تطبيقات شل حركة أنسجة الدروزوفيلا مع جلطات فيبرين للتصوير الحي
Summary
يصف هذا البروتوكول تطبيقات تعطيل العينة باستخدام جلطات الفيبرين، والحد من الانجراف، والسماح بإضافة الكواشف وغسلها أثناء التصوير الحي. يتم نقل العينات إلى قطرة من الفيبرينوجين تحتوي على وسيطة الثقافة على سطح غطاء، وبعد ذلك يتم تحريض البلمرة عن طريق إضافة الثرومبين.
Abstract
Drosophila هو نظام نموذجي مهم لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يمكن استخراج الأعضاء والأنسجة المختلفة من مراحل النمو المختلفة للذبابة مثل الأقراص التصويرية أو الدماغ اليرقاني أو غرف البيض للإناث البالغات أو الأمعاء البالغة والاحتفاظ بها في الثقافة للتصوير بالمنظار الدقيق الفاصل زمنيا ، مما يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا الخلية والتطور. هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكولنا الحالي لتشريح أدمغة يرقات دروسوفيلا ، ثم نقدم نهجنا الحالي لشل وتوجيه أدمغة اليرقات والأنسجة الأخرى على غطاء زجاجي باستخدام جلطات فيبرين. تتطلب طريقة التجميد هذه إضافة الفيبرينوجين والثرومبين إلى وسيط الثقافة. وهي مناسبة للتصوير الفاصل الزمني عالي الدقة على المجاهر المقلوبة لعينات متعددة في طبق الثقافة نفسه ، وتقلل من الانجراف الجانبي الناجم في كثير من الأحيان عن حركات مرحلة المجهر في المجهر الزائر متعدد النقاط ويسمح بإضافة وإزالة الكواشف أثناء التصوير. كما نقدم وحدات الماكرو حسب الطلب التي نستخدمها بشكل روتيني لتصحيح الانجراف واستخراج ومعالجة معلومات كمية محددة من تحليل الفاصل الزمني.
Introduction
لا يزال دروسوفيلا نظاما نموذجيا مهما لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية وقد برع في تطوير المعرفة في العديد من التخصصات لعقود. ميزة واحدة تجعلها تبرز بشكل خاص هي أنها مناسبة بشكل خاص للتصوير الحي. القدرة على رصد العمليات دون الخلوية أو سلوك الخلايا والأنسجة في الوقت الحقيقي لا تزال تسهم في توليد المفاهيم الرئيسية ذات الصلة بيولوجيا الخلية والتنموية. وقد وضعت العديد من البروتوكولات الناجحة من قبل مجموعات مختلفة للحفاظ على هذه العينات Drosophila على قيد الحياة وصحية لدراسة سلوك العينة وجزيئات الفلورسنت الحية. يمكن استخراج الأعضاء والأنسجة من الذبابة مثل أقراص التصوير1،2، الدماغ اليرقات3،4،5،6، أو غرف البيض من الإناث البالغات7،8،9، أو الأمعاء البالغة10 على سبيل المثال وأبقى في الثقافة للتصوير بالمنظار الدقيق الفاصل زمنيا. يتمثل أحد التحديات الرئيسية للتصوير الحي في ضمان إبقاء العينة قريبة من سطح التصوير للحصول على الدقة المثلى وغير متحركة دون المساس بسلامة العينة التي يمكن أن تكون حساسة للتأثيرات الميكانيكية. لدراسة الخلايا الجذعية العصبية ، وتسمى الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية في الدماغ اليرقات Drosophila ، على سبيل المثال ، يمكن تحقيق إبقاء عينات قريبة من سطح التصوير من خلال تغطيتها مع وسائل الإعلام الثقافية في غرف التصوير مختومة11،12،13. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح بسهولة تبادل وسائل الإعلام مما يحد من المجال التجريبي للمناورة. بدلا من ذلك، يمكن إعداد العينات ووضعها على coverlips تعامل لزيادة التصاق الخلايا والسماح متعددة النقاط زيارة المجهر والتصوير الموسع للخلايا الحية في أطباق الثقافة المفتوحة، التي يحتمل أن تسمح تبادل وسائل الإعلام، ولكن لا توفر وسيلة سهلة لمنع الانجراف عينة أو فقدان خلال تبادل وسائل الإعلام14،15.
