JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61967
, , ,
1Department of Molecular Microbiology,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics,Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

تم إثبات نموذج الفأر للتلقيح عبر الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) لإنشاء خزانات المثانة الكامنة داخل الخلايا والتعرض اللاحق للمثانة ل G. vaginalis للحث على UPEC UTI المتكرر. كما ثبت تعداد البكتيريا ، وعلم خلايا البول ، وتثبيت المثانة في الموقع ومعالجتها للمجهر الإلكتروني الماسح.

Abstract

التهابات المسالك البولية المتكررة (rUTI) الناجمة عن الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) شائعة ومكلفة. وقد أوضحت المقالات السابقة التي تصف نماذج التهاب المسالك البولية في الفئران الذكور والإناث إجراءات التلقيح البكتيري والتعداد في البول والأنسجة. أثناء عدوى المثانة الأولية في الفئران C57BL/6 ، تنشئ UPEC خزانات كامنة داخل الخلايا الظهارية للمثانة التي تستمر بعد إزالة البيلة البكتيرية UPEC. يعتمد هذا النموذج على هذه الدراسات لفحص التهاب المسالك البولية الناجم عن ظهور UPEC من داخل خزانات المثانة الكامنة. تستخدم بكتيريا Gardnerella المهبلية البولية التناسلية كمحفز لالتهاب المسالك البولية في هذا النموذج لأنها موجودة بشكل متكرر في المسالك البولية التناسلية للنساء ، خاصة في سياق dysbiosis المهبلي الذي ارتبط بالتهاب المسالك البولية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف طريقة لتثبيت المثانة في الموقع متبوعة بتحليل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لأنسجة المثانة ، مع إمكانية تطبيقها على دراسات أخرى تشمل المثانة.

Introduction

تفرض التهابات المسالك البولية (UTI) عبئا كبيرا على الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ، مما يؤثر على نوعية حياة الملايين من الناس كل عام ، وخاصة النساء1. الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) هي السبب الأكثر شيوعا لعدوى المسالك البولية1. سيعاني العديد من المرضى (حوالي 20-30٪) الذين يصابون بعدوى المسالك البولية من عدوى المسالك البولية المتكررة (rUTI) في غضون 6 أشهر على الرغم من إزالة العدوى الأولية بوساطة المضادات الحيوية2. لسوء الحظ ، يعاني ما يصل إلى 5٪ من النساء قبل انقطاع الطمث من 3 أو أكثر من التهاب المسالك البولية كل عام 3,4. يمكن أن تحدث النوبات المتسلسلة من التهاب المسالك البولية بسبب استمرار نفس سلالة UPEC من الحالة الدالة 5,6,7,8. تشير البيانات المستقاة من العينات البشرية ونماذج الفئران إلى أن التهاب المسالك البولية لنفس السلالة يمكن أن يكون ناجما عن UPEC الموجود داخل خزانات هادئة في المثانة. في البشر ، تم الكشف عن UPEC في الخلايا الظهارية وخزعات المثانة للمرضى الذين يعانون من التهاب المسالك البولية9،10،11،12،13. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران C57BL/6 أن بعض سلالات UPEC يمكن أن تنشئ خزانات هادئة داخل الخلايا في المثانة ، كما تم اكتشافها بواسطة الفحص المجهري الفلوري وعن طريق تجانس وزراعة أنسجة المثانة ، والتي يتم الحفاظ عليها لعدة أشهر بعد حل البيلة الجرثومية14،15،16. علاج المثانة بالعوامل التي تحفز تقشير ظهارة المثانة (urothelium) ، على سبيل المثال كبريتات البروتامين17 أو الشيتوزان18 ، يؤدي إلى ظهور UPEC من الخزانات لتسبب rUTI. تشير هذه البيانات إلى أنه في النساء اللواتي يضوين خزانات UPEC للمثانة من عدوى سابقة ، فإن التعرض للمثانة الذي يؤدي إلى تقشير الظهارة البولية قد يؤدي إلى التهاب المسالك البولية (rUTI).

هناك أدلة متزايدة على أن الميكروبات المهبلية تساهم في عدوى المسالك البولية19,20. Gardnerella vaginalis هو عضو متكرر في كل من الميكروبات المهبلية والبولية 21،22،23،24،25،26،27،28،29. في المهبل ، يرتبط وجود مستويات عالية من G. vaginalis ب dysbiosis الميكروبي المعروف باسم التهاب المهبل الجرثومي (BV) ، والذي يؤثر على ~ 30٪ من النساء 30،31،32. النساء المصابات بالتهاب المهبل الوراثي أكثر عرضة لخطر الإصابة بالتهاب المسالك البولية مقارنة بالنساء اللواتي لديهن مجتمع مهبلي تهيمن عليه Lactobacillus 33,34,35,36,37. في نماذج الفئران ، يسبب G. vaginalis تقشيرا ظهاريا في كل من المهبل38 والمثانة39. في الفئران C57BL/6 التي تؤوي خزانات المثانة UPEC ، يؤدي تعرضان متتابعان للمثانة إلى G. vaginalis – ولكن ليس ل PBS – إلى عودة ظهور UPEC من الخزانات لتسبب UPEC rUTI. ويتضح هذا الظهور من خلال ظهور عيارات UPEC في البول من الفئران التي سبق لها حل البيلة البكتيرية UPEC وانخفاض لاحق في عيارات المثانة المتجانسة UPEC عند التضحية مقارنة بالحيوانات الضابطة المعرضة ل PBS39. ومن المثير للاهتمام ، لا يوجد استعمار دائم من قبل G. vaginalis في المثانة. في الغالبية العظمى من الحالات، يكفي تعرضان قصيران، لكل منهما أقل من 12 (ساعة) من G. vaginalis القابل للحياة في البول، للحصول على تقشير الظهارة البولية وتعزيز التهاب المسالك البولية.

يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر من التهاب المسالك البولية الناجم عن UPEC المقيم في خزانات المثانة داخل الخلايا ، باستخدام تلقيح المثانة المهبلية G. المهبلية لتحفيز التكرار. التقدم الذي حققه هذا النموذج هو أن G. vaginalis هو محفز بيولوجي ذي صلة سريريا ل rUTI مقارنة بالعوامل الكيميائية المستخدمة سابقا. علاوة على ذلك ، فإن البقاء على قيد الحياة قصير الأجل نسبيا ل G. vaginalis في المسالك البولية للفأر يسمح بفحص تأثير التعرض الميكروبي العابر على الظهارة البولية ، كما قد يحدث بعد النشاط الجنسي. بالإضافة إلى تحديد نموذج rUTI ، يصف هذا البروتوكول أيضا طرق علم خلايا البول وتثبيت المثانة في الموقع وتصوير اليوروثيليوم عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).

يستخدم هذا البروتوكول من UPEC UTI المتكرر الناجم عن G. المهبلي سلالة UPEC UTI89 التي تحمل كاسيت مقاومة كاناميسين (UTI89kanR)40. لم تكن جميع سلالات UPEC التي تم اختبارها قادرة على تكوين مجتمعات بكتيرية داخل الخلايا خلال مرحلة العدوى الحادة في الفئران41 وليس من المعروف بعد ما إذا كانت جميع سلالات UPEC لديها القدرة على تكوين خزانات كامنة داخل الخلايا. يجب تأكيد تكوين الخزان قبل استخدام سلالات UPEC الأخرى في النموذج. يستخدم هذا البروتوكول عزل G. vaginalis التلقائي المقاوم للستربتومايسين، JCP8151BSmR38. يتطلب تحريض التهاب المسالك البولية بواسطة JCP8151BSmR تطعيمين متتابعين من G. vaginalis ، إما 12 ساعة أو 7 أيام (د) بصرف النظر عن39. يبقى تحديد ما إذا كانت سلالات G. vaginalis الأخرى تحفز التقشير و / أو UPEC rUTI أم لا باستخدام هذا النموذج. من الضروري استخدام سلالات UPEC و G. vaginalis ذات المقاومة المعروفة للمضادات الحيوية (مثل kanamycin أو spectinomycin ل UPEC والستربتومايسين ل G. vaginalis) لأنه يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى ألواح agar لمنع نمو ميكروبات الفئران الداخلية التي يمكن أن تتداخل مع تعداد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لمراقبة العدوى. هذا مهم بشكل خاص لزراعة عينات البول ، لأن بول الفئران يحتوي في كثير من الأحيان على بكتيريا أخرى يمكن أن تنمو على ألواح الثقافة بدون مضادات حيوية. أصل هذه البكتيريا الذاتية المنشأ في بول الفئران غير معروف ولكن من المحتمل أن يعكس البكتيريا حول الإحليل والجهاز البولي التناسلي التي يتم التقاطها أثناء جمع البول.

