키트(예를 들어, 라이트스, 지엠사, 고정제 포함)로 염색한다. PMN 및 상피 세포의 존재에 대해 광 현미경으로 슬라이드를 분석하십시오. 원한다면, 이들은 각각의 고출력 시야에 존재하는 각 세포 유형의 풍부함에 기초한 정성적 스코어링 메트릭을 사용하여 스코어링될 수 있다(예를 들어, 0=없음, 1=적음, 2= 보통, 3=견고함). 슬라이드를 분석하는 개인이 잠재적 편향을 최소화하기 위해 실험 그룹에 눈이 멀었는지 확인하십시오. 6. 주사 전자 현미경에 의한 방광 이미징 참고: 이 절차는 요로텔륨의 시각화가 필요한 모든 시점에서 수행할 수 있습니다. 그림 1 (보라색 상자)에 표시된 바와 같이, UPEC-비뇨 생식기 상호 작용은 저수지 형성 단계 동안 UPEC 접종 후 6 h와 24 h 사이에서 가장 잘 시각화되며, G. 질염에 의해 촉발 된 비뇨 생식기 박리는 두 번째 G. 질 노출 후 3 h와 12 h 사이에서 가장 잘 시각화됩니다. 현장 방광 고정 pH 7.4에서 2mM의 CaCl2와 함께 0.15M 소듐 카코딜레이트 완충액에 글루타르알데히드(2.5% 최종)와 파라포름알데히드(2 % 최종)를 첨가하여 방광 수확 직전에 고정제를 제조하였다. 새로 열린 유리 앰플에서 파라포름 알데히드와 글루타르 알데히드를 사용하십시오.이 두 고정제는 열린 용기에서 시간이 지남에 따라 산화됩니다.주의: 글루타르알데히드는 독성이 있고, 호흡기 자극제이며, 부식성이 있습니다. 파라포름알데히드는 가연성, 발암성, 자극제 및 생식 독소이다; 카코딜레이트 나트륨은 독성이 있고 발암성입니다. 50 mL의 고정 용액을 만들기 위해, 6.25 mL의 16% 파라포름알데히드, 2 mL의 50% 글루타르알데히드, 및 16.75 mL의 초순수를 4 mM CaCl2로 pH 7.4에서 카코딜레이트 나트륨의 0.3 M 용액25 mL에 첨가한다. 방광에 투여하기 전에 제조된 고정제를 37°C로 가온한다. 투베르쿨린 슬립 팁 주사기를 고정제로 채우고 카테터를 끝에 부착하고 반대쪽 주사기 표시를 향한 경사를 붙입니다. 바늘 끝에서 1-2 mm 정도 과도한 튜브를 잘라내어 바늘 팁이 노출되지 않도록주의하십시오. 주사기를 플릭하여 거품을 제거하고 플런저를 밀어 공기를 비우고 카테터를 마이크로 원심분리 튜브 위에 고정제로 채워 적절한 폐기를 위해 고정 장치를 수집하십시오. 마취시키고 승인된 방법을 사용하여 마우스를 희생시킨다(예를 들어, 마취 하에서의 자궁경부 탈구). 다리를 고정한 상태에서 해부 표면에 마우스를 놓습니다(고무 밴드 또는 핀 사용). 포셉과 한 쌍의 외과 용 가위로 마우스 골반 부위를 열어 방광을 노출시킵니다. 조심스럽게 인접한 지방을 옆으로 밀고 방광을 제자리에 두십시오. 바늘이 아래를 향하게하고 바늘 경사와 주사기 표시가 당신에게서 멀어지는 것을 마주 보는 지배적 인 손으로 주사기를 잡으십시오. 카테터 팁을 멸균 윤활제에 담그십시오. 카테터 끝을 요도 개구부에 놓고 주사기 배럴을 마우스 몸체 위로 30-45° 각도로 위치시킵니다. 팁과 함께 매우 작은 시계 방향 움직임을 사용하여 아래쪽으로 압력을 가하고 카테터를 요도에 부드럽게 삽입하십시오. 카테터 팁이 요도에 들어가면 주사기 배럴이 작동 표면과 평행 할 때까지 카테터를 요도 내로 계속 밀어 넣으면서 주사기를 마우스의 꼬리쪽으로 경첩하십시오. 전체 카테터 바늘 샤프트 (베이스를 포함하지 않음)가 마우스에 들어가서 카테터 팁을 방광 루멘 내에 위치시켜야합니다. 