طريقة جلطة فيبرين وضعت أصلا لدراسة الخلايا المنوية الحية رافعة ذبابة16 مناسبة خصيصا للتغلب على هذه المشاكل. يذوب الفيبرينوجين في وسط الثقافة ذات الصلة ، ويتم وضع العينات وتوجيهها في قطرة من هذا المحلول على غرفة تصوير كافية على السطح الزجاجي قبل إضافة Thrombin ، مما يؤدي إلى تكوين سريع لجلطة فيبرين غير قابلة للذوبان ، وهي شبكة ليفية لزجة تلتزم بالسطح الزجاجي والعينات مع ضمان وصول العينة إلى وسيط الثقافة. ويمكن بعد ذلك تبادل الوسط دون اضطراب وضع الجلطة أو العينة. تبادل الثقافة المتوسطة أثناء التصوير هو، على سبيل المثال، مرغوب فيه عندما يتم إضافة مثبطات كما هو الحال في الطريقة الأصلية أو لغسل أو نبض مطاردة التجارب أو عندما الأصباغ الفلورية هي أن تضاف أثناء تصوير الخلايا الحية مع الحفاظ على الخلايا والأنسجة في مكانها. جلطات الفيبرين مناسبة لتصوير أنسجة الدروزوفيلا وكذلك الخلايا الفردية13،17. يمكن استخدام جلطات الفيبرين كذلك للمساعدة في توجيه العينات ، وذلك بسبب شكلها أو خصائص أخرى عادة لا تكون موجهة بالطريقة المطلوبة عن طريق تعديل موضع العينة داخل جلطة فيبرين وشكل الجلطة نفسها.
هنا نقدم تحديثا على أساليب التصوير الحالية القائمة على تجلط فيبرين وتوفير أدوات لتحليل الصور القائمة على التقسيم والتركيز على استخدام هذه الطريقة لدراسة الانقسامات الأرومية العصبية في الدماغ ذبابة النامية. نحن نستخدم بشكل روتيني طريقة جلطة فيبرين لمتابعة عينات متعددة في جلطات مختلفة في نفس طبق الثقافة. وهذا يسمح 1) تصوير الأحداث دون الخلوية مثل السلوك المركزي أو توطين ميرنا يعيش18،19، 2) رصد سلوك العينات على العلاج الدوائي من الأنماط الجينية المختلفة تحت نفس إعدادات التصوير باستخدام زيارة متعددة النقاط المجهر20، 3) دراسة آثار تثبيط حاد من الانزيمات21 و iv) التقليل من الانجراف لدراسة التغيرات في اتجاه انقسام الخلايا داخل بيئتها الفسيولوجية على المستهدفة الليزر الاستئصال22. في حين أن الآثار غير المرغوب فيها من ثروبين وفيبرينوجين وتجلط فيبرين تحتاج إلى اختبار تجريبي لكل عينة، هذه الطريقة هي من حيث المبدأ مناسبة لشل أي نوع من العينة التي سيتم تحليلها عن طريق التصوير بالخلايا الحية وفي Drosophila وقد استخدمت بنجاحلدراسةجوانب متعددة من بيولوجيا الخلايا العصبية 5،19،20، ولكن أيضا ديناميات توقعات cytosensor من الخلايا الجذعية خط الجرثومية الإناث23 والتغيرات في القطبية على تثبيط APKC الحاد للخلايا بصيلات الخلايا الإناث Drosophila 21.
