由加德纳菌阴道膀胱暴露在小鼠中引发的复发性大肠杆菌尿路感染

华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有小鼠感染和程序，作为协议号20170081的一部分，该协议于06/09/2020到期，20-0031于2023年3月18日到期。动物的整体护理与国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》和美国农业部的《动物护理资源指南》一致。安乐死程序符合AVMA动物安乐死指南：2020年版。 图 1.小鼠模型示意图。突出显示时间线以反映协议中概述的模型的阶段或过程。阶段 1（橙色）：建立细胞内优沛接触液储层。将小鼠经尿道接种UPEC，并收集尿液样本并监测菌尿的清除。只有清除菌尿的小鼠才会进入随后的阶段。第 2 阶段（绿色）：膀胱暴露于阴道 G.小鼠经尿道接种阴道毛果杆菌两次。两个连续暴露之间的持续时间为12小时（顶部面板）或1周（wk;底部面板），具体取决于所需的下游分析。第 3 阶段（黄色）：优必凯鲁蒂。阴道 G. 暴露后每天收集尿液，并监测 UPEC 菌尿。此外，可以在实验终点收集膀胱和肾脏以测量UPEC组织滴度。在1周暴露模型中，阴道芽孢杆菌诱导的UPEC从细胞内储液囊中出现以及随后从尿路清除也反映在UPEC膀胱组织滴度的降低中（与PBS暴露的小鼠相比，见图3D）。膀胱滴度的这种降低在12小时暴露模型中并不明显，可能是因为需要更多的时间才能发生足够的储液槽和清除，以显着降低组织滴度。 程序A：通常在1期期间进行1 dpi（甚至更早）的尿液细胞学检查，以检查急性UPEC感染，并在第3阶段进行以评估尿液PMN含量，这与UPEC的出现相关。在其他时间点收集的尿液样本可以进行类似的分析。 程序B：膀胱扫描电子显微镜（SEM）检查尿路上皮去角质通常在第二次阴道G暴露后3小时（在时间0施用第一次暴露后15小时）在12小时模型中进行。还可以评估其他时间点，例如UPEC接种后6-24小时，如第1阶段所示。请点击此处查看此图的大图。 1. 在小鼠中建立UPEC静止细胞内储库 准备导尿管（有关此步骤的视频，请参阅44，45，46，47）。 螺纹 30 号针，带 PE10 管的长度，从针基延伸到针尖以外的几毫米。注意不要用针尖刺穿管子。或者，使用小儿静脉插管46。 将准备好的导管放入培养皿中，用紫外线消毒至少30分钟。更换培养皿盖并固定存放，直到需要。 准备UPEC接种物（第-3天至第0天） 第-3天：从-80°C冷冻库到卢里亚 – 贝塔尼（LB）琼脂平板上的条纹UTI89kanR 。将板在37°C孵育18-24小时。注意：没有必要将卡那霉素添加到接种物生长培养基中，因为卡那霉素耐药性稳定地整合到UTI89kanR中。 第-2天：在无菌的125 mL烧瓶中接种20 mL LB肉汤，其中单个菌落为UTI89kanR。 不要使用较小的烧瓶，因为这种培养方法对于诱导膀胱粘连所必需的UPEC 1型毛疧的表达很重要。 在37°C下静态孵育（不摇晃）18-24小时。不要在生长培养基中添加抗生素。仅在LB平板（18-24小时龄）上使用新鲜菌落开始液体培养。 第-1天：通过去除20μL培养物（轻轻旋转烧瓶以重悬沉的细菌）并在无菌的125mL烧瓶中加入20mL新鲜LB肉汤来传代培养UTI89kanR 。按照步骤2孵育，但固定的18小时持续时间除外。