G. vaginalis هي بكتيريا لاهوائية اختيارية ، وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول نمو G. vaginalis JCP8151BSmR في غرفة لاهوائية. إذا لم تكن الغرفة اللاهوائية متوفرة ، فيمكن استخدام طرق أخرى للحفاظ على ظروف النمو اللاهوائي (مثل حقيبة GasPak في حاوية محكمة الإغلاق). بدلا من ذلك ، ستنمو بعض سلالات G. vaginalis (بما في ذلك JCP8151BSmR) في حاضنة قياسية لزراعة الأنسجة (5٪ CO2). تماما كما يتطلب استخدام سلالات G. vaginalis بخلاف JCP8151BSmR اختبارا للتأكد من أن البكتيريا تتصرف بشكل مماثل في هذا النموذج ، فإن ظروف النمو المتغيرة تتطلب تحديدا تجريبيا لفترات مثالية للزراعة (على الألواح وفي السائل) وما يعادلها من الكثافة البصرية (OD) 600 لتحقيق تركيزات التلقيح القابلة للحياة المطلوبة. علاوة على ذلك ، من غير المعروف ما إذا كانت ظروف النمو تؤثر على البيولوجيا المرضية ل G. vaginalis.

أخيرا ، عند النظر في استخدام هذا النموذج ، يجب أن يدرك الباحثون أنه يمكن أن يتطلب أعدادا أكبر من الحيوانات لكل مجموعة مقارنة بنماذج فئران UTI النموذجية. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن تحريض التهاب المسالك البولية يتطلب أن تحل الفئران البيلة البكتيرية UPEC الناجمة عن العدوى الأولية للمثانة. وبالتالي ، فإن أي فأر يفشل في إزالة البيلة الجرثومية (النمط الظاهري عادة ما يشير إلى عدوى الكلى المستمرة) لا يتم تضمينه في مرحلة rUTI من البروتوكول. يتأثر عدد الفئران اللازمة لتشغيل هذه الدراسات أيضا بمعدل ظهور UPEC “التلقائي” في البول (12-14٪ في المتوسط). وأخيرا ، فإن سلالات الفئران المختلفة لها ميول مختلفة لتطوير البيلة الجرثومية المزمنة مقابل تكوين الخزان داخل الخلايا42,43. إذا كنت تستخدم سلالات الفئران بخلاف C57BL/6 في هذا النموذج ، فيجب التأكد من أن الحيوانات تطور خزانات UPEC هادئة داخل الخلايا.

