Evaluación del impacto de la fracturación hidráulica en las corrientes utilizando firmas moleculares microbianas

1. Recogida de muestras de sedimentos para la extracción de ácidos nucleicos Sumergir un tubo cónico estéril de 50 ml en el agua de la corriente. Use guantes durante la recolección de muestras para evitar la introducción de contaminación humana no deseada. Realice este paso ya sea desde la orilla o mirando río arriba si está en el agua. Mientras el tubo cónico está sumergido, retire la tapa y úselo para recoger aproximadamente 3 ml de sedimento de una profundidad de 1 a 3 cm en el tubo cónico. Retire el tubo cónico del agua y vierta toda el agua, excepto una capa delgada que cubra la muestra de sedimento (aproximadamente 1 ml). Utilizando una pipeta de 1000 μL y puntas de pipeta apropiadas, agregue 3 ml de conservante de ADN/ARN (consulte la Tabla de materiales para las especificaciones del conservante) a la muestra recolectada. Mantenga las puntas de la pipeta en una caja de punta de pipeta estéril y solo conéctelas inmediatamente antes de su uso y deséchelas después de su uso. Invierta el tubo cónico tapado 10 veces para garantizar que el conservante y la muestra se mezclen a fondo.NOTA El paso 1.4 no es necesario, pero se recomienda encarecidamente si el ARN se va a extraer de los sedimentos más adelante. Coloque las muestras en hielo para el resto de la recolección de muestras. Al regresar de la recolección, almacenar en un congelador a -20 °C si las muestras se van a utilizar para el análisis 16S (ADN), o -70 °C, si se van a utilizar para el análisis metatranscriptómico (ARN). 2. Recolección de filtros para la extracción de ácidos nucleicos Retire la tapa de una botella estéril de 1 L. Mientras mira río arriba o desde la orilla, llene la botella con agua de arroyo hasta la parte superior y luego vásquela. Repita este proceso dos veces más para acondicionar la botella. Llene toda la botella por cuarta vez y colmo.NOTA: Si reutiliza una botella de 1 L, se puede esterilizar enjuagando con lejía al 10% durante 2 min, seguido de enjuagar tres veces con agua desionizada y luego una vez con etanol al 70%, y finalmente en autoclave con ajustes: 30 min de tiempo de exposición a 121.1 ° C y 15 min de tiempo de secado. Durante el autoclave, la tapa de la botella debe estar muy suelta para evitar que la botella se comprima en el proceso. Una vez en una superficie estable, use una jeringa de bloqueo Luer estéril y extraiga un volumen completo. Luego conecte la jeringa a un filtro de polietersulfona estéril y libre de ADN / ARN de 1,7 cm de diámetro con un tamaño de poro de 0,22 μm y empuje todo el volumen a través del filtro presionando el émbolo hacia abajo. Repita este proceso hasta que el volumen total recogido en la botella (1 L) se empuje a través del filtro.NOTA: El volumen de la jeringa puede ser variable, si se rastrea la cantidad total de agua empujada a través del filtro. Sin embargo, en general, se prefieren 60 ml. Si bien 1 L es ideal, anecdóticamente, un volumen de al menos 200 ml probablemente aún recolectaría suficiente biomasa (suponiendo ~ 20,000 células por ml) para la extracción de ADN y ARN. Elimine el exceso de agua del filtro extrayendo aproximadamente 20 ml de aire en la jeringa y empujándola a través del filtro.NOTA: Esto ayudará a prevenir la pérdida del conservante si se realiza el paso 2.4. Usando una micropipeta P1000, agregue 2 ml de un conservante de ADN / ARN descargándolo a través de la abertura más grande del filtro (donde estaba unido a la jeringa) mientras sostenía el filtro horizontalmente. La punta de la pipeta debe estar dentro del barril del filtro cuando la pipeta se presiona para garantizar que el conservante entre en el filtro. Cambie la punta después de cada uso.NOTA: Al igual que con la recolección de sedimentos, este paso no es necesario, pero se recomienda encarecidamente para aumentar el rendimiento de ácidos nucleicos más adelante, especialmente para el ARN. Despegue un cuadrado de película de parafina y envuélvalo firmemente alrededor de cada abertura / extremo del filtro para sellar. Coloque el filtro envuelto en película de parafina en una bolsa de muestra estéril y luego coloque toda la bolsa sobre hielo durante la recolección.NOTA: Asegúrese de que el lado utilizado para envolver el filtro sea estéril, es decir, no expuesto previamente al medio ambiente. A la vuelta del muestreo, almacene los filtros a -20 °C para 16S o -70 °C para meta-transcriptómica. 