不要在生长培养基中添加抗生素。 第0天：将整个培养物转移到50 mL管中，并在台式离心机中以3200× g 旋转10分钟以沉淀细菌。吸出上清液并将细菌沉淀重悬于10mL PBS中。 在比色皿中加入步骤4至900μLPBS的浓缩细菌悬浮液中的100μL，并使用已用PBS消光的分光光度计测定600nm（OD 600）处的光密度。将分光光度计值乘以10（以考虑稀释量）以确定悬浮液（OD悬浮液）的OD600。 为了在50μL中达到所需的接种物浓度为1 x 107 CFU，请使用以下等式稀释（或浓缩）UTI89kanR 悬浮液，其中所需的OD接种物 为0.35（值可能因其他UPEC菌株而异），Y是所需的接种物体积（每只小鼠100μL，以允许额外的消除气泡和填充导管）：X 毫升 x 外径悬浮液 = Y 毫升 x 外径接种物例如，如果OD悬浮 液值为4.7，则需要5 mL接种物：X mL × 4.7 = 5 × 0.35X = （5 × 0.35） / 4.7X = 0.372 毫升因此，加入372μL细菌悬浮液以制成5 mL（最终体积） 使用多通道移液管将接种物的1：10连续稀释至96孔板中无菌PBS中的10-6 。将所有6种稀释液的5个10μL重复物点到LB和LB + kan板上，使斑点干燥，并在37°C下孵育过夜。不使用抗生素的LB板用于确保接种物不被另一种生物体污染（这将表现为kan抗生素选择板上不存在的额外菌落形态）。两种板类型应产生相同的结果。注意：在使用前，应在台面上干燥一天，以便它们吸收电镀液体而不会结结斑点。 用可区分的菌落计算稀释液中所有斑点的菌落总数，并使用该值计算每个实验中使用的实际接种剂量。不要简单地依赖 OD600 值。 将UTI89kanR 接种到麻醉的雌性小鼠的膀胱中（第0天）注：该程序的录像已在44，46之前公布。有关更全面的说明，请参阅这些论文。有关小鼠导管插入术的更多详细信息，请参阅本方案的第5节。 根据IACUC批准的方法用异氟醚吸入麻醉小鼠。 在等待小鼠麻醉时，用UTI89kanR 接种物填充结核菌素注射器，然后贴上准备好的导管。按下柱塞使导管中的空气排出，然后将导管轻拍到无菌手术润滑剂中。 将鼠标放在背面，通过用力挤压鼠标脚垫并观察没有反射或反应来确认麻醉。将膀胱（感觉像豌豆在下腹部）放在每只手的食指之间。通过向对方移动手指来表达尿液，以对膀胱施加轻柔的挤压压力。 将导管通过小鼠尿道插入膀胱，缓慢输送50μL接种物。 等待几秒钟，然后直接拔出导管，轻轻取出导管。将鼠标放回笼子并监测，直到它从麻醉中恢复。 用其他小鼠重复步骤1.3.1 – 1.3.5，在每个笼子（5只小鼠）之间更换导管。如果需要，可以使用相同的程序来接种PBS的对照组小鼠，例如显示阴道 G .的另一株引起rUTI（在自发/背景水平上）。 2. 监测 UPEC 菌尿的清除情况（第 1 至 28 天） 注意：尿液收集程序的视频之前已于44发布。 通过膀胱触诊从所有小鼠收集尿液（至少10μL），如感染后1 d和每周4 周（感染后7，14，21和28 d）所述44。尿液应在收集后几小时内进行培养，以监测 UPEC 感染。将尿液储存在4°C直至镀液。尿液也可用于细胞学检查（见第4节）。偶尔如果膀胱发炎，则无法获得10μL尿液;在这种情况下，PBS可以加入高达10μL，但必须相应地调整尿细菌滴度和细胞学评分（例如，如果仅收集5μL尿液并加入5μL PBS，则将滴度和评分乘以2）。 