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية للرعاية واستخدام الحيوان بجامعة واشنطن (IACUC) على جميع التهابات الفئران والإجراءات كجزء من البروتوكول رقم 20170081 ، الذي انتهت صلاحيته في 06/09/2020 ، و 20-0031 ، الذي ينتهي في 03/18/2023. كانت الرعاية الشاملة للحيوانات متسقة مع دليل رعاية واستخدام المختبر من المجلس الوطني للبحوث ودليل موارد رعاية الحيوانات التابع لوزارة الزراعة الأمريكية. تتوافق إجراءات القتل الرحيم مع إرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات: إصدار 2020. الشكل 1. مخطط نموذج الماوس. يتم تسليط الضوء على الجدول الزمني ليعكس مراحل أو إجراءات النموذج المبين في البروتوكول. المرحلة 1 (برتقالي): إنشاء خزانات UPEC داخل الخلايا. يتم تلقيح الفئران عبر الإحليل باستخدام UPEC ويتم جمع عينات البول ومراقبتها لإزالة البيلة البكتيرية. فقط الفئران التي تزيل البيلة الجرثومية تنتقل إلى المراحل اللاحقة. المرحلة 2 (أخضر): تعرض المثانة ل G. vaginalis. يتم تلقيح الفئران عبر الإحليل مع G. vaginalis مرتين. المدة الزمنية بين التعرضين المتتابعين هي إما 12 ساعة (اللوحة العلوية) أو 1 أسبوع (wk ؛ اللوحة السفلية) ، اعتمادا على التحليل النهائي المطلوب. المرحلة 3 (الأصفر): UPEC rUTI. يتم جمع البول يوميا بعد التعرض ل G. vaginalis ومراقبته بحثا عن البيلة الجرثومية UPEC. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع المثانة والكلى في نقطة النهاية التجريبية لقياس عيارات أنسجة UPEC. في نموذج التعرض ل 1 أسبوعا ، ينعكس ظهور UPEC الناجم عن G. vaginalis من الخزانات داخل الخلايا والتطهير اللاحق من المسالك البولية أيضا في انخفاض في عيارات أنسجة المثانة UPEC (مقارنة بالفئران المعرضة ل PBS ، انظر الشكل 3D). لم يكن هذا الانخفاض في عيار المثانة واضحا في نموذج التعرض لمدة 12 ساعة ، على الأرجح لأن هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لظهور الخزان الكافي وإزالته لتقليل عيار الأنسجة بشكل كبير. الإجراء أ: عادة ما يتم إجراء علم خلايا البول 1 نقطة في البوصة (أو حتى قبل ذلك) خلال المرحلة 1 لفحص عدوى UPEC الحادة وخلال المرحلة 3 لتقييم محتوى PMN في البول ، والذي يرتبط بظهور UPEC. يمكن تحليل عينات البول التي تم جمعها في نقاط زمنية أخرى بالمثل. الإجراء B: عادة ما يتم إجراء المجهر الإلكتروني الماسح للمثانة (SEM) لفحص تقشير الظهارة البولية في نموذج 12 ساعة في 3 ساعات بعد التعرض الثاني ل G. المهبل (15 ساعة بعد إعطاء التعرض الأول في الوقت 0). يمكن أيضا تقييم نقاط زمنية أخرى ، مثل 6-24 ساعة بعد تلقيح UPEC كما هو موضح في المرحلة 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 1. إنشاء خزانات UPEC هادئة داخل الخلايا في الفئران قم بإعداد القسطرة البولية (راجع 44,45,46,47 للحصول على مقاطع فيديو لهذه الخطوة). خيط 30 قياس الإبر مع طول أنابيب PE10 تمتد من قاعدة الإبرة إلى عدة مم خارج طرف الإبرة. احرص على عدم ثقب الأنابيب بطرف الإبرة. بدلا من ذلك ، استخدم قنية الأطفال عن طريق الوريد46. ضع القسطرة المحضرة في طبق بتري وقم بتعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل. استبدل غطاء طبق بتري وآمن للتخزين حتى الحاجة. تحضير لقاح UPEC (اليوم -3 إلى 0) اليوم -3: Streak UTI89kanR من مخزون الفريزر -80 درجة مئوية إلى لوحة أجار لوريا بيرتاني (LB). لوحة حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.ملاحظة: ليس من الضروري إضافة كاناميسين إلى وسائط نمو التلقيح لأن مقاومة الكاناميسين مدمجة بشكل ثابت في UTI89kanR. اليوم -2: تلقيح 20 مل من مرق LB في قارورة معقمة 125 مل مع مستعمرة واحدة من UTI89kanR. لا تستخدم قارورة أصغر لأن طريقة الثقافة هذه مهمة للحث على التعبير عن بيلوس UPEC من النوع 1 الضروري لالتصاق المثانة. احتضان ثابت (دون اهتزاز) عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة. لا تضيف المضادات الحيوية إلى وسط النمو. استخدم فقط المستعمرات الطازجة على ألواح LB (18-24 ساعة) لبدء الثقافات السائلة. اليوم -1: الزراعة الفرعية UTI89kanR عن طريق إزالة 20 ميكرولتر من الثقافة (تدوير القارورة بلطف لإعادة تعليق البكتيريا المستقرة) وإضافة 20 مل من مرق LB الطازج في قارورة معقمة 125 مل. احتضان كما هو الحال في الخطوة 2 ، باستثناء شركة مدة 18 ساعة. لا تضيف المضادات الحيوية إلى وسط النمو. اليوم 0: انقل المزرعة بأكملها إلى أنبوب سعة 50 مل وقم بالدوران عند 3200 × جم في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 10 دقائق لبكتيريا الكريات. شفط supernatant وإعادة تعليق الكريات البكتيرية في 10 مل من PBS. أضف 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري المركز من الخطوة 4 إلى 900 ميكرولتر من PBS في كوفيت وحدد الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي الذي تم إفراغه باستخدام PBS. اضرب قيمة مقياس الطيف الضوئي في 10 (لحساب التخفيف) لتحديد OD600 للتعليق (تعليق OD). لتحقيق تركيز التلقيح المطلوب من 1 × 107 CFU في 50 ميكرولتر ، قم بتخفيف (أو تركيز) تعليق UTI89kanR باستخدام المعادلة التالية ، حيثيكون لقاح OD المطلوب 0.35 (قد تختلف القيمة لسلالات UPEC الأخرى) و Y هو حجم التلقيح المطلوب (100 ميكرولتر لكل فأر للسماح بمزيد من التخلص من الفقاعات وملء القسطرة):X مل ×تعليق OD = Y مل ×OD التلقيحعلى سبيل المثال ، إذا كانت قيمةتعليق OD هي 4.7 و 5 مل من اللقاح مطلوبة:X مل × 4.7 = 5 × 0.35X = (5 × 0.35) / 4.7X = 0.372 مللذلك ، أضف 372 ميكرولتر من التعليق البكتيري لجعل 5 مل (الحجم النهائي) استخدم ماصة متعددة القنوات لإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:10 للتلقيح إلى 10-6 في PBS معقمة في صفيحة 96 بئرا. يكرر Spot Five 10 μL جميع التخفيفات ال 6 على لوحة LB و LB + kan ، ويسمح للبقع بالجفاف ، ويحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يتم استخدام لوحة LB بدون مضادات حيوية لضمان عدم تلوث اللقاح بكائن حي آخر (والذي سيظهر كمورفولوجيا مستعمرة إضافية غير موجودة على لوحة اختيار المضادات الحيوية كان). يجب أن يؤدي كلا النوعين من الألواح إلى نفس النتيجة.ملاحظة: يجب السماح للألواح بالجفاف على سطح الطاولة لمدة يوم قبل الاستخدام حتى تمتص السائل المطلي دون التحام البقع. عد العدد الإجمالي للمستعمرات في جميع بقع التخفيف ذات المستعمرات المميزة واستخدم القيمة لحساب جرعة التلقيح الفعلية المستخدمة في كل تجربة. لا تعتمد ببساطة على قيم OD600 . تلقيح UTI89kanR في مثانة الفئران الإناث المخدرة (اليوم 0)ملاحظة: تم نشر تسجيلات الفيديو لهذا الإجراء سابقا44,46. ارجع إلى هذه الأوراق للحصول على وصف أكثر شمولا. انظر القسم 5 من هذا البروتوكول لمزيد من التفاصيل حول قسطرة الماوس. تخدير الفئران مع استنشاق الأيزوفلوران وفقا للطرق المعتمدة من IACUC. أثناء انتظار الفئران للتخدير ، املأ حقنة السل بلقاح UTI89kanR ثم قم بلصق قسطرة محضرة. اخفض المكبس لإفراغ الهواء من القسطرة، ثم ضعي القسطرة في مادة تشحيم جراحية معقمة. ضع الماوس على ظهره وتأكد من التخدير عن طريق الضغط بقوة على وسادة قدم الماوس ومراقبة عدم وجود رد فعل أو استجابة. حدد موقع المثانة (يبدو وكأنه بازلاء في أسفل البطن) بين السبابة لكل يد. عبر عن البول عن طريق تحريك الأصابع نحو بعضها البعض لتطبيق ضغط لطيف على المثانة. أدخل القسطرة من خلال مجرى البول في المثانة وقم بتوصيل 50 ميكرولتر من اللقاح ببطء. انتظر بضع ثوان ثم قم بإزالة القسطرة برفق عن طريق السحب للخارج مباشرة. أعد الماوس إلى قفصه وراقبه حتى يتعافى من التخدير. كرر الخطوات 1.3.1 – 1.3.5 مع فئران إضافية، مع تغيير القسطرة بين كل قفص (5 فئران). إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام نفس الإجراء لتلقيح مجموعة تحكم من الفئران باستخدام PBS ، على سبيل المثال لإظهار سلالة أخرى من G. vaginalis تثير rUTI (على المستوى التلقائي / الخلفية). 