يؤدي التصوير الفلوري الفاصل زمنيا إلى إنشاء مجموعات بيانات ثلاثية الأبعاد معقدة تم حلها زمنيا وتتطلب طرقا لاستخراج هذه المعلومات الكمية. هنا نصف تطورنا الإضافي ل24 ماكرو المستندة إلى ImageJ والتي يمكن استخدامها لتصحيح الانجراف في الهايبرستاكس ووحدات الماكرو ImageJ المصنوعة خصيصا التي تسمح بالكم شبه الآلي للفلورسنس متعدد القنوات في قشرة الخلية التي تم تطويرها لتحديد البروتينات القشرية في الخلايا العصبية لأدمغة يرقات Drosophila أو الخلايا العصبية الفردية في زراعة الخلايا الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر التصوير الحي لأدمغة يرقات جبل D. melanogaster الكامل الفرصة لمراقبة انقسامات الخلايا الجذعية العصبية غير المتماثلة في ظروف قريبة من السياق الفسيولوجي. يقدم الجزء الأول من بروتوكولنا نهجنا بشأن تشريح أدمغة اليرقات. كما ذكر بالفعل13, جانب حاسم من التحضير هو تجنب الإضرار الدماغ. الجانب الأكثر تحديا من هذا هو فصل الدماغ من الأقراص التصويرية المجاورة دون سحب مفرط على الدماغ. نهجنا ل “قطع دون سحب” هو أداء إما حركة طحن مع نصائح من زوج واحد من ملقط، أو الشريحة نصائح ملقط على طول اثنين من النصائح ملقط أخرى عقد العلاقة بين الأنسجة(الشكل 1A)في حين أن ليريت وآخرون وصف حركات تشبه المنشار مع دبوس تشريح. ننصح المجرب بتجربة جميع النهج واعتماد النهج الأنسب لأنفسهم. نقترح أيضا استخدام نصائح ماصة مغلفة ب BSA أو FCS بدلا من أدوات التشريح لنقل الأدمغة المعزولة. يمنع الطلاء الأنسجة من الالتصاق بالبلاستيك ويسمح بالانتقال الآمن للأنسجة مع إبقائها دائما مغمورة تماما ، دون تعريضها لتشوه عابر محتمل لأنها تلتزم أداة التشريح أثناء النقل. نصائح مغلفة لها مزايا أخرى للسماح بنقل العديد من العقول في وقت واحد، وهو أمر مفيد بشكل خاص عندما يكون من الأهمية بمكان للسيطرة على وقت الإقامة من العينات داخل وسيلة معينة؛ فهي مناسبة لنقل الأنسجة الأخرى، حتى تلك الهشة مثل، على سبيل المثال، الأجسام الدهنية. أنها يمكن أن تستوعب مجموعة واسعة من أحجام عينة مختلفة باستخدام نصائح أكبر أو قطع أقصى الطرف.
بعد ذلك ، يصف هذا البروتوكول استخدام تخثر الفيبرينوجين لشل حركة أدمغة اليرقات على غطاء طبق الثقافة. يتم توجيه الدماغ داخل قطرة من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين، وبعد ذلك يتم تحفيز التخثر عن طريق إضافة Thrombin. تشكيل الفيبرين تدريجيا ، مما يوفر نافذة زمنية يمكن خلالها ضبط اتجاه العينة ، إذا لزم الأمر(الشكل 2C). إذا كان هناك حاجة إلى ضغط طفيف للعينة – وهو ما ننصح بعدمه في حالة أدمغة اليرقات – يمكن أيضا تعديله بدقة عن طريق الضغط على الجلطة بشكل أو بآخر بالقرب من العينة خلال الخطوتين 3.4.4 و 3.5.2. الميزة الرئيسية لهذا تخثر الفيبرينوجين على البروتوكول الموصوف في Lerit وآخرون ، والتي يتم فيها تركيب الأدمغة بين غشاء نفاذية للغاز وأغطية ، هي القدرة على استبدال وسيط الثقافة أثناء التصوير الحي. يمكن أن تكون الميزة المحتملة لاستخدام غشاء نفاذية الغاز على بروتوكولنا أنه يوفر الأكسجين الأمثل للعينات، والتي يمكن أن تكون أكثر محدودية مع نهجنا كما يتم فصل العقول من الهواء عن طريق الجلطة وبعض المتوسطة. لهذا السبب ، على الرغم من أننا لم نقيم تأثير كمية الثقافة المتوسطة داخل طبق الثقافة ، نقترح الحد من كمية الثقافة المتوسطة فوق الجلطات مع الحفاظ على الجلطات مغمورة تماما.