使用多通道移液器，在96孔板中的无菌PBS中将1：10连续稀释至10-6 。使用P10多通道移液器在含有相关抗生素选择标记物的LB板左边缘的垂直方向从色谱柱1中分离出10μL所有6种稀释液。丢弃吸头。 对剩余的样品（列2，然后是列3等）重复电镀。单板可并排容纳 5 个样品。这会产生一个具有5×6点基质的板，从上到下稀释度增加，样品数量从左到右增加（图2A）。 让斑点在台面上干燥，然后在37°C下孵育过夜。第二天，计算菌落不同的最不稀释点的菌落数量（图2B），并使用此数字计算CFU / mL：单尿斑中菌落数×稀释因子 × 100 = CFU/mL 尿液 使用绘图软件绘制UTI89kanR 尿滴度（图2C）。在28天时识别尿液中没有可检测到的UTI89kanR 的小鼠（〜65-80%的C57BL / 6小鼠）。这些小鼠携带静止的细胞内储层，并在随后的实验阶段用于检查复发性UTI的诱导。那些在28天时尿液中有细菌的人不包括在随后的步骤中。 3. 膀胱暴露于 阴道毛滴虫 将小鼠分配到暴露组（第29天）。此步骤的主要目标是避免将所有具有更长时间的菌尿的小鼠放在同一暴露组中，因为尚不清楚这是否会影响rUTI的可能性。 使用尿液CFU数据（图2D），根据UTI89kanR 菌尿不再可检测到的时间点对小鼠进行分类（图2E）。 将每个类别的小鼠随机分配到 阴道毛孢杆菌 或PBS接种组;例如，在第7天之前清除的小鼠中有一半获得 阴道G ，一半将获得PBS;在第8天和第14天之间清除的小鼠的一半将获得 阴道G ，一半将获得PBS等（如图 2E所示）。 准备 阴道接 种物（所有步骤在厌氧室中进行）注意：理想的培养孵育时间因 阴道芽孢杆菌的不同菌株而异，一些菌株进入静止期，甚至开始比其他菌株更快地死亡。鉴于杀死 的阴道G. （JCP8151B）无法触发rUTI39，这一点尤其重要。因此，在小鼠中进行实验之前，应根据经验确定给定菌株的孵育时间。目前尚不清楚其他/所有 阴道毛果体 菌株是否会在此模型中引发相同的效果。 条纹 G.阴道 从-80°C冷冻储备品到NYCIII板（无抗生素）上。将板在37°C厌氧下孵育24小时。 在厌氧室中，从NYCIII板中接种5mL具有1μL环状细胞（单个菌落不足）的厌氧NYCIII培养基，并在厌氧条件下在37°C下静态孵育18小时。不要在生长培养基中加入抗生素。 使用分光光度计测定培养物的OD600 。 将规定体积（X）的培养物以9600× g 离心1分钟并吸出培养基。使用以下等式计算PBS的体积（Y）以重新悬浮沉淀以达到所需的接种物OD，以在50μL内达到108 CFU：X mL × OD培养 物 = Y mL × OD接种物 求解 YY = （X 毫升 × OD培养物） / OD接种物注意：JCP8151BSmR 的外径接种物为 5，但对于其他阴道芽孢杆菌菌株，必须根据经验确定。例如，如果纺丝3毫升JCP8151BSmR过夜液体培养物，OD培养物= 2.0：Y = （3毫升×2.0）/ 5.0;因此，将沉淀重悬于 1.2 mL PBS 中 将PBS中的细菌沉淀重悬至所需浓度。连续稀释并接种接种物（如上面的CFU电镀方案中所述），以确定每个实验中使用的实际接种物剂量。不要仅仅依赖 OD 值。 在UPEC接种后的第29-31天，按照上述步骤1.3所述，用 阴道G 或PBS接种麻醉的小鼠。