2. مراقبة إزالة البيلة الجرثومية UPEC (الأيام 1 إلى 28) ملاحظة: تم نشر فيديو لإجراء جمع البول سابقا44. جمع البول (الحد الأدنى 10 ميكرولتر) من جميع الفئران عن طريق ملامسة المثانة كما هو موضح44 في 1 د بعد الإصابة وأسبوعيا لمدة 4 أسابيع (7 و 14 و 21 و 28 د بعد الإصابة). يجب زراعة البول في غضون ساعات قليلة من جمعه من أجل مراقبة عدوى UPEC. يخزن البول على حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح طليا. يمكن أيضا استخدام البول في علم الخلايا (انظر القسم 4). في بعض الأحيان إذا كانت المثانة ملتهبة للغاية ، لا يمكن الحصول على 10 ميكرولتر من البول ؛ في هذه الحالة ، يمكن إضافة PBS حتى 10 ميكرولتر ، ولكن يجب تعديل درجات عيار البول البكتيري وعلم الخلايا وفقا لذلك (على سبيل المثال ، إذا تم جمع 5 ميكرولتر فقط من البول وإضافة 5 ميكرولتر PBS ، فقم بضرب العيار والدرجات في 2). باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:10 إلى 10-6 في PBS معقمة في لوحة 96 بئرا. استخدم ماصة P10 متعددة القنوات لاكتشاف 10 ميكرولتر من جميع التخفيفات ال 6 من العمود 1 في اتجاه رأسي على الحافة اليسرى للوحة LB تحتوي على علامة اختيار المضادات الحيوية ذات الصلة. تجاهل النصائح. كرر الطلاء مع العينات المتبقية (العمود 2 ، ثم العمود 3 ، وما إلى ذلك). يمكن أن تستوعب لوحة واحدة 5 عينات جنبا إلى جنب. ينتج عن ذلك لوحة ذات مصفوفة موضعية 5 × 6 ، مع زيادة التخفيفات من الأعلى إلى الأسفل وزيادة أعداد العينات من اليسار إلى اليمين (الشكل 2A). اترك البقع لتجف على سطح الطاولة ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات في البقعة الأقل تخفيفا التي تكون فيها المستعمرات متميزة (الشكل 2B) واستخدم هذا الرقم لحساب CFU / mL:عدد المستعمرات في بقعة البول المفردة عامل تخفيف × × 100 = CFU / مل البول مؤامرة UTI89kanR عيار البول باستخدام برنامج الرسوم البيانية (الشكل 2C). تحديد الفئران التي ليس لديها UTI89kanR يمكن اكتشافها في البول عند 28 د (~ 65-80٪ من الفئران C57BL / 6). هذه الفئران تؤوي خزانات هادئة داخل الخلايا وتستخدم في المرحلة التجريبية اللاحقة لفحص تحريض التهاب المسالك البولية المتكرر. لا يتم تضمين أولئك الذين يعانون من البكتيريا في البول في 28 د في الخطوات اللاحقة. 3. تعرض المثانة ل G. المهبل تعيين الفئران لمجموعات التعرض (اليوم 29). الهدف الأساسي من هذه الخطوة هو تجنب وجود جميع الفئران التي تعاني من بيلة بكتيرية أطول معا في نفس مجموعة التعرض ، لأنه من غير المعروف ما إذا كان هذا يؤثر على احتمال الإصابة بالتهاب المسالك البولية المسالة. باستخدام بيانات CFU البول (الشكل 2D) ، قم بتصنيف الفئران بناء على النقطة الزمنية التي لم يعد من الممكن فيها اكتشاف البيلة البكتيرية UTI89kanR (الشكل 2E). توزيع الفئران عشوائيا من كل فئة إلى مجموعات التلقيح G. vaginalis أو PBS ؛ على سبيل المثال ، نصف الفئران التي تم تطهيرها قبل اليوم 7 تحصل على G. vaginalis والنصف الآخر سيحصل على PBS ؛ نصف الفئران التي تم تطهيرها بين اليومين 8 و 14 ستحصل على G. vaginalis والنصف الآخر سيحصل على PBS ، وما إلى ذلك (كما في الشكل 2E). تحضير لقاح G. vaginalis (جميع الخطوات التي يتم تنفيذها في غرفة لاهوائية)ملاحظة: تختلف أوقات حضانة الثقافة المثالية بين سلالات مختلفة من G. vaginalis ، حيث تدخل بعض السلالات المرحلة الثابتة وحتى تبدأ في الموت بسرعة أكبر من غيرها. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى أن قتل G. vaginalis (JCP8151B) لم يتمكن من تشغيل rUTI39. وبالتالي ، يجب تحديد أوقات الحضانة تجريبيا لسلالة معينة قبل إجراء التجارب على الفئران. من غير المعروف ما إذا كانت سلالات G. vaginalis الأخرى / جميعها ستؤدي إلى نفس التأثيرات في هذا النموذج. سلالة Streak G. المهبلية من مخزون الفريزر -80 درجة مئوية على لوحة NYCIII (بدون مضادات حيوية). لوحة حضانة في 37 درجة مئوية اللاهوائية لمدة 24 ساعة. في الغرفة اللاهوائية ، قم بتلقيح 5 مل من وسائط NYCIII اللاهوائية بحلقة 1 ميكرولتر من الخلايا (مستعمرة واحدة غير كافية) من لوحة NYCIII واحتضن الثقافة بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية لمدة 18 ساعة. لا تدرج المضادات الحيوية في وسط النمو. أوجد OD600 للاستزراع باستخدام مقياس الطيف الضوئي. جهاز الطرد المركزي حجم محدد (X) من الثقافة عند 9600 × غرام لمدة 1 دقيقة وشفط الوسائط. احسب الحجم (Y) من PBS لإعادة تعليق الكريات لتحقيق OD التلقيح المطلوب لتحقيق 108 CFU في 50 ميكرولتر باستخدام المعادلة التالية:X مل ×OD الثقافة = Y مل × ODالتلقيح حل ل YY = (X مل ×OD الثقافة) / ODالتلقيحملاحظة:لقاح OD ل JCP8151BSmR هو 5 ولكن يجب تحديد ذلك تجريبيا لسلالات G. vaginalis الأخرى. على سبيل المثال ، إذا كان الدوران 3 مل من JCP8151BSmR بين عشية وضحاها ثقافة سائلة معثقافة OD = 2.0: Y = (3 مل × 2.0) / 5.0 ؛ لذلك إعادة تعليق بيليه في 1.2 مل PBS أعد تعليق الكريات البكتيرية في PBS إلى التركيز المطلوب. قم بتخفيف اللقاح وطبقه بشكل مصيلي (كما هو موضح في بروتوكول طلاء CFU أعلاه) لتحديد جرعة التلقيح الفعلية التي تم استخدامها في كل تجربة. لا تعتمد ببساطة على قيم OD. في اليوم 29-31 بعد تلقيح UPEC ، قم بتلقيح الفئران المخدرة باستخدام G. vaginalis أو PBS كما هو موضح في الخطوة 1.3 أعلاه. تعد مجموعة التحكم في PBS ضرورية ، حيث أن فعل قسطرة المثانة يمكن أن يؤدي إلى تلف وتقشير الظهارة البولية التي يمكن أن تثير درجة معينة من عودة ظهور خزان UPEC. وبالتالي ، فإن الفئران الملقحة ب PBS تعمل كعنصر تحكم تتم مقارنة الفئران الملقحة بلقاح G. المهبلي.ملاحظة: يتطلب التحديد النهائي للبيلة الجرثومية UPEC عند 28 d حضانة لوحة CFU بين عشية وضحاها. لذلك ، فإن أقرب خطوة يمكن تنفيذها هي 29 يوما بعد التطعيم الأولي UPEC. إذا لزم الأمر ، يمكن إعطاء التعرض في وقت متأخر من اليوم 31. يجب أن يكون الباحثون متسقين بين التجارب. كرر إعداد التلقيح لإعطاء تطعيم ثان من G. vaginalis (أو PBS control) في النقطة الزمنية المطلوبة ، مثل 12 ساعة أو 1 أسبوعا بعد التلقيح الأول. التعرض الثاني ضروري لأن التطعيم الفردي مع G. vaginalis لا يؤدي إلى ظهور UPEC كبير39. 4. مراقبة UPEC المتكررة UTI جمع البول من الفئران في النقاط الزمنية المطلوبة بعد كل تطعيم G. المهبل (1 و 2 و 3 د بعد التطعيم الموصى بها). قم بتخفيف البول وطبقه بشكل متسلسل على ألواح انتقائية (على سبيل المثال ، LB + kanamycin) لتحديد UTI89kanR CFU / mL. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا طلاء تخفيفات البول على ألواح انتقائية (على سبيل المثال ، NYCIII + 1 mg / mL streptomycin) لتحديد G. vaginalis CFU / mL. ومع ذلك ، تم مسح G. vaginalis JCP8151BSmR من بول معظم الفئران بحلول الساعة 12 ساعة 39. لذلك ، ستكون النقاط الزمنية المبكرة ضرورية للكشف عن G. vaginalis في معظم الفئران. في نقطة النهاية التجريبية (على سبيل المثال ، 3 d بعد التلقيح المهبلي الثاني G. )، التضحية بالفئران وفقا للطرق المعتمدة (على سبيل المثال ، خلع عنق الرحم تحت تخدير isoflurane أو استنشاق CO2) وجمع المثانة والكلى لتعداد CFU ، كما هو موضح سابقا 44,46. 