Кристаллография нейтронного белка является структурным методом, который позволяет локализовать атомы водорода, тем самым обеспечивая важные механистические детали функции белка. Здесь представлен рабочий процесс монтажа кристалла белка, сбор данных о дифракции нейтронов, уточнение структуры и анализ карт плотности длин рассеяния нейтронов.
Нейтронная кристаллография – это структурный метод, который позволяет определять положения атомов водорода в биологических макромолекулах, давая механистически важную информацию о состояниях протонации и гидратации, не вызывая радиационного повреждения. Рентгеновская дифракция, напротив, дает лишь ограниченную информацию о положении атомов света, а рентгеновский пучок быстро индуцирует радиационное повреждение светочувствительных кофакторов и металлических центров. Здесь представлен рабочий процесс, используемый для лучевых линий IMAGINE и MaNDi в Национальной лаборатории Оук-Ридж (ORNL) для получения структуры дифракции нейтронов после выращивания кристалла белка подходящего размера (> 0,1 мм3). Показано монтирование гидрогенизированных кристаллов белка в кварцевых капиллярах для сбора данных о нейтронной дифракции. Также представлен процесс парообмена смонтированных кристаллов с D2O-содержащим буфером для обеспечения замещения атомов водорода в обменных местах дейтерием. Включение дейтерия уменьшает фон, возникающий в результате некогерентного рассеяния атомов водорода, и предотвращает подавление плотности, вызванное их отрицательной когерентной длиной рассеяния. Стратегии выравнивания образцов и сбора данных о комнатной температуре иллюстрируются с использованием квази-Лауэ сбора данных в IMAGINE на изотопном реакторе с высоким потоком (HFIR). Кроме того, установка кристаллов и быстрое замораживание в жидком азоте для сбора криоданных для улавливания промежуточных продуктов лабильной реакции демонстрируется на приборе MaNDi по времени пролета в источнике нейтронов spallation (SNS). Также будет рассмотрен вопрос о подготовке файлов координатных и дифракционных данных модели и визуализации карт плотности плотности рассеяния нейтронов (SLD). Наконец, будет обсуждаться уточнение структуры по нейтронным данным только или по совместным рентгеновским/нейтронным данным для получения полноатомной структуры интересующего белка. Процесс определения нейтронной структуры будет продемонстрирован с использованием кристаллов литического полисахарида монооксигеназы Neurospora crassa LPMO9D, медьсодержащего металлопротеина, участвующего в деградации непокорных полисахаридов посредством окислительного расщепления гликозидной связи.
Нейтронная макромолекулярная кристаллография – это метод, который обеспечивает уникальное окно в структуру и основную химию белков. Концептуально похожая на рентгеновскую дифракцию, нейтронная дифракция обеспечивает атомистические детали макромолекулярной структуры, однако взаимодействие нейтронов с ядрами позволяет локализовать атомы света, которые часто трудно обнаружить при рентгеновской дифракции1. Во время дифракции рентгеновских лучей рентгеновские лучи рассеиваются из электронного облака, делая легкие атомы, такие как водород (H), плохо видимыми на картах электронной плотности, которые не имеют почти суб-Ångström разрешения2. Напротив, интенсивность рассеяния нейтронов зависит от сложных взаимодействий с ядром, при этом изотопы одного и того же элемента демонстрируют разную длину рассеяния. Таким образом, легкие атомы и их изотопы, такие как водород (1H) и дейтерий (2H или D), имеют сопоставимую видимость с основными атомами углерода, азота и кислорода в картах плотности рассеяния нейтронов (SLD). Кроме того, поскольку величина рассеяния нейтронов не зависит от количества электронов, рассеяние от легких элементов не затемняется тяжелыми элементами, когда они находятся в непосредственной близости друг от друга, как это наблюдается при рентгеновском рассеянии. Улучшенная видимость H и его изотопа D при использовании нейтронной дифракции дает ценную информацию о состоянии протонирования каталитически важных остатков, кофакторов и лигандов и облегчает ориентацию молекул воды, раскрывая важную информацию о каталитических механизмах и химии белка3. Нейтронная дифракция также предлагает преимущество в том, что она является неразрушающей техникой, особенно подходящей для биологических образцов, чувствительных к ионизации, таких как белки с металлическими центрами или светочувствительные окислительно-восстановительные кофакторы2. Основное внимание в этой статье уделяется обзору рабочего процесса для получения высококачественной кристаллической структуры нейтронного белка. Мы отсылаем заинтересованного читателя к Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 и O’Dell et al.3 для отличного обзора дифракции нейтронного белка и Ashkar et al.7 для дальнейшего применения рассеяния нейтронов.