PBS对照组是必不可少的，因为导尿膀胱的行为可能会诱发损伤和尿路上皮剥脱，从而引起一定程度的UPEC储液囊再出现。 因此，PBS接种小鼠作为与阴道接种 小鼠进行比较的对照。注意：在28 d下最终的UPEC菌尿测定需要CFU板孵育过夜。因此，此步骤最早可以在初始UPEC接种后的29天进行。如有必要，暴露可以最晚在第31天进行。研究人员应该在实验之间保持一致。 重复接种制剂以在所需时间点（例如第一次接种后12小时或1周）进行第二次 阴道G. （或PBS对照）接种。第二次暴露是必要的，因为单次接种 阴道球菌 不会导致显着的UPEC出现39。 4. 监测复发性尿路感染 在每次 阴道假单胞菌 接种后的所需时间点收集小鼠的尿液（推荐接种后1，2和3 d）。 在选择性平板（例如 LB+卡那霉素）上连续稀释和平板尿液，以确定 UTI89卡纳尔 CFU/mL。如果需要，尿液稀释液也可以接种在选择性平板上（例如，NYCIII + 1 mg/mL 链霉素）以确定阴道 GFU/mL。然而，阴道G.JCP8151BSmR在12小时39时从大多数小鼠的尿液中清除。 因此，在大多数小鼠中，需要更早的时间点来检测阴道G. 在实验终点（例如，在第二次 阴道G 接种后3天），根据批准的方法（例如，异氟醚麻醉下的宫颈脱位或CO2 吸入下）处死小鼠并收集膀胱和肾脏用于CFU计数，如前所述 44，46。 5. 尿液细胞学检查 注意：该过程可以在需要可视化尿液中存在的细胞和/或细菌的任何时间点进行。如图 1所示，尿细胞学检查通常在1 dpi（甚至更早）下进行，以检查急性UPEC感染，并在3期期间评估尿液中显示UPEC出现的多形核（PMN）细胞的存在。 将10μL尿液加入90μLPBS中，在带有附加过滤器和载玻片的细胞分裂盒中。（最简单的方法是使用用于尿液培养的96孔板中剩余的1：10稀释液，如果储存在4°C，这些样品可以在尿液培养后24小时使用）。将盒放入细胞离心机中，并以600-800 ×g 的速度旋转6分钟，加速度高。 取出载玻片，让其干燥过夜。第二天，根据制造商的方案，使用血液学染色试剂盒（例如赖特氏，Giemsa，包括固定剂）进行染色。 通过光学显微镜分析载玻片是否存在PMN和上皮细胞。如果需要，可以使用定性评分指标对它们进行评分，该指标基于每个高倍视野中存在的每种细胞类型的丰度（例如，0=无，1=少数，2=中等，3=稳健）。确保分析载玻片的个体对实验组视而不见，以最大限度地减少潜在的偏差。 6. 通过扫描电子显微镜对膀胱进行成像 注意：该过程可以在需要尿路上皮可视化的任何时间点进行。 如图1 所示（紫色框），在储库形成阶段UPEC接种后6小时至24小时之间最好地可视化UPEC与尿路上皮相互作用，并且由 阴道芽孢 杆菌引发的尿路上皮剥落在第二次 阴道G .暴露后的3小时至12小时内最好可视化。 膀胱原位固定 在膀胱收获前立即通过在pH 7.4下向0.15M二甲酸钠缓冲液中加入戊二醛（2.5%最终）和多聚甲醛（2 %最终）来制备固定剂。使用来自新打开的玻璃安瓿的多聚甲醛和戊二醛，因为这两种固定剂在打开的容器中都会随着时间的推移而氧化。注意：戊二醛有毒，呼吸道刺激性和腐蚀性;多聚甲醛易燃，致癌，刺激性和生殖毒素;二甲砷酸钠是有毒和致癌的。 要制成50 mL固定剂溶液，在pH 7.4和4 mMCaCl 2下，加入6.25 mL 16%多聚甲醛，2 mL 50%戊二醛和16.75 mL超纯水加入25 mL的0.3 M卡考代酸钠溶液中。 