5. علم خلايا البول ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي وقت يكون فيه تصور الخلايا و / أو البكتيريا الموجودة في البول مطلوبا. كما هو مبين في الشكل 1 ، يتم إجراء علم خلايا البول عادة عند 1 نقطة في البوصة (أو حتى قبل ذلك) خلال المرحلة 1 لفحص عدوى UPEC الحادة وخلال المرحلة 3 لتقييم وجود خلايا متعددة الأشكال (PMN) في البول التي تظهر ظهور UPEC. أضف 10 ميكرولتر من البول إلى 90 ميكرولتر من PBS في كاسيت cytofunnel مع مرشح وشريحة مرفقة. (أبسط طريقة هي استخدام ما تبقى من التخفيفات 1:10 من لوحة 96-well المستخدمة في زراعة البول ؛ يمكن استخدام هذه العينات حتى 24 ساعة بعد زراعة البول إذا تم تخزينها عند 4 درجات مئوية). ضع الكاسيت في جهاز الطرد المركزي الخلوي وقم بالدوران بسرعة 600-800 × جم لمدة 6 دقائق مع تسارع عالي. قم بإزالة الشرائح واتركها لتجف طوال الليل. في اليوم التالي ، وصمة عار مع مجموعة تلطيخ أمراض الدم (على سبيل المثال ، رايت ، جيمسا ، بما في ذلك المثبت) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحليل الشرائح بواسطة المجهر الضوئي لوجود PMNs والخلايا الظهارية. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تسجيلها باستخدام مقياس تسجيل نوعي يعتمد على وفرة كل نوع من أنواع الخلايا الموجودة في كل مجال رؤية عالي الطاقة (على سبيل المثال ، 0 = لا شيء ، 1 = قليل ، 2 = معتدل ، 3 = قوي). تأكد من أن الفرد الذي يحلل الشرائح أعمى عن المجموعات التجريبية لتقليل التحيز المحتمل. 6. تصوير المثانة عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي وقت يكون فيه تصور الأوروثيليوم مطلوبا. كما هو موضح في الشكل 1 (الصناديق الأرجوانية) ، من الأفضل تصور التفاعلات بين UPEC و urothelial بين 6 ساعات و 24 ساعة بعد تلقيح UPEC خلال مرحلة تكوين الخزان ، ومن الأفضل تصور التقشير البولي الذي يسببه G. vaginalis بين 3 ساعات و 12 ساعة بعد التعرض الثاني ل G. vaginalis. تثبيت المثانة في الموقع قم بإعداد المثبت مباشرة قبل حصاد المثانة عن طريق إضافة glutaraldehyde (2.5٪ نهائي) و paraformaldehyde (2٪ نهائي) في مخزن مؤقت كاكوديليت الصوديوم 0.15 M مع 2 mM من CaCl2 عند درجة الحموضة 7.4. استخدم بارافورمالديهايد وغلوتارالدهيد من أمبولات زجاجية مفتوحة حديثا ، حيث يتأكسد كلا المثبتين بمرور الوقت في حاويات مفتوحة.تحذير: الجلوتارالدهيد سام، مهيج للجهاز التنفسي، وتآكل ؛ بارافورمالدهيد قابل للاشتعال ، مسرطن ، مهيج وسموم تناسلية. كاكوديلات الصوديوم سامة ومسرطنة. لصنع 50 مل من المحلول المثبت ، أضف 6.25 مل من 16٪ بارافورمالديهايد ، و 2 مل من 50٪ غلوتارالدهيد ، و 16.75 مل من الماء فائق النقاء إلى 25 مل من محلول 0.3 م من كاكوديلات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4 مع 4 ملليمتر لكل كلوريد2. قم بتسخين المثبت المحضر إلى 37 درجة مئوية قبل إدارته للمثانة. املأ حقنة السل ذات الطرف الزلق بمثبت وقم بلصق قسطرة حتى النهاية ، مشطوفة تواجه علامات حقنة مقابلة. قص الأنابيب الزائدة 1-2 مم من نهاية الإبرة ، مع الحرص على عدم كشف طرف الإبرة. قم بتحريك المحقنة لإزالة الفقاعات ودفع المكبس لإفراغ الهواء وملء القسطرة بمثبت فوق أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق لجمع أي مثبت للتخلص منه بشكل صحيح. تخدير الفأر والتضحية به باستخدام طريقة معتمدة (على سبيل المثال ، خلع عنق الرحم تحت التخدير). ضع الماوس على سطح تشريح مع تأمين الساقين (باستخدام أشرطة مطاطية أو دبابيس). افتح منطقة حوض الفأر باستخدام ملقط وزوج من المقصات الجراحية لفضح المثانة. ادفع الدهون المجاورة جانبا بعناية ولكن اترك المثانة في مكانها. أمسك المحقنة باليد المهيمنة مع توجيه الإبرة لأسفل وتوجيه علامات الإبرة المائلة والمحقنة بعيدا عنك. اغمس طرف القسطرة في مواد التشحيم المعقمة. ضع طرف القسطرة عند فتحة مجرى البول، مع إبقاء برميل المحقنة بعيدا في وضع زاوية 30-45 درجة فوق جسم الماوس. ضع ضغطا لأسفل باستخدام حركة صغيرة جدا في اتجاه عقارب الساعة مع الطرف وأدخل القسطرة بلطف في مجرى البول. عندما يدخل طرف القسطرة مجرى البول، قم بربط المحقنة باتجاه ذيل الفأر مع الاستمرار في تحريك القسطرة أكثر في مجرى البول حتى يصبح برميل المحقنة موازيا لسطح العمل. يجب أن يدخل عمود إبرة القسطرة بالكامل (لا يشمل القاعدة) إلى الماوس ، مع وضع طرف القسطرة داخل تجويف المثانة. قم بتوصيل 50-80 ميكرولتر من المثبت ببطء ، مما يتسبب في تضخم المثانة مثل البالون. حافظ على القسطرة في مكانها وارفع المحقنة قليلا ، مع إمالة الطرف لأعلى. من ناحية أخرى ، افتح مرقئ وحرك شقا واحدا تحت إبرة القسطرة عند تقاطع مجرى البول. أغلق المرقس جزئيا حتى يتلامس مع الإبرة. حرك إبرة القسطرة بلطف خارج المثانة مع تثبيت وقفل المرقس تماما في نفس الوقت لمنع فقدان المثبت. أمسك بالمرقأة بحيث تكون موازية لسطح العمل مع وضع المثانة في الأعلى. ارفع بلطف وبعناية تحت المرقئ (الجانب الآخر من المثانة) لإزالة المثانة مع بقاء المرقع متصلا. ضع المثانة وقم بتوصيل المرقئ في أنبوب الصقر الذي يحتوي على مثبت دافئ. تأكد من غمر المثانة بالكامل في السائل وعدم ضغطها على جدران الأنبوب. تحضن عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. معالجة المثانة وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) قم بتقسيم المثانة بشكل مهجي باستخدام شفرة حلاقة نظيفة على الوجهين ، وقم بعمل قطع عرضي ثان إلى المرقئ لإطلاق المثانة. هذا يؤدي إلى 2 “أكواب” نصف المثانة. في حالة وجود أي وسادات دهنية متبقية على السطح الخارجي للمثانة ، قم بإزالتها برفق. شطف أنصاف المثانة ثلاث مرات (10 دقائق لكل منهما) في مخزن كاكوديلات الصوديوم العازل (0.15 م ، الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بتلطيخ الأنسجة بنسبة 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم في مخزن مؤقت كاكوديلات 0.15 M لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. الأوزميوم حساس للضوء. لذلك ، قم بتنفيذ هذه الخطوة باستخدام وعاء التلطيخ الملفوف برقائق معدنية للحفاظ على بيئة مظلمة.تحذير: رابع أكسيد الأوزميوم سام وتآكل للبشرة. قم بهذه الخطوة في غطاء الدخان بالقفازات. شطف أنصاف المثانة ثلاث مرات (10 دقائق لكل منهما) في ماء فائق النقاء. خلال هذه الخطوات ، يمكن رؤية الزيت المتحجر في وقت ما على سطح الماء. قم بشفط أو فتيل هذا لمنع التلوث أثناء خطوات التجفيف. تجفيف الأنسجة عن طريق الغمر في سلسلة الإيثانول المتدرجة (50 و 70 و 90 و 100 و 100٪) لمدة 10 دقائق لكل منها. جفف الأنسجة الثابتة باستخدام مجفف نقطة حرجة يقوم بإجراء 12 عملية تبادل CO2 بأبطأ سرعة. اضبط جميع الإعدادات الإضافية على البطء، باستثناء خطوة التنفيس التي تم تعيينها على الصيام. قم بتقطيع كل نصف مثانة مرة أخرى باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة على الوجهين لتوليد 4 قطع إجمالية لتقليل انحناء العينة للحصول على طلاء أكثر كفاءة ، ولسهولة التصوير في SEM ، ولفضح الأنسجة التي قد تكون مجعدة أثناء التجفيف. قم بربط قطع المثانة بعلامة تبويب لاصقة كربونية موصلة على كعب من الألومنيوم وقم بطلاء كمية صغيرة من المادة اللاصقة الفضية حول التلامس السفلي مع مسواك ، مع الحرص على منع المادة اللاصقة الزائدة من الفتل على السطح الداخلي للمثانة. استخدم معطفا عالي الفراغ لطلاء كعب العينة ب 6 نانومتر من الإيريديوم. إذا استمرت العينات في الشحن ، فتأكد من رسم مسار موصل على السطح بطلاء فضي ومعطف مع 4 نانومتر إضافية من الإيريديوم. صور العينات باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. في حين أن الظروف قد تختلف اعتمادا على المجهر المستخدم ، فإن الجهد المتسارع البالغ 3 KeV مع تيار شعاعي يبلغ 200 pA ومسافة عمل تتراوح بين 12-13 مم عملت بشكل جيد على Zeiss Merlin FE-SEM عند استخدام كاشف الإلكترون Everhart-Thornley (SE2).