Нейтроны в основном образуются в ходе ядерных реакций с использованием одного из двух процессов: ядерного деления в реакторных источниках или расщепления в ускорительных источниках8. Реакторные источники обеспечивают непрерывный пучок нейтронов, используя ядерное деление изотопа 235U, в то время как спальтационные источники нейтронов производят импульсный пучок нейтронов, бомбардируя мишень, например жидкий металл, такой как ртуть, протонами9. Национальная лаборатория Оук-Ридж (ORNL) в Оук-Ридже, штат Теннесси, содержит как стационарный источник нейтронов в изотопном реакторе с высоким потоком (HFIR), так и импульсный источник 60 Гц в источнике нейтронов сползания (SNS). Лучевая линия IMAGINE, расположенная в HFIR, представляет собой нейтронный дифрактометр, оптимизированный для биологических макромолекул (дополнительный рисунок 1)10. IMAGINE использует детектор нейтронных изображений для измерения квази-лауэских данных с использованием узкой полосы пропускания в диапазоне 2,8 – 4,5 Å от монокристаллов с единичными краями ячейки <150 Å. Макромолекулярный нейтронный дифрактометр (MaNDi), расположенный в SNS, представляет собой нейтронный дифрактометр времени пролета (TOF) Лауэ, оснащенный сферической системой детекторной решетки (DAF) (дополнительный рисунок 2)11. MaNDi измеряет данные от монокристаллов с краями элементных ячеек в диапазоне 10 – 300 Å, используя перестраиваемую полосу пропускания 2 Å-длин волны между 2,0 – 6,0 Å12.
Процесс генерации нейтронов является высокоэнергоемким, что приводит к относительно слабым потокам пучка нейтронов при контрастировании с потоками рентгеновского пучка на источниках синхротронов13. Для обеспечения достаточного соотношения сигнал/шум при сборе данных необходимо выращивать кристаллы подходящего размера и качества14. Как правило, кристаллы с объемами > 0,1 мм3 нужны для сбора данных с адекватной статистикой15. В дополнение к более низким потокам необходимо учитывать неотъемлемые свойства взаимодействия между нейтронами и ядрами образца16. Длина рассеяния нейтронов различается для изотопов одного и того же элемента, свойство, которое может быть выгодно использовано в рассеянии нейтронов под малым углом (SANS) для маскировки или выделения областей образца – процесс, известный как контрастное сопоставление17. В дифракционных экспериментах длина отрицательного когерентного рассеяния нейтронов H (-3,741 fm для 1H) может привести к подавлению характеристик карты плотности рассеяния нейтронов, поскольку длина рассеяния когерентных нейтронов других биологически значимых атомов, включая углерод (6,6511 fm для 12C), азот (9,37 fm для 14N), кислород (5,803 fm для 16O), фосфор (5,13 fm для 31P) и сера (2,804 fm для 32S), являются положительными (таблица 1)12,14. Кроме того, большая некогерентная длина рассеяния H (25,274 fm) увеличивает фон во время сбора данных, затрудняя качество набора данных и ставя под угрозу разрешение данных7. Чтобы обойти эти ограничения, введенные H, необходимо для дифракции нейтронов обменять H на его изотоп дейтерия, 2H(D), который имеет положительную длину когерентного рассеяния нейтронов (6,671 fm) и значительно меньшую длину некогерентного рассеяния (4,04 fm)19. Это может быть достигнуто путем пердеутерации, процесса, в котором белок экспрессируется организмами, выращенными в полностью дейтерированных средах, обеспечивая полное включение D в H-участки20. Также возможно частично дейтерировать белок, заменив H на D исключительно на обменных участках (титруемых группах), в то время как необменяемые углерод-связанные участки остаются гидрированными21. Это может быть достигнуто путем роста гидрогенизированных кристаллов белка в дейтерированном материнском ликворе22. Однако чаще всего H/D обмен гидрогенизированных белков осуществляется путем парообмена после роста достаточно крупных кристаллов в буфере на основе H2O23. В таких случаях кристаллы устанавливаются в кварцевый капилляр и уравновешиваются парами материнским щелоком на основе D20.