وبما أن التلاعب بالجلطات يمكن أن يكون صعبا من الناحية التجريبية ويستغرق وقتا طويلا، فإننا نوصي بأن يمارس المجرب أولا التلاعب بالجلطات دون عينات. تعديل حجم انخفاض متوسطة الثقافة + فيبرينوجين على غطاء، وتركيز الفيبرينوجين أو حجم وتركيز Thrombin يمكن أن تساعد في جعل إعداد أسهل ويمكن أن تكون مهمة عند تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من الأنسجة. مع ما يكفي من الخبرة في التلاعب بالجلطات ، يمكن شل حركة العديد من الأدمغة في جلطة واحدة إذا لزم الأمر ، على الرغم من أنها تعقد الضبط الدقيق للتوجه. يمكن تشكيل العديد من الجلطات على غطاء الغطاء ، مما يسمح ، على سبيل المثال ، بتصوير عينات من أنماط جينية مختلفة. ومن الممكن أيضا لفضح جلطات مختلفة على نفس coverslip إلى وسائل الإعلام الثقافية المختلفة، على الرغم من أن الرعاية يجب أن تؤخذ أبدا لخلط قطرات من الثقافة المتوسطة التي تغطي جلطات مختلفة. بمجرد أن يتم شل حركة أدمغة اليرقات وجاهزة للتصوير الحي ، ننصح باتباع توصيات Lerit et al.13 لتجنب الفوتوداماج المفرط. نضيف فقط إلى هذه التوصيات ليس فقط للحفاظ على العقول في 25 درجة مئوية أثناء التصوير الحي مع حاضنة المرحلة، ولكن أيضا لتسخين هذه المرحلة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التصوير. وفي أيدينا، يؤدي الفشل في القيام بذلك بشكل منهجي إلى انجراف تركيز قوي.
يمكن أن يكون من المفيد في بعض السياقات أن تكون قادرة على إجراء المجهر المترابطة وإصلاح والمناعةالحصول على عينة بعد التصوير الحي. ومع ذلك ، فإن الحد من استخدام جلطات فيبرين هو أنه يكاد يكون من المستحيل عزل الدماغ ميكانيكيا من جلطة دون الإضرار بها. وهناك طريقة ممكنة للتغلب على هذا القيد يمكن أن يكون لتطوير أساليب لتحلل جلطات فيبرين مع بلازمين أو للحث على تفكيك جلطة بإضافة الببتيد تحاكي المقابض السماح فيبرين البلمرة28. نحن عادة ما نستخدم جلطات الفيبرين على عينات تتراوح بين خلايا واحدة إلى أنسجة طويلة 200 ميكرومتر ، ولكن يمكننا أيضا شل حركة الجلطات وأدمغة الصور من النحل البالغ الذي يزيد عرضه عن 3 مم. الحد الأعلى لحجم العينة التي يمكن شل حركتها في الجلطات لا يزال يتعين تحديده. وبالمثل ، على الرغم من أننا عادة ما نقوم بتصوير العينات المشلومة لمدة 4 إلى 5 ساعة ، إلا أننا نجحنا في تصوير الخلايا العصبية في الثقافة الأولية لمدة تصل إلى 3 أيام ، مما يشير إلى أن الجلطة على الأقل لا تتداخل مع الجدوى على المدى الطويل. على العكس من ذلك ، يمكن أن تسهل الجلطات الاستبدال المنتظم للوسط ، وهو شرط للتصوير على المدى الطويل ، دون الحاجة إلى أجهزة مثل المضخات العصاهر لهذا الغرض. في حين أننا لم نقيس المعلمات نفاذية جلطات الفيبرين ، فإن الطبيعة الليفية الشبيهة بالجل للجلطات تبدو قابلة للانشجار بواسطة جزيئات نفاذية الخلية. وجدنا أن لاتورونكولين A، Colcemid أو 1-NAPP1، هالو تاغ ليغاندس وغيرها من الأصباغ القياسية المستخدمة في بيولوجيا الخلية تصل إلى الخلايا في جلطة الفيبرين دون أي مشاكل وحتى الآن لم تواجه الجزيئات التي سيتم الاحتفاظ بها من قبل الجلطة، والتي، ومع ذلك، هو احتمال يحتاج إلى اختبار تجريبي.
في الختام ، باستخدام جلطات فيبرين توفير موثوق بها وسهلة نسبيا لتنفيذ وسيلة لشل الأنسجة الحية للتصوير الحي. وراء فائدتها في الحد من الانجراف الجانبي ، أثبتت القدرة على تغيير وسيط الثقافة أثناء التصوير الحي أنها لا تقدر بثمن لنهجنا في علم الوراثة الكيميائية لدراسة انقسام الخلايا غير المتماثلة في الخلايا العصبية D. melanogaster 21. نتوقع أن تكون هذه التقنية مفيدة للدراسات في مجموعة واسعة من الأنسجة المختلفة ، خاصة إذا كانت تنطوي على علم الوراثة الكيميائية أو ، على سبيل المثال ، وضع العلامات الذاتية للبروتين29.