Representative Results

بعد التلقيح ، يمكن اكتشاف عيارات UPEC في البول (الشكل 2B). من المرجح أن يؤدي الفشل في وضع عينات البول على وسائط انتقائية تحتوي على كاناميسين إلى فرط نمو ميكروبات الفئران الداخلية التي تلوث البول. من المرجح أن يكون مستوى البيلة الجرثومية UPEC مرتفعا في اليوم 1 وقد يزداد خلال الأسبوع الأول قبل أن ينخفض في نقاط زمنية لاحقة (الشكل 2C). ما يقرب من 65-80 ٪ من الفئران لن يكون لديها UPEC يمكن اكتشافها في البول بنسبة 28 نقطة في البوصة (الشكل 2C ، الدائرة الخضراء). يمكن استخدام هذه الفئران في الخطوات اللاحقة للنموذج. يجب القضاء على الفئران التي لا تزال بكتيرية (الشكل 2C ، القطع الناقص الأحمر) من التجربة. يؤدي تعرضان متتابعان ل G. vaginalis يعطيان 12 ساعة (الشكل 3A) أو 1 أسبوعا (الشكل 3B) إلى ظهور UPEC من الخزانات داخل الخلايا لتسبب البيلة الجرثومية المتكررة. كل من مستوى البيلة البكتيرية UPEC (اختبار مان-ويتني) وجزء الفئران التي تعرض UPEC rUTI (اختبار فيشر الدقيق) أعلى بكثير في الفئران المعرضة ل G. vaginalis مقارنة بمجموعة التحكم PBS. يكتشف تحليل خلايا البول PMNs في البول من الفئران المعرضة ل G. المهبل التي أظهرت ظهور UPEC (الشكل 3C). في النموذج الذي يحتوي على تعرضين يعطيان على بعد 1 أسبوع، تكون عيارات UPEC في أنسجة المثانة أقل في الفئران المعرضة ل G. المهبلية مقارنة ب PBS (الشكل 3D)، ويرجع ذلك على الأرجح إلى ظهور UPEC من الخزانات والإزالة اللاحقة. يكشف تصور أنسجة المثانة الثابتة في الموقع بواسطة SEM عن خلايا عظمية سطحية سطحية كبيرة تبطن سطح المثانة في الفئران الضابطة المعرضة فقط ل PBS (الشكل 4A). يتضح التقشير البولي من خلال فقدان الخلايا المظلية السطحية ، مما يكشف عن خلايا ظهارية انتقالية أصغر في الفئران المعرضة ل G. vaginalis (الشكل 4B). في وقت مبكر بعد تلقيح UPEC أثناء إنشاء خزانات داخل الخلايا ، تكون UPEC مرئية على urothelium وخيوط من خلايا التقشير (الشكل 4C). الشكل 2. مراقبة عيار UPEC في البول خلال المرحلة 1 (تكوين الخزان). (أ) التخطيط لطلاء وحدات تشكيل المستعمرات (CFU). (ب) صورة تمثيلية لعيار UPEC في البول على LB + kanamycin. تشير الدوائر السوداء إلى بقع عينة البول التي يجب حسابها لحساب CFU / mL. (ج) المسار الزمني للبيلة الجرثومية UPEC في الفئران C57BL/6. يمثل كل خط فأرة فردية ، يتتبع عيارات البول UPEC بمرور الوقت. يشير الخط المنقط إلى حد الكشف (1000 CFU / mL). يشير القطع الناقص الأحمر إلى أربعة فئران (من أصل 20) فشلت في حل البيلة البكتيرية UPEC وبالتالي لن يتم استخدامها لنموذج rUTI الناجم عن G. vaginalis. على العكس من ذلك ، تشير الدائرة الخضراء إلى الفئران التي حلت البيلة الجرثومية UPEC وانتقلت إلى المراحل اللاحقة. (د) جدول البيانات المستخدمة لإنشاء رسم بياني في اللوحة C. Yellow، CFU القابلة للكشف؛ أخضر ، لا CFU. (ه) التوزيع العشوائي للفئران إلى مجموعات التعرض استنادا إلى النقطة الزمنية التي لم تعد فيها وحدة المعالجة المركزية التابعة للاتحاد العالمي لنقابات العمال تكتشف في البول (“تم حلها في اليوم”). أرقام الماوس في العمود الأيسر من اللوحة D هي نفس أرقام الماوس الواردة في اللوحة E. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. G. المهبل يحفز UPEC rUTI. عيارات UPEC في البول بعد تعرضين متتابعين للمسالك البولية ل PBS (الدوائر) أو G. vaginalis (Gvag ؛ مربعات) تعطى 12 ساعة (A) أو 1 أسبوعا (B) على حدة. يمثل كل رمز ماوس فردي. يتم رسم أعلى CFU / mL UPEC المكتشفة من كل ماوس بين 1-3 d بعد التعرض الثاني. يتم رسم الفئران التي لا تحتوي على بيلة بكتيرية يمكن اكتشافها عند حد الكشف (الخط المنقط). (ج) تحليل خلايا البول الذي يظهر خلايا UPEC (رؤوس الأسهم) والخلايا النووية المتعددة الأشكال (PMN) (الأسهم). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (د) عيارات UPEC في أنسجة المثانة التي تم جمعها 3 d بعد تعرضين متتابعين للمسالك البولية يعطيان 1 أسبوعا منفصلا. يمثل كل رمز ماوس مختلفا ويتم رسم الأصفار عند حد الكشف (الخط المنقط). في A و B و D ، تكون الصناديق في الربع الأول والثالث مع وضع علامة على المتوسط والشعيرات من الحد الأقصى لاختبارات Mann-Whitney U * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01 ؛ P < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. تحليل SEM للمثانة الثابتة في الموقع. تم جمع المثانة من الفئران بعد 3 ساعات من التعرض (12 ساعة على حدة) إلى PBS (A) أو G. vaginalis (C). توضح الخطوط المنقطة خلية ظهارية بولية واحدة ، وهي أصغر في المثانة المعرضة ل G. المهبلية لأن الخلايا السطحية الكبيرة قد تقشرت بعيدا مما يكشف عن الظهارة الانتقالية الأساسية. (ب) المثانة التي تم جمعها بعد 6 ساعات من التلقيح الأولي باستخدام UPEC ، خلال المرحلة 1 من النموذج ، والتي تظهر التقشير البولي الظهاري و UPEC خارج الخلية. (د) مثال على قطرات الدهون غير القابلة للذوبان الموجودة على سطح المثانة. أشرطة المقياس هي 20 ميكرومتر في الصور الرئيسية و 2 ميكرومتر في الجزء الداخلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا النموذج لتحديد الفئران التي لم تزيل البيلة الجرثومية UPEC خلال مرحلة UTI الأولية. يجب إزالة هذه الفئران من التجربة لأنها قد تربك معدلات البيلة الجرثومية UPEC بعد التعرض ل G. vaginalis. بعد التلقيح الأولي UPEC ، يجب جمع البول أسبوعيا لمراقبة إزالة البكتيريا. ما يقرب من 65-80 ٪ من الفئران C57BL / 6 سوف تزيل عدوى UTI89kanR في غضون 4 أسابيع. سلالات الفئران الأخرى المولودة لها ميول مختلفة لإزالة UPEC42,43 وتشكيل الخزان وبالتالي قد لا تكون مناسبة لهذا النموذج. النقطة الحرجة الثانية هي أن الدراسات التجريبية قد حددت أن اثنين من التطعيمات المتسلسلة من G. vaginalis (إما 12 ساعة أو 1 أسبوع) ضروريان لتحفيز ظهور خزان كبير فوق الظهور التلقائي الأساسي الذي يحدث في الفئران الضابطة المعرضة فقط ل PBS. ولم تختبر فترات زمنية أخرى بين التعرضين المتتابعين ولكنها يمكن أن تسفر عن نتائج مماثلة. من المهم ملاحظة أن انخفاضا في عيارات المثانة UPEC لم يلاحظ إلا في النموذج الذي أعطيت فيه التعرض المهبلي ل G. 1 أسبوعا عن39. وفي حين يمكن إعطاء أكثر من تعرضين اثنين، تشير الأدلة التجريبية إلى أن القسطرة المتكررة وحدها تزيد من ظهورها، مما قد يربك تفسير النتائج أو يتطلب أعدادا أكبر من الحيوانات للتمييز بين الاختلافات بين مجموعات التعرض والضوابط. أخيرا ، تحتوي طريقة تثبيت المثانة في الموقع على العديد من الخطوات الحرجة. هناك حاجة إلى بعض المهارات لضمان بقاء المثبت داخل المثانة المثبتة. سيكون من الصعب تصوير المثانة المفرغة بواسطة SEM. من الضروري أيضا أن تكون لطيفا جدا عند تلقيح المثبت في المثانة ، لأن كشط الأوروتيليوم باستخدام القسطرة المحتوية على المثبت يمكن أن يحفز تقشير الظهارة البولية بشكل مستقل عما يسببه G. vaginalis. جميع التركيزات المذكورة في الكوكتيل المثبت هي تركيزات نهائية. يمكن أن تؤدي النسب غير الصحيحة لهذه إلى عدم كفاية التثبيت والتورم أو انكماش الخلايا. يجب تسخين المثبتات إلى درجات الحرارة الفسيولوجية لتجنب صدمة درجة الحرارة في الخلايا والأنسجة. يوفر البرودء أيضا تحسنا طفيفا في معدل انتشار المثبتات من خلال أغشية البلازما. في حين أن تلطيخ الأوزميوم يمكن حذفه في كثير من الأحيان للعينات المعدة لتحليل SEM ، إلا أنه يعد خطوة أساسية في هذا البروتوكول لتحقيق الاستقرار في الدهون ومنع تكسير الأغشية الخلوية أثناء تجفيف النقاط الحرجة.