Ограниченные потоки нейтронов в источниках нейтронов приводят к увеличению времени сбора данных, от нескольких дней до нескольких недель24. В ORNL и IMAGINE, и MaNDi используют узкую полосу пропускания длин волн в диапазоне 2–6 Å для оптимизации сбора данных25. Данные могут собираться при комнатной температуре или при криотемпературе. Сбор криозданных может потенциально улучшить качество данных и открывает возможность для замораживания каталитических промежуточных продуктов. После сбора данных о нейтронной дифракции набор рентгеновских данных обычно собирается на одном кристалле при той же температуре или на кристалле, выращенном в идентичных условиях26. Сбор данных при одинаковой температуре позволяет выполнять уточнение структуры как по рентгеновским, так и по нейтронным данным, предотвращая любые потенциальные артефакты, вызванные температурой, такие как изменения видимости и положения вод или заполнение остатков с альтернативными конформациями27. Совместная уточнение рентгеновских нейтронных данных увеличивает отношение данных к параметрам и обеспечивает преимущество, позволяющее уточнять координаты белковой магистрали по сравнению с данными рентгеновского излучения, в то время как данные дифракции нейтронов используются для уточнения положения атомов H/D28. Это особенно полезно при использовании частично дейтерированных образцов, где присутствует подавление плотности из-за атомов Н в необменяемых участках белка. Хотя количество рентгеновских структур намного превышает количество нейтронных структур, депонированных в Банке белковых данных (PDB), пакеты программного обеспечения, первоначально предназначенные для уточнения рентгеновских данных, были расширены, чтобы охватить нейтронные данные, а также 3,29,30. После сбора данных модели могут быть уточнены с использованием пакетов уточнения, таких как phenix.refine, CNSsolve (nCNS) или SHELXL28,31,32,33. В процессе уточнения карты плотности рассеяния нейтронов могут быть визуализированы для ручной установки с использованием COOT34. Следуя структурному решению, координаты и файлы данных нейтронной и/или рентгеновской дифракции могут быть представлены в PDB, который проверит и депонирует модель, сделав ее доступной для публичного доступа18,29,30.
Структурный анализ белков представляет собой многогранный подход, в котором используются многочисленные методы для исследования их функции и механизма35. Кристаллография нейтронного белка дает ценную химическую информацию для расширения и дополнения результатов дополнительных исследований, таких как рентгеновская дифракция, спектроскопия, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) или микрокристаллическая дифракция электронов (microED)36. Дифракция нейтронного белка обладает уникальными возможностями для понимания ферментативных механизмов, поскольку атомы H занимают центральное место в их химии. Отсутствие радиационных повреждений, индуцированных нейтронами, делают их зондом, исключительно подходящим для изучения металлопротеинов37. Здесь мы представляем репрезентативный пример процесса дифракции нейтронного белка от подготовки образца до сбора, уточнения и анализа данных (рисунок 1). Кристаллы достаточного размера для экспериментов по дифракции нейтронов были выращены из металлопротеина Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D представляет собой медьсодержащий металлопротеин, участвующий в деградации непокорной целлюлозы путем введения атома кислорода в гликозидную связь38,39. Активный сайт NcLPMO9D содержит мононуклеарный медный центр в характерной «гистидин-скобке», состоящей из N-концевого гистидина и второго законсервированного гистидина (дополнительный рисунок 3)40. N-терминал грибковых ЛПМО метилирован, но постпереходная модификация не происходит во время рекомбинантной экспрессии в дрожжах. В состоянии покоя NcLPMO9D медный центр присутствует в состоянии окисления Cu2+ и активируется восстановлением одиночных электронов до Cu1+, что позволяет молекулярному кислороду связываться и активироваться путем быстрого восстановления до супероксидных частиц41,42. Общая реакция NcLPMO9D требует дальнейшего добавления одного электрона и двух протонов для образования гидроксилированного полисахаридного продукта43. Идентичность активированных форм кислорода, ответственных за абстракцию атомов водорода (HAA), из полисахаридной подложки не была идентифицирована, и в настоящее время продолжаются интенсивные структурные и вычислительные исследования44,45. Учитывая окислительно-восстановительную химию на активном объекте NcLPMO9D, смягчение радиационного ущерба особенно актуально. Здесь мы проиллюстрировали сбор данных о комнатной температуре и криомпературе на кристаллах NcLPMO9D для определения структуры NcLPMO9D в состоянии покоя и в активированном восстановленном виде соответственно46. Особое внимание будет уделяться монтажу кристаллов белка, настройке прибора лучевой линии для сбора данных, подготовке данных и файлов координат, а также этапам уточнения, необходимым для моделирования полноатомной нейтронной структуры.