在施用膀胱之前将准备好的固定剂加热至37°C。 用固定剂填充结核菌素滑头注射器，并将导管固定到末端，斜面朝向相反的注射器标记。从针头末端剪掉多余的管子1-2毫米，注意不要暴露针尖。轻拂注射器以除去气泡，并将柱塞推至空空空气，并在微量离心管上用固定剂填充导管，以收集任何固定剂以进行适当处置。 使用批准的方法麻醉并处死小鼠（例如，麻醉下的颈椎脱位）。将鼠标放在解剖表面上，固定腿（用橡皮筋或针）。用镊子和一把手术剪刀打开小鼠骨盆区域以暴露膀胱。小心地将相邻的脂肪推到一边，但将膀胱留在原位。 用惯用手握住注射器，针头朝下，针头斜面和注射器标记朝向你。将导管尖端浸入无菌润滑剂中。 将导管尖端放在尿道开口处，将注射器管保持在小鼠身体上30-45°角的位置。 使用尖端的非常小的顺时针运动向下施加压力，然后将导管轻轻插入尿道。当导管尖端进入尿道时，将注射器铰接到小鼠尾巴，同时继续将导管进一步滑入尿道，直到注射器枪管与工作表面平行。整个导管针轴（不包括底座）应进入小鼠体内，将导管尖端定位在膀胱腔内。 缓慢输送50-80μL固定剂，使膀胱像气球一样膨胀。将导管保持在适当的位置，并稍微抬起注射器，使尖端向上倾斜。 用另一只手，打开止血器，在尿道交叉处的导管针下滑动一个插脚。部分关闭止血器，直到它与针头接触。 轻轻地将导管针从膀胱中滑出，同时完全夹紧并锁定止血器，以防止固定剂丢失。 握住止血器，使其与工作表面平行，膀胱位于顶部。轻轻抬起，小心地切开止血器下方（膀胱的另一侧），以取出仍然附着的止血剂的膀胱。 将膀胱和附着的止血剂放入含有温热固定剂的Falcon管中。确保气囊完全浸没在液体中，而不是压在管壁上。在4°C下孵育24小时。 使用扫描电子显微镜（SEM）进行膀胱处理和成像 用清洁的双面剃须刀片将膀胱钝化，并与止血剂切向第二次切口以释放膀胱。这导致2个半膀胱“杯子”。如果膀胱外部有任何残留的脂肪垫，请轻轻地将其取出。 在卡甲代酸钠缓冲液（0.15M，pH 7.4）中冲洗膀胱三次（每次10分钟）。 在室温下用1%四氧化二锇在0.15M卡考代酸缓冲液中染色组织1小时。锇对光敏感;因此，将染色容器包裹在箔中以维持黑暗环境来执行此步骤。注意：四氧化二锇有毒，对皮肤有腐蚀性。戴着手套在通风橱中执行此步骤。 用超纯水冲洗膀胱一半三次（每次10分钟）。在这些步骤中，有时可以在水面上看到渗透油。吸气或吸出，以防止在干燥步骤中受到污染。 通过将组织浸没在分级乙醇系列（50，70，90，100和100%）中脱水10分钟。 使用临界点干燥机以最慢的速度进行12次CO2 交换，干燥固定的组织。将所有其他设置设置为慢速，但通风步骤设置为“快速”除外。 用干净的双面剃须刀再次将每个膀胱的一半一分为二，以产生总共4个碎片，以减少标本的曲率，从而更有效地进行涂层，便于在SEM中成像，并暴露干燥期间可能卷曲的组织。 将气囊片粘附在铝制短桩上的导电碳粘剂卡舌上，并在与牙签接触的底部周围涂上少量的银胶，注意防止多余的胶粘剂芯渗到气囊内表面。 使用高真空溅射镀膜机溅射涂有6nm铱的样品残端。如果样品继续充电，请确保用银漆将导电路径涂在表面上，并涂上额外的4nm铱。 用扫描电子显微镜对样品进行成像。虽然条件可能因所使用的显微镜而异，但当使用埃弗哈特- 索恩利（SE2）电子探测器时，在蔡司Merlin FE-SEM上，3 KeV的加速电压和200 pA的光束电流和12-13 mm的工作距离在蔡司梅林FE-SEM上效果很好。