يمكن تعديل هذا البروتوكول لاختبار سلالات UPEC و / أو G. المهبلية الأخرى لقدرتها على تشكيل الخزانات وتحفيز ظهورها ، على التوالي. يمكن أيضا إضافة عوامل تجريبية أخرى ، مثل التعرض للبكتيريا المهبلية الأخرى (على سبيل المثال ، Lactobacillus crispatus PVAS100) أو G. vaginalis المقتولة حراريا ، ولا يظهر أي منهما علم الأمراض في هذا النموذج39. عند اختيار سلالات بكتيرية أخرى للاختبار ، من المهم إظهار نمو ثابت بحيث يمكن استخدام تركيز التلقيح القياسي في جميع التجارب. تم تحسين نمو JCP8151BSmR في غرفة لاهوائية. من المحتمل أن تزرع هذه السلالة في نظام GasPak اللاهوائي ، لكن هذا يتطلب التحسين لضمان نمو البكتيريا القوي. أخيرا ، قد يكون من الممكن تعديل توقيت خطوات معينة في النموذج. على سبيل المثال ، يمكن جمع البول في نقاط زمنية مبكرة خلال مرحلة تكوين خزان UPEC لمراقبة استجابات CFU أو المضيف. لم يلاحظ في هذا النموذج أي أثر ضار لجمع عينات البول في نقاط زمنية مبكرة (3 ، 6 ، 12 hpi) على تطور العدوى أو إنشاء خزانات. تم الإبلاغ عن ظهور خزانات UPEC بعد إعطاء جرعتين JCP8151BSmR 12 ساعة أو 1 أسبوع، ولكن لم يتم بعد اختبار فترات زمنية أخرى. قد يكون من الممكن أيضا تقليل المدة الزمنية الإجمالية للنموذج عن طريق تقليل مرحلة تكوين خزان UPEC إلى 2 أسابيع (بدلا من 4 أسابيع) ، لأن العديد من الفئران تزيل البيلة الجرثومية بحلول هذا الوقت. استخدمت الدراسات السابقة التي فحصت ظهور UPEC بعد تعرض المثانة للمقشرات الكيميائية مرحلة تكوين خزان UPEC 1 أو 2 أسبوعا17,18. ومع ذلك ، فإن تقليل مقدار الوقت اللازم لإزالة البيلة الجرثومية UPEC قد يأتي على حساب طلب المزيد من الحيوانات لإعدامها من التجربة. أخيرا ، يمكن إجراء تحليل SEM للمثانة في نقاط زمنية إضافية لمراقبة مدة تأثير G. vaginalis على الظهارة البولية.

فيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، هناك بعض الاعتبارات المهمة على وجه التحديد فيما يتعلق بتحليل SEM للمثانة. اعتمادا على خلفية الماوس المستخدمة وكمية الالتهاب الموجودة ، ستقدم بعض المثانة بجدران رقيقة جدا. تميل هذه المثانة إلى التجعد أكثر أثناء تجفيف النقاط الحرجة ويمكن أن تؤدي إلى شكل يشبه قشرة البقرة. إذا حدث هذا ، فإن أفضل طريقة هي قطع المثانة على شكل قشرة إلى نصفين على طول الواجهة المجعدة ثم مرة ثانية لإزالة الجزء الأكبر من الأنسجة المتدلية. يعمل القطع بشكل أفضل مع شفرة حلاقة ذات حدين مطلية ب PTFE. يمكن أن تذوب الدهون الزائدة في بعض الأحيان أثناء خطوات تلطيخ الأوزميوم. هذا يمكن أن يؤدي إلى قطرات الدهون غير القابلة للذوبان غير المرغوب فيها التي قد لا تغسل أثناء خطوات الشطف والجفاف والتي يمكن أن تستقر على سطح المثانة أثناء التجفيف اللاحق. يمكن أن تظهر هذه القطرات إما ككرات صغيرة أو هياكل تشبه القرص منتشرة فوق العينة (الشكل 4D). يمكن تخفيف ذلك عن طريق ضمان إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الدهنية من حول المثانة. يمكن استبدال البلاتين بطلاء الإيريديوم ، ولكن يجب الحفاظ على السماكات إلى الحد الأدنى لتقليل إخفاء التفاصيل الهيكلية الدقيقة. يوصى بشدة باستخدام مرحلة دوارة أثناء الطلاء.