Кристаллография нейтронного белка является высокочувствительным методом для зондирования состояний протонирования и ориентации молекул воды в белках. Эта информация проливает свет на белковые каталитические механизмы, поскольку изменения в протонировании и взаимодействиях водородных связей часто занимают центральное место в химии ферментов10. Кристаллография нейтронного белка, хоть и информативная методика, имеет ряд факторов, которые следует учесть перед планированием проведения эксперимента по дифракции нейтронов, а именно:
Кристаллография нейтронного белка является методом ограниченного потока. В отличие от наборов данных дифракции рентгеновских лучей, для наборов данных нейтронов ожидаются более высокие R-факторы и более низкая полнота, избыточность и отношение сигнал-шум из-за присущих методу ограничений (ограниченный поток, квази-Лауэ, более длинные волны). Сбор данных одного кадра обычно занимает 12–18 часов. Успех эксперимента в значительной степени зависит от размера и качества образца, причем кристаллы размером 0,1 мм3 часто являются минимальным требованием3. Нейтронная дифракция требует производства большого количества белка для создания кристаллизационных капель в диапазоне от 10 до 800 мкл. Минимальный объем для выращивания достаточно крупных кристаллов можно оценить с помощью калькулятора объема с учетом параметров кристалла и образца (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Рост крупных кристаллов чаще всего осуществлялся путем диффузии пара3. Кристаллизация подвесных капель позволяет выращивать кристаллы в больших каплях в диапазоне от 10-25 мкл, в то время как более крупные капли в диапазоне до ~ 50 мкл могут быть настроены с использованием коммерчески доступного оборудования для сидячей капли14,54. Силиконизированные девятилуночные стеклянные пластины можно использовать для установки очень больших капель с объемом до 800 мкл. Эти стеклянные пластины помещаются в «сэндвич-боксы», коммерчески доступные от Hampton Research. Дальнейшие методы кристаллизации включают пакетную кристаллизацию, при которой предел размера капли диктуется сосудом. Эксперимент по периодической кристаллизации может варьироваться от микролитров до миллилитров55. Кристаллизация также может быть выполнена с использованием метода диализа, в котором белок уравновешивается с осадком через мембрану диализа или путем контрдиффузии вдоль градиента концентрации осадка или через пористую пробку, такую как агароза56,57. Посев предлагает еще одну альтернативу получению кристаллов нужного объема. Микро- и макропосев успешно применяются для роста крупных кристаллов, в том числе крупных кристаллов NcLPMO9D45. Некоторые знания о диаграмме фаз белка, включая влияние температуры на растворимость, помогают в большом росте кристаллов.
При планировании эксперимента по дифракции нейтронов необходима оптимизация препарата белка для максимизации отношения сигнал/шум при сборе дифракционных данных7. Чтобы обойти подавление плотности и высокое некогерентное рассеяние, вызванное атомами H, карты SLD нейтронов могут быть улучшены путем обмена атомов H на его изотоп D, который обладает положительной длиной когерентного рассеяния и низкой длиной некогерентного рассеяния. Для этого осуществляется парообмен гидрогенизированного кристалла белка против дейтерированного кристаллизационного буфера. Это обеспечивает H/D обмен молекул растворителя и лабильных, титруемых атомов H белка H23. Парообмен осуществляется путем монтажа гидрогенизированного кристалла в кварцевый капилляр с дейтерированными кристаллизационными буферными «заглушками» на основе D2O и представляет собой эффективный, щадящий метод, который чаще всего применяется14,23,35. Обмен может занять несколько недель и предпочтительно требует, чтобы дейтерированный буфер часто менялся для обеспечения максимального обмена H/D. H/D обмен также может быть выполнен путем непосредственного замачивания кристалла в дейтерированном буфере. Чтобы избежать напряжения кристалла из-за воздействия D2O, процесс замачивания следует выполнять постепенно, постепенно увеличивая соотношение D2O: H2O58. В дополнение к этому, кристаллизация гидрогенизированного белка также может быть выполнена в дейтерированном буфере для обмена H/D на лабильных участках H22,59. Следует, однако, отметить, что буфер на основе D2O оказывает влияние на растворимость белка, требуя дальнейшей корректировки известных условий на основе H2O3,59. Было также замечено, что буферы на основе D2O в некоторых случаях приводят к образованию кристаллов меньшего размера59. Полный обмен титруемых и связанных с углеродом атомов H на D может быть достигнут путем экспрессии белков в дейтерированных средах для получения пердоутерированного образца20. Полученные нейтронные карты SLD пердоутерированного образца будут значительно улучшены, больше не отображая подавление плотности гидрогенизированного образца. Это полезно при характеристике H/D, связанного в необменяемых участках в белке или кофакторе. Тем не менее, экспрессия пердойтерированного белка является как высокой по стоимости, так и низкой по выходу60. Центр структурной молекулярной биологии (CSMB) Национальной лаборатории Оук-Ридж (ORNL) предлагает механизм дейтерации для пользователей, стремящихся создать пердевтерированный образец (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Пердойтерированная экспрессия обычно выполняется в биореакторе на шкале 1 л, получая ~50 мг очищенного белка61.