يعتمد ماكرو MultiHyperStackReg لدينا على المكون الإضافي TurboReg ImageJ ، والذي يحاذي الإطارات المتتالية أو شرائح المكدس ، والمكون الإضافي MultiStackReg ImageJ ، والذي يسمح بتطبيق التحولات على أكوام أخرى. MultiHyperStackReg ببساطة يسمح لتطبيق هذه التحولات على hyperstacks (مكدسات مع أربعة أبعاد على الأقل). كما استخدام MultiHyperStackReg، كما وصفها، يتطلب الكثير من الإجراءات ويمكن الحصول على مضيعة للوقت تماما، كتبنا أيضا الماكرو AutoHyperStackReg، الذي ينفذ تلقائيا جميع الخطوات المذكورة في الخطوتين 6.2 و 6.3. ومع ذلك ، خلافا لMultiHyperStackReg ، AutoHyperStackReg تفتقر حاليا إلى إمكانية لحساب محاذاة كومة على أساس منطقة دون إقليمية من هذا المكدس ، وهو الخيار الذي وجدناه هو في بعض الأحيان حاسمة لمحاذاة مرضية. وهناك قيد آخر من AutoHyperStackReg هو أن يقتصر استخدامه على الترجمات وليس التحولات الأخرى المقترحة من قبل TurboReg وMultiStackReg، في حين MultiHyperStackReg يمكن أن تنطبق على hyperstack أي نوع التحول إذا كان المستخدم في حاجة إليها. ستنفذ الإصدارات المستقبلية هذه الوظائف وستكون متاحة على GitHub30. وأخيرا، يوفر الماكرو الدوار لدينا طريقة سهلة لقياس الإشارات القشرية بسرعة في الهفوات الزمنية، حتى لو غيرت القشرة موضعها أو اتجاهها بمرور الوقت. ما إذا كان وضع التتبع أو وضع عدم التتبع هو الأنسب للتحليل يعتمد على جودة واتساق الإشارة القشرية. وضع التتبع أسهل في الاستخدام حيث لا يحتاج المستخدم إلى النظر في مكان القشرة لكل نقطة زمنية ويمكن أن يستوعب تغييرات كبيرة في الموضع والتوجه بمرور الوقت. ومع ذلك ، فهي مناسبة فقط إذا كانت الإشارة القشرية لا تزال قوية بما يكفي للكشف خلال الفيلم بأكمله: الفشل في الكشف عن أي شيء آخر غير القشرة (على سبيل المثال ، مقصورة السيتوبلازمية الساطعة القريبة من القشرة) يمكن أن يعرض الكشف عن كل نقطة زمنية تالية للخطر (على سبيل المثال ، تتحرك المقصورة السيتوبلازمية بعيدا عن القشرة ويتبعها الخطوط القشرية لبقية الفاصل الزمني). لا يوجد في وضع عدم التتبع هذا المأزق حيث يقتصر الكشف على الخط الذي رسمه المستخدم في الأصل (على سبيل المثال ، قد تتسبب مقصورة السيتوبلازمية الساطعة في فشل الكشف لبضع نقاط زمنية ، ولكن مع تحرك المقصورة السيتوبلازمية بعيدا عن منطقة الكشف ، يستأنف الكشف المناسب عن القشرة) ، ولكنه لا يتصرف بشكل جيد إذا تغير موضع القشرة أو اتجاهها كثيرا بمرور الوقت. الميزة التالية (التي ستكون متاحة على GitHub30)التي سيتم تطويرها لوضع التتبع ستكون خيار تحليل النقاط الزمنية المحددة فقط وتحديد نقطة زمنية مرجعية (بدلا من النقطة الزمنية الأولى) قبل وبعد ذلك سيتم إجراء الكشف ، مما سيسمح للمستخدم بتجنب النقاط الزمنية الإشكالية على الأقل.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم العمل في مختبر Januschke من قبل ويلكوم الاستئماني منح 100031/Z/12/A و 1000032/Z/12/A. ويدعم مرفق تصوير الأنسجة من قبل منحة WT101468 من ويلكوم.
Materials
| Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
| Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
| FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
| Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |
Riferimenti
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
- Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
- Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- . ImageJ macros [software] Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020)