أحد قيود هذا النموذج هو أنه يتطلب عددا كبيرا من الفئران. فقط 65-80٪ من الفئران C57BL/6 سوف تزيل البيلة الجرثومية UPEC الخاصة بها وتكون مناسبة لتلقيح G. المهبلي أو PBS اللاحق (انظر الشكل 2C). للحصول على 10-12 فأرا لكل مجموعة (G. التطعيم المهبلي مقابل PBS) ، يجب أن يصاب حوالي 30 فأرا في البداية ب UPEC. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تجارب متعددة لتحقيق النسخ المتماثلة البيولوجية اللازمة للكشف عن الأهمية الإحصائية. عندما تم إعطاء التعرض على بعد 1 أسبوع، حدث ظهور UPEC في 14٪ من الفئران المعرضة ل PBS (الشكل 3B). وبالتالي ، فإن اكتشاف زيادة كبيرة في UPEC rUTI في الفئران المعرضة ل G. vaginalis بالنسبة لعناصر تحكم PBS (التي تعمل بالطاقة عند 0.8 ؛ alpha = 0.05 [جانب واحد]) يتطلب اختبار إجمالي تراكمي لا يقل عن 40 فأرا لكل مجموعة تعرض. وهناك اعتبار إضافي هو أن هذه التجارب مكلفة وكثيفة العمالة. يجب مراقبة الفئران أسبوعيا لإزالة UPEC والدورة الزمنية التجريبية هي 4-5 أسابيع اعتمادا على ما إذا كان يتم إعطاء G. vaginalis مرتين في إطار زمني 12 ساعة أو مرتين 1 أسبوع. SEM كثيف العمالة وقد يكون مكلفا ، اعتمادا على توافر المجهر ورسوم الخدمة. يوفر إعداد المثانة بأكملها ل SEM مادة وفيرة للتحليل ولكن العيب هو أن تحليل كل مثانة يمكن أن يستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، فمن المحتمل أنه لا يمكن تحليل سوى عدد محدود من المثانة بواسطة SEM مقارنة بأعداد الحيوانات الأعلى المستخدمة في عيارات البول والأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب الحصول على صور عالية الجودة للأسطح المنحنية ل “أكواب” المثانة مهارة بسبب الظلال التي يمكن أن تعيق الرؤية. على الرغم من أن SEM المثانة هي أداة مفيدة لتصور تقشير الظهارة البولية ، إلا أن هذه الطريقة نوعية إلى حد كبير. نظرا لأن العينة ثابتة في شكل دائري ، وبسبب استخدام glutaraldehyde في المثبت ، فإن فحص البكتيريا التي تعبر عن الفلورسنت عبر المجهر الضوئي غير ممكن. لا تتوافق الأصباغ المناعية والكيميائية مع هذه العملية بسبب استخدام glutaraldehyde الذي سيتقاطع مع معظم المستضدات والأوزميوم والذي سيخفي مواقع المستضدات ويغمق الأنسجة. ومع ذلك ، فإن تقنية SEM مفيدة للمعلمات التي يمكن تقييمها كميا دون استخدام مجسات إضافية ، مثل حجم الخلية48,49.

يقدم هذا النموذج العديد من المزايا التي تتجاوز الطرق الموصوفة سابقا. يسمح بفحص آليات UPEC rUTI الناجمة عن الخروج من خزانات المثانة ، بدلا من إعادة إدخالها في المثانة من مصدر خارجي. تستخدم نماذج أخرى من التهاب المسالك البولية بسبب ظهورها من خزانات المثانة عوامل كيميائية (كبريتات البروتامين أو الشيتوزان) للتسبب في تقشير المسالك البولية17,18 ، والتي لن تكون محفزات لالتهاب المسالك البولية لدى النساء. G. vaginalis هي بكتيريا بولية تناسلية منتشرة تم اكتشافها في البول الذي تم جمعه مباشرة من المثانة عن طريق القسطرة أو الشفط فوق العانة لدى بعض النساء23,26. هذه الحقيقة ، إلى جانب الارتباط المعروف بين BV (حيث ينمو G. vaginalis في المهبل) و UTI ، تشير إلى أن G. vaginalis هو محفز معقول سريريا ل rUTI. وأخيرا، تحافظ طريقة تثبيت المثانة في الموقع على البنية الفائقة للمثانة وتحد من الضرر، مما يضمن عدم انفصال طبقات المثانة عن بعضها البعض. الطرق السابقة لتصور urothelium تقليديا تجعل المستخدم يحصد معقما ، ويقسم ، ويتمدد ، ويعلق المثانة على صينية تشريح قبل غمر المثانة الممتدة في مثبت48. ينتج عن هذه الطريقة عينة مسطحة جدا ولكنها لا تضمن امتدادا متساويا أو طبيعيا للأنسجة ويمكن أن تؤدي إلى مناطق ممتدة أكثر فأقل (مما يؤدي إلى أنسجة شديدة التجاعيد) ويمكن أن تسبب انفصال طبقة المثانة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تسبب هذه التلاعب المادي للمثانة لتمديد الأنسجة وتثبيتها أضرارا ، بما في ذلك تقشير المسالك البولية. طريقة أخرى هي غمر المثانة السليمة في التثبيت قبل تضمينها في البارافين والحصول على أقسام رقيقة مع ميكروتوم. الأقسام الرقيقة لا تقدر بثمن لتجارب الكيمياء النسيجية المناعية لفحص البكتيريا وتوطين البروتين المضيف ولكن القسم الرفيع لا يسمح بتصور سطح الظهارة البولية. تسمح طريقة SEM هذه بفحص سطح المثانة بالكامل في وقت واحد.

كما هو موضح، تشمل التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج اختبار سلالات UPEC الأخرى لتحديد ما إذا كانت تشكل خزانات داخل الخلايا واختبار سلالات G. vaginalis الأخرى لتقييم ما إذا كانت تثير التقشير وظهور UPEC لتسبب rUTI. يمكن أيضا اختبار سلالات الفئران الأخرى التي تتجاوز C57BL/6 ، على الرغم من أن الفئران ذات الميل العالي للإصابة بالتهاب المثانة المزمن (مثل الفئران على خلفية C3H) غير مستحسنة ، حيث يجب إعدام الكثير من الفئران من التجربة. ميزة إضافية للفئران C57BL/6 هي أن العديد من سلالات الضربة القاضية الجينية متاحة تجاريا. توفر هذه السلالات فرصة لاستجواب العوامل المضيفة المشاركة في تكوين الخزان و / أو ظهوره.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون لين فوستر على المساعدة التقنية في تجارب العدوى ، وجيمس فيتزباتريك في مركز جامعة واشنطن للتصوير الخلوي (WUCCI) للوصول إلى SEM ، وسكوت هولتغرين على سلالة UTI89kanR UPEC ، وديفيد هونستاد على القراءة النقدية للمخطوطة.

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (زمالة أبحاث الدراسات العليا إلى VPO # DGE – 1143954) ، من قبل مركز أبحاث الأمراض المعدية للمرأة في كلية الطب بجامعة واشنطن (جائزة البحث التجريبي إلى NMG) ، من قبل جمعية القلب الأمريكية: #12POST12050583 (NMG) و #14POST20020011 (NMG) ، والمعاهد الوطنية للصحة ، NIAID: R01 AI114635 (ALL) و NIDDK: R21 DK092586 (الكل) و P50 DK064540-11 (SJH ، المشروع II PI: ALL) و K01 DK110225-01A1 (NMG). أجريت بعض الدراسات على الحيوانات في مرفق مدعوم بمنحة NCRR C06 RR015502. تم دعم مركز جامعة واشنطن للتصوير الخلوي (WUCCI ؛ حيث تم إجراء SEM) و MSJ من قبل كلية الطب بجامعة واشنطن ، ومعهد اكتشاف الأطفال بجامعة واشنطن ومستشفى سانت لويس للأطفال (CDI-CORE-2015-505) ، ومؤسسة مستشفى بارنز اليهودي (3770) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS086741). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t., et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329 (2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327 (2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586 (2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394 (2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341 (2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283 (2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99 (2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757 (2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  39. Gilbert, N. M., O’Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238 (2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042 (2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892 (2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070 (2010).
  48. O’Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196 (2016).
  49. O’Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457 (2018).

Tags

Recurrent UTIEscherichia ColiGardnerella VaginalisBladder ExposureMouse ModelUrogenital BacteriaBladder ExfoliationAnaerobic CultureBacterial InoculumUrine AnalysisCytospinPMNsEpithelial CellsCatheterizationBladder Exposure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
O’Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image