После сбора данных о дифракции нейтронов выполняется уточнение и построение интерактивной модели. Уточнение может быть выполнено с использованием нескольких пакетов программного обеспечения, включая phenix.refine, nCNS или SHELXL28,31,32,33. Пакет Phenix является наиболее часто используемым программным обеспечением для уточнения данных о дифракции нейтронов в сочетании с Coot, которое используется для ручного построения модели из нейтронных карт SLD34. Хотя и Phenix, и Coot позволяют обрабатывать данные о дифракции нейтронов, им могут не хватать определенных функций, необходимых для обработки особенностей, связанных с нейтронными данными и дейтерированными образцами. Например, Coot не содержит оптимизации геометрии для дейтерированных остатков, что может привести к осложнениям во время построения модели, поскольку функция «Real Space Refine» приводит к «взрывающимся» остаткам (дополнительный рисунок 26)62. Это может быть решено путем создания файлов ограничений для всех дейтерированных остатков. Однако это интенсивный процесс, и такие библиотеки в настоящее время не являются общедоступными. При выполнении доработок в Фениксе сменные H/D участки первоначально будут установлены на 0,50 заполняемости для H и D. По мере выполнения уточнений заполняемость H и D будет уточняться в соответствии с нейтронными картами SLD. Во время построения интерактивных моделей карты разной плотности Fo-Fc очень информативны при оценке занятости H/D. Карты могут быть использованы для определения того, какие участки обладают высокой заполняемостью D, что особенно информативно на активном участке, где состояния протонирования каталитически значимы63. Однако неоднозначные ситуации возникают, когда H:D Заполняемость близка к 0.70:0.30, что приводит к полному подавлению сигнала в нейтронных SLD maps64. Следует также учитывать, что квази-лауэ нейтронные наборы данных часто имеют полноту около 80%, что ниже, чем обычно наблюдаемые ≥ 98% для данных рентгеновской дифракции. Поэтому при уточнении данных о дифракции нейтронов в Фениксе недостающие наблюдаемые амплитуды (Fo) вычисляются из модели для заполнения списка отражений, что приводит к смещению модели. Чтобы учесть это потенциальное смещение, «no_fill» карты должны быть изучены во время интерактивного построения моделей, а не «заполненные» карты.