3. Extracción y cuantificación de ácidos nucleicos Limpie el área de trabajo con 10% de lejía y 70% de etanol antes de comenzar la transferencia de muestras. Para sedimentos (a partir del paso 1.5), generalmente, use ~ 0.25 g de muestra. Esterilizar con llama una herramienta de metal sumergiéndola en un beaker de etanol al 70% y quemando el etanol entre muestras. Para los filtros (a partir del paso 2.6), mueva el papel de filtro a un tubo estéril para su extracción. Para hacerlo, siga los pasos a continuación. Cree una superficie libre de ADN y ARN estéril doblando papel de aluminio para que la parte interna del pliegue no esté expuesta al entorno exterior y autoclave la pieza plegada con los ajustes: 121.1 ° C y 5 min de tiempo de secado. Esterilizar un vise-grip con etanol al 70% y una llama abierta. A continuación, utilice la empuñadura para abrir la carcasa del filtro en la superficie estéril y retire el núcleo de la carcasa. Use un bisturí estéril para cortar el papel de filtro lejos del núcleo cortando en la parte superior e inferior y luego a lo largo de la costura. Doble el papel de filtro con pinzas estériles y luego corte el filtro en trozos pequeños con el bisturí. Coloque las piezas del filtro en un tubo de microcentrífuga para su extracción. Asegúrese de que el papel de filtro no entre en contacto con ninguna superficie que no esté esterilizada o que pueda tener ácido nucleico presente, ya que esto conduciría a una contaminación no deseada de la muestra. Realizar el aislamiento de ADN como se describió anteriormente13 o mediante el uso de un kit basado en columnas disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). Los pasos para el kit comercial enumerados se describen brevemente a continuación. Lise las células dentro de la muestra transfirísquela a un tubo de perlas y sometándola a un disruptor celular a alta velocidad durante al menos 5 minutos. Centrifugar y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril. Agregue el tampón de lisis al sobrenadante (volumen 1: 1) y transfiéralo al filtro proporcionado (amarillo). Centrifugar el filtro. Transfiera el filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Agregue el tampón de preparación (400 μL), centrífuga y deseche el flujo. Agregue el tampón de lavado (700 μL), centrífuga y deseche el flujo. Luego agregue el tampón de lavado (400 μL), centrífuga y deseche el flujo nuevamente. Transfiera el filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Elute con 50 μL de agua libre de DNasa/RNasa y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente antes de centrifugar. Durante ese período de cubación, prepare el filtro III-HRC colocándolo en un tubo de recolección y agregándole la solución de preparación HRC (600 μL), seguido de un paso de centrifugación de 3 min a 8,000 x g. Mueva el filtro preparado a un tubo de microcentrífuga estéril. Transfiera el ADN eluido del paso 3.4.5 a este filtro y centrífuga a 16.000 x g durante 3 min. El flujo a través contiene el ADN extraído. Almacene extractos de ADN tanto para sedimentos como para filtros a -20 °C.NOTA: Los extractos de ADN se pueden almacenar durante unos 8 años a -20 °C asumiendo una temperatura estable, una exposición limitada a la luz y sin contaminantes dañinos14. Realice el aislamiento de ARN según el protocolo del fabricante. Conservar los extractos de ARN a -80 °C. Lise las células dentro de la muestra transfirísquela a un tubo de perlas y sometúyla a un disruptor celular a alta velocidad durante al menos cinco minutos. Centrifugar y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril. Agregue el búfer de lisis al sobrenadante (volumen 1:1) y transfiéralo a la columna proporcionada (amarillo). Centrifugar la columna. Agregue un volumen igual de etanol 95-100% al flujo y mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Coloque la columna IICG (verde) sobre un tubo de microcentrífuga estéril. Transfiera la solución mixta a la columna y la centrífuga. Agregue el tampón de lavado (400 μL), centrífuga y deseche el flujo. Añadir 5 μL de DNasa I y 75 μL de tampón de digestión de ADN a la columna e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregue el búfer de preparación (400 μL), centrífuga y deseche el flujo. Agregue el tampón de lavado (700 μL), centrífuga y deseche el flujo. Luego agregue el tampón de lavado (400 μL), centrífuga y deseche el flujo nuevamente. Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Elute con 50 μL de agua libre de DNasa/RNasa y dejar reposar durante 5 min antes de centrifugar. Durante ese período de incubación, prepare el filtro III-HRC colocándolo en un tubo de recolección y agregándole la solución de preparación HRC (600 μL), seguido de un paso de centrifugación de 3 min a 8,000 x g. Mueva el filtro preparado a un tubo de microcentrífuga estéril. Transfiera el ARN eluido del paso 3.6.9 a este filtro y centrífuga a 16.000 x g durante 3 min. El flujo a través contiene el ARN extraído.NOTA: Los extractos de ARN solo se pueden almacenar durante un año antes de que comiencen adegradarse 15. Tanto los extractos de ADN como los de ARN se degradan por congelación y descongelación repetida. Algunos protocolos permiten la extracción tanto de ADN como de ARN de la misma muestra16,17. Cuantificar las muestras de ADN y ARN extraídas utilizando un fluorómetro o un espectrofotómetro. Véase la Tabla 1, por ejemplo, los valores de concentración de ADN del fluorómetro. Para un ejemplo de protocolo de cuantificación de espectrofotómetros, véase la referencia18. Los valores de concentración de ADN de sedimentos con el kit enumerados en la Tabla de materiales generalmente varían de 1 a 40 ng / μL, mientras que los valores de concentración de ADN de filtro tienden a variar de 0.5 a 10 ng / μL. Los valores de concentración de ARN de sedimentos con el kit enumerado en la Tabla de materiales generalmente varían de alrededor de 1 a 20 ng / μL, mientras que los valores de concentración de ARN de filtro tienden a ser más bajos, típicamente oscila entre 0,5 y 5 ng/μL. 4. Creación de la biblioteca 16S rRNA Limpie el área de trabajo con 10% de lejía y 70% de etanol. El área de trabajo debe ser un espacio cerrado capaz de producir condiciones de flujo laminar (campana de flujo laminar). Utilice los extractos de ADN (del paso 3.5) y prepare muestras para la secuenciación de amplicones de ARNr 16S con un protocolo de PCR estándar, como el descrito en el sitio web del Microbioma de la Tierra que amplifica la región hipervariable V4 de 16S rRNA19 en condiciones de flujo laminar. Prepare un gel de agarosa al 2% como se describió anteriormente y deje que se solidifique17. Mezclar 7 μL de producto de PCR y 13 μL de agua libre de DNasa. Agregue un tinte de carga de gel a una concentración final de 1x. Una vez que la agarosa esté solidificada, cargue esta mezcla de productos de PCR en un gel de agarosa al 2%.NOTA: Alternativamente, se puede usar un gel pre-fundido en su lugar, ya que estos geles funcionan más rápido y vienen pre-hechos. Ejecute el gel a 90 V durante 60-90 minutos para verificar el tamaño de la banda de 386 como amplificación exitosa para amplicones 16S rRNA V4, utilizando el protocolo del Microbioma de la Tierra. 5. Purificación de la biblioteca de ARNr ADN 16S Agrupar 10 μL de productos de PCR para las muestras que produjeron bandas brillantes y 13 μL para las muestras que produjeron bandas débiles en un tubo de microcentrífuga estéril de tamaño adecuado. Verifique la concentración de la piscina resultante con un fluorómetro o espectrofotómetro y prepare un gel de agarosa al 2% como antes. Idealmente, la piscina debería tener una concentración de al menos 10 ng/μL, y la mayoría de las muestras deberían haber tenido una concentración de alrededor de 25 ng/μL. Si la concentración y el volumen lo permiten, cargue alrededor de 150-200 ng en un pozo de gel de agarosa al 2%. Ejecute el gel durante 60-90 minutos a 90 voltios. Purifique la biblioteca agrupada ejecutando un gel de agarosa al 2%. Elimine la banda de ADN de 386 pb del gel y purifique la biblioteca agrupada utilizando un kit disponible comercialmente como se describió anteriormente20. Elute el ADN purificado con 30 μL de 10 mM Tris-Cl (pH 8.5). Realice este paso en un área diferente a la extracción de ADN o ARN para evitar futuras contaminaciones, ya que cortar el gel extenderá los amplicones de PCR tanto en el experimentador como en el área circundante. Compruebe la concentración de la piscina purificada utilizando un fluorómetro o espectrofotómetro. Si la purificación fue bien, su concentración debe ser al menos la mitad de la de la piscina no purificada. Generalmente, la concentración final debe oscilar entre 5 y 20 ng/μL. Envíe las bibliotecas purificadas para la secuenciación de próxima generación. Asegúrese de que se mantengan fríos durante el transporte incluyendo hielo seco en el contenedor de envío. 6. Creación y purificación de bibliotecas de ARN Se pueden utilizar varios kits comerciales para crear bibliotecas de ARN. Para cualquiera que sea el que se utilice, siga el protocolo del fabricante tal como está escrito mientras trabaja en un entorno de flujo laminar estéril. Una versión muy resumida del protocolo para kit en la Tabla de Materiales se presenta a continuación21. Haga la primera mezcla maestra de síntesis de CDNA de hebra (8 μL de agua libre de nucleasa y 2 μL de First Strand Synthesis Enyzme Mix) y agréguela a la muestra. Coloque la muestra en el termociclador con las condiciones especificadas en el protocolo. Haga la mezcla maestra de síntesis de ADNc de la segunda hebra (8 μL de tampón de reacción de síntesis de segunda hebra, mezcla de enzimas de síntesis de segunda hebra de 4 μL y 48 μL de agua libre de nucleasa) en hielo y agréguela a la muestra. Colocar en un termociclador a 16 °C durante una hora. Purificar la reacción añadiendo las perlas proporcionadas (144 μL) y realizando dos lavados de etanol al 80% (200 μL). Elute con el tampón TE proporcionado (53 μL) y transfiera 50 μL del sobrenadante a un tubo de PCR limpio. Coloque el tubo de PCR sobre hielo. Haga la mezcla maestra de preparación final (7 μL de End Prep Reaction Buffer y 3 μL de End Prep Enzyme Mix) sobre hielo y agréguela al tubo de PCR. Coloque el tubo de PCR en un termociclador con las condiciones especificadas en el protocolo. Mezcle las soluciones de adaptador diluido (2,5 μL), mezcla maestra de ligadura (30 μL) y potenciador de ligadura (1 μL) sobre hielo. Añadir las soluciones mixtas a la muestra y colocar en un termociclador durante 15 min a 20 °C. Purifique la reacción agregando las perlas proporcionadas (87 μL) y realizando lavados de etanol (200 μL) y elución como antes, excepto solo agregar 17 μL de TE. Añadir índices (10 μL) y la solución Q5 Master Mix (25 μL) y colocar en un termociclador con las condiciones descritas en el protocolo. Purificar la reacción añadiendo las perlas proporcionadas (45 μL) y realizando una adición de dos lavados de etanol (200 μL) y elute con 23 μL de TE. Transfiera 20 μL a un tubo de PCR limpio. Verifique las bibliotecas para detectar concentraciones detectables de ARN usando un bioanalizador, fluorómetro o espectrofotómetro. Acondicione las bibliotecas metatranscriptómicas en una proporción aproximadamente equimolar. Purificar la biblioteca siguiendo el mismo protocolo para la purificación de la biblioteca 16S, excepto los fragmentos de impuestos especiales entre 250 y 400 pb. Mientras que la biblioteca 16S tenía una banda distinta que representaba la región amplificada, el resultado aquí es una mancha. Compruebe la concentración de la biblioteca purificada como antes. Envíe la biblioteca purificada con hielo seco a una instalación de secuenciación.NOTA: Alternativamente, los extractos de ARN se pueden enviar a una universidad o empresa privada para la preparación y secuenciación de la biblioteca. 7. Análisis de la comunidad microbiana Una vez completada la secuenciación, acceda a los datos de muestra. Descárguelo a una computadora utilizable.NOTA: Idealmente, el dispositivo debe tener al menos 16 gigabytes de RAM. Para obtener una discusión sobre los requisitos informáticos (para Qiime2), consulte https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808. Utilice software, como mothur, QIIME2 y R, para analizar los datos de ARNr 16S. Consulte aquí https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ para ver un tutorial de análisis QIIME2 16S de ejemplo. Para los datos de metatranscriptómica (ARN), utilice HUMAnN2 y ATLAS para determinar qué genes y vías están presentes en las muestras.NOTA: En el archivo de información suplementaria se presenta un ejemplo de canalización de metatranscriptómica que culmina en diversidad y análisis aleatorio de bosques. Todos los comandos se ejecutan a través de la línea de comandos, por ejemplo, Terminal para usuarios de Mac.