천천히 50-80 μL의 고정제를 전달하여 방광이 풍선처럼 팽창하게합니다. 카테터를 제자리에 유지하고 주사기를 약간 들어 올려 팁을 위로 기울이십시오. 다른 한편으로는, 지혈제를 열고 요도의 교차점에있는 카테터 바늘 아래에 하나의 단자를 밀어 넣습니다. 바늘과 접촉 할 때까지 지혈제를 부분적으로 닫으십시오. 카테터 바늘을 방광 밖으로 부드럽게 밀어 내면서 동시에 지혈제를 완전히 단속하고 잠그면 고정제의 손실을 방지합니다. 지혈제를 잡아서 방광이 위에 놓인 상태에서 작업 표면과 평행하도록하십시오. 부드럽게 들어 올려 지혈제 (방광의 반대편) 아래로 조심스럽게 잘라 지혈제가 여전히 부착 된 방광을 제거하십시오. 방광을 놓고 지혈제를 따뜻한 고정제가 들어있는 팔콘 튜브에 부착하십시오. 방광이 유체에 완전히 잠겨 있고 튜브 벽에 눌리지 않도록하십시오. 4°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 방광 처리 및 주사 전자 현미경 (SEM)을 통한 이미징 청소 된 양면 면도날로 방광을 양면하고 지혈제에 접하는 두 번째 컷을 만들어 방광을 방출하십시오. 이로 인해 2 개의 반 방광 “컵”이 생깁니다. 방광 외부에 남아있는 뚱뚱한 패드가 있으면 부드럽게 제거하십시오. 방광 반쪽을 소듐 카코딜레이트 완충액 (0.15 M, pH 7.4)에서 세 번 (각각 10 분) 헹구십시오. 조직을 실온에서 1 h 동안 0.15 M 카코딜레이트 완충액 중의 1% 오스뮴 테트록사이드로 착색시킨다. 오스뮴은 빛에 민감합니다. 따라서, 어두운 환경을 유지하기 위해 호일에 싸인 염색 용기로 이 단계를 수행하십시오.주의: 오스뮴 테트록사이드는 피부에 독성이 있고 부식성이 있습니다. 장갑으로 흄 후드에서이 단계를 수행하십시오. 방광 반쪽을 초순수로 세 번 (각각 10 분) 헹구십시오. 이 단계 동안, 삼투 된 오일은 언젠가 물 표면에서 볼 수 있습니다. 건조 단계 동안 오염을 방지하기 위해 흡인물 또는 이를 윅 오프하십시오. 등급화된 에탄올 시리즈(50, 70, 90, 100, 및 100%)를 각각 10분 동안 침수시켜 조직을 탈수시킨다. 고정된 조직을 임계점 건조기를 사용하여 건조시키고 가장 느린 속도로12CO2 교환을 수행한다. 빠름으로 설정된 배출 단계를 제외하고 모든 추가 설정을 느리게 설정하십시오. 깨끗한 양면 면도기로 각 방광을 다시 반쯤 양면하여 시편의 곡률을 줄이기 위해 총 4 개의 조각을 생성하여보다 효율적인 코팅을 위해, SEM에서의 이미징의 용이성을 위해, 건조 중에 말렸을 수있는 조직을 노출시킵니다. 방광 조각을 알루미늄 스터브의 전도성 탄소 접착제 탭에 부착하고 이쑤시개와 접촉하는 바닥 주위에 소량의 은색 접착제를 페인트하여 과도한 접착제가 방광의 내부 표면에 위킹되는 것을 방지하도록주의하십시오. 고진공 스퍼터 코터를 사용하여 샘플 스터브를 6nm의 이리듐으로 스퍼터 코팅하십시오. 샘플이 계속 충전되면 은색 페인트로 표면에 전도성 경로를 칠하고 추가 4nm의 이리듐으로 코팅하십시오. 주사 전자 현미경으로 샘플을 이미지화하십시오. 사용 된 현미경에 따라 조건이 다를 수 있지만 빔 전류가 200pA이고 작동 거리가 12-13mm인 3KeV의 가속 전압은 Everhart-Thornley (SE2) 전자 검출기를 사용할 때 Zeiss Merlin FE-SEM에서 잘 작동했습니다.