Пользователи могут выбрать совместное уточнение рентгеновских/нейтронных данных своей структуры или только уточнение нейтронных данных. Визуализация нейтронных карт SLD, особенно при более низком разрешении, может первоначально сбивать с толку, особенно для гидрогенизированного белка, в котором H все еще присутствует в необменяемых участках, несмотря на парообмен H/D. Это приводит к отмене карт плотности нейтронов, создавая впечатление прерывистых карт65,66. Сбор соответствующего набора рентгеновских данных выгодно дополняет эти отмены в совместном уточнении (рисунок 13A и рисунок 13B). Стратегия совместного уточнения обычно включает уточнение координат белковой магистрали по рентгеновским данным, в то время как данные нейтронной дифракции используются для уточнения положения и занятости атомов H/D в обменных местах28. Поскольку введение совместного заполнения H/D на обменных участках увеличивает количество уточняемых параметров, совместная доработка с рентгеновскими данными также увеличивает отношение данных к параметрам. Совместная очистка требует, чтобы соответствующий набор рентгеновских данных был собран при той же температуре на том же кристалле или кристалле, выращенном в тех же условиях. Для данных о нейтронной дифракции, собранных при комнатной температуре (300 К), соответствующий набор рентгеновских данных должен быть собран при комнатной температуре с использованием стратегии сбора данных с низкой дозой для ограничения радиационного ущерба. Пердойтерированные образцы, напротив, обеспечивают улучшенные и непрерывные нейтронные SLD-карты, поскольку они не обладают одинаковой величиной подавления сигнала H/D. Однако длина рассеяния нейтронов некоторых элементов, включая металлы и серу, делает их плохо видимыми на картах SLD нейтронов, даже если белок был пердойтерирован (рисунок 13C-F)18. Если металл нуждается в характеристике, лучше всего использовать рентгеновскую дифракцию в совместном уточнении или применять спектроскопические методы для дополнения дифракционных экспериментов. Уточнение данных только нейтронами часто выполняется, когда набор данных нейтронов имеет высокое разрешение или если использовался пердоутерированный белок. Кроме того, уточнение данных только на нейтронах особенно полезно, если изучается белок, высокочувствительный к радиационному повреждению, поскольку структура, полученная из рентгеновского излучения, может обладать радиационно-индуцированными артефактами. Если необходимо выполнить уточнение только нейтронных данных, необходимо выяснить, обладает ли соответствующий набор нейтронных данных достаточной полнотой и разрешением.
ORNL предлагает два средства для сбора данных о дифракции нейтронов: лучевую линию IMAGINE на HFIR, а также лучевую линию MaNDi на SNS36,67. Хотя оба прибора обеспечивают эффективные средства для сбора набора данных о дифракции нейтронов с использованием аналогичных принципов, каждый прибор имеет уникальные спецификации, которые следует учитывать при подаче заявки на время луча. IMAGINE собирает квази-Лауэ данные и оптимизирован для сбора данных о комнатной температуре кристаллов с единичными ячейками до ~100 Å. MaNDi может использоваться для сбора данных о комнатной температуре и криотемпературе с использованием сбора TOF-Laue на кристаллах с единичными ячейками до ~ 300 Å. Перед сбором полного набора данных на кристалле проводится тест для оценки качества полученной дифракционной картины, в которой кристалл подвергается воздействию пучка нейтронов в течение одного кадра. Если кристалл имеет достаточное качество, полный набор данных нейтронной дифракции будет собран, проиндексирован, интегрирован, масштабирован и объединен в процессе, аналогичном обработке рентгеновских данных. IMAGINE использует Lauegen и Lscale, а MaNDi использует пакет Mantid и использует трехмерную подгонку профиля48,50,51,68,69,70. Ученым, которые станут пользователями любого из этих объектов, будет предоставлен набор данных в формате MTZ или HKL для дальнейшего анализа.
Нейтронная дифракция является неразрушающим, высокочувствительным методом зондирования состояния протонации и взаимодействия водородных связей биологических макромолекул. Он особенно полезен для фоточувствительных белков и металлопротеинов. Перед проведением эксперимента необходимо принять во внимание несколько соображений, касающихся метода, а также обработки данных, однако результат дает результаты, которые могут дать ценное представление о каталитическом механизме интересующего белка. Кристаллография нейтронного белка дополняет вычислительные, структурные, биохимические и спектроскопические исследования, что делает ее ценным инструментом в наборе методов биолога, используемых для характеристики биологических макромолекул.
The authors have nothing to disclose.
Эксперименты по экспрессии, очистке и кристаллизации белка проводились в Центре структурной молекулярной биологии (CSMB), пользовательском центре биологических и экологических исследований Министерства энергетики США в Национальной лаборатории Оук-Ридж. Данные о дифракции нейтронов были собраны в BL-11B MaNDi в источнике нейтронов Spallation (SNS) в ORNL, который спонсируется Отделом научных пользовательских установок Управления фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США. Авторы благодарят Брендана Салливана за помощь в сокращении данных. Данные о дифракции рентгеновских лучей были собраны на объектах Центра молекулярного образования, технологий и исследований (METRIC) в Университете штата Северная Каролина, который поддерживается штатом Северная Каролина. GCS частично признает поддержку со стороны Национального исследовательского фонда (NRF), Южной Африки и программы Graduate Opportunities (GO!) в ORNL. FM признает поддержку со стороны USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |