A cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica estrutural que permite a localização de átomos de hidrogênio, fornecendo detalhes mecanicistas importantes da função proteica. Apresentamos aqui o fluxo de trabalho para a montagem de um cristal proteico, coleta de dados de difração de nêutrons, refinamento de estrutura e análise dos mapas de densidade de extensão de dispersão de nêutrons.
A cristalografia de nêutrons é uma técnica estrutural que permite a determinação de posições de átomos de hidrogênio dentro de macromoléculas biológicas, produzindo informações mecanicamente importantes sobre estados de protonação e hidratação, sem induzir danos causados pela radiação. A difração de raios-X, em contraste, fornece apenas informações limitadas sobre a posição dos átomos de luz e o feixe de raios-X induz rapidamente danos à radiação de cofatores fotosensíveis e centros metálicos. Apresentado aqui é o fluxo de trabalho empregado para as linhas de luz IMAGINE e MaNDi no Oak Ridge National Laboratory (ORNL) para obter uma estrutura de difração de nêutrons uma vez que um cristal proteico de tamanho adequado (> 0,1 mm3) tenha sido cultivado. Demonstramos a montagem de cristais de proteína hidrogenada em capilares de quartzo para coleta de dados de difração de nêutrons. Também é apresentado o processo de troca de vapor dos cristais montados com buffer contendo D2O para garantir a substituição de átomos de hidrogênio em locais trocaveis por deutério. A incorporação do deutério reduz o fundo decorrente da dispersão incoerente dos átomos de hidrogênio e evita o cancelamento da densidade causada pelo seu comprimento de dispersão coerente negativo. As estratégias de alinhamento amostral e coleta de dados de temperatura ambiente são ilustradas usando a coleta de dados quase-Laue no IMAGINE no Reator de Isótopos de Alto Fluxo (HFIR). Além disso, a montagem cristalina e o congelamento rápido em nitrogênio líquido para coleta de dados criominos para capturar intermediários de reação labile é demonstrado no instrumento de tempo de voo MaNDi na Fonte de Neutron spallation (SNS). A preparação dos arquivos de dados de coordenadas e difração do modelo e visualização dos mapas de densidade de comprimento de dispersão de nêutrons (SLD) também serão abordadas. O refinamento da estrutura contra dados de nêutrons ou contra dados articulares de raios-X/nêutrons para obter uma estrutura de todos os átomos da proteína de interesse será finalmente discutido. O processo de determinação de uma estrutura de nêutrons será demonstrado utilizando cristais do polissacarídeo lítico monooxicante Neurospora crassa LPMO9D, uma metaloproteína contendo cobre envolvida na degradação de polissacarídeos recalcitrantes através de decote oxidativo da ligação glicósidica.
A cristalografia macromolecular de nêutrons é uma técnica que fornece uma janela única para a estrutura e química subjacente das proteínas. Conceitualmente semelhante à difração de raios-X, a difração de nêutrons fornece detalhes atomísticos da estrutura macromolecular, no entanto, a interação dos nêutrons com núcleos permite a localização de átomos de luz, muitas vezes difíceis de detectar com difração de raios-X1. Durante a difração de raios-X, os raios-X se espalham da nuvem eletrônica, tornando os átomos de luz como o hidrogênio (H) pouco visíveis em mapas de densidade de elétrons que não têm resolução sub-Ångström2. Em contraste, a intensidade de dispersão de nêutrons depende de interações complexas com o núcleo, com isótopos do mesmo elemento exibindo diferentes comprimentos de dispersão. Portanto, átomos de luz e seus isótopos, como hidrogênio (1H) e deutério (2H ou D), têm visibilidade comparável aos átomos de carbono, nitrogênio e oxigênio em mapas de densidade de extensão de dispersão de nêutrons (SLD). Além disso, uma vez que a magnitude da dispersão de nêutrons é independente do número de elétrons, a dispersão de elementos leves não é obscurecida por elementos pesados quando eles estão próximos uns dos outros, como é observado na dispersão de raios-X. A visibilidade aprimorada de H e seu isótopo D ao empregar difração de nêutrons fornece informações valiosas sobre o estado de protonação de resíduos catalíticos, cofatores e ligantes e auxilia na orientação de moléculas de água, revelando informações importantes sobre mecanismos catalíticos e química de proteína3. A difração de nêutrons também oferece a vantagem de ser uma técnica não destrutiva, particularmente adequada a amostras biológicas sensíveis à ionização, como proteínas com centros metálicos ou cofatores de redox fotosensível2. O foco principal deste artigo é fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho para obter uma estrutura de cristal de proteína de nêutrons de alta qualidade. Encaminhamos o leitor interessado para Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 e O’Dell et al.3 para uma excelente visão geral da difração de proteína de nêutrons e Ashkar et al.7 para novas aplicações de dispersão de nêutrons.
Os nêutrons são gerados principalmente durante reações nucleares que empregam qualquer um dos dois processos: fissão nuclear em fontes de reator ou spallation em fontes baseadas em acelerador8. As fontes do reator fornecem um feixe de nêutrons contínuo empregando fissão nuclear do isótopo 235U, enquanto fontes de nêutrons spallation produzem um feixe de nêutrons pulsado bombardeando um alvo, por exemplo, um metal líquido como mercúrio, com prótons9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) em Oak Ridge, Tennessee, hospeda uma fonte de nêutrons de estado estável no Reator de Isótopos de Alto Fluxo (HFIR) e uma fonte pulsada de 60 Hz na Fonte de Neutron spallation (SNS). A linha de feixe IMAGINE, localizada no HFIR, é um difrítmetro de nêutrons otimizado para macromoléculas biológicas (Figura Suplementar 1)10. IMAGINE emprega um detector de placas de imagem de nêutrons para medir dados quase-Laue usando um bandpass estreito na faixa de 2,8 – 4,5 Å de cristais únicos com bordas celulares unitárias <150 Å. O Difractômetro de Nêutrons Macromolecular (MaNDi), localizado no SNS, é um difámetro de nêutrons Laue (TOF) equipado com um quadro de matriz de detector esférico (DAF) (Figura Suplementar 2)11. O MaNDi mede dados de cristais únicos com bordas de células unitárias na faixa de 10 – 300 Å, empregando uma largura de banda tunable de 2 Å entre 2.0 e 6.0 Å12.
O processo de geração de nêutrons é altamente intensivo em energia, resultando em fluxos de feixe de nêutrons relativamente fracos quando contrastados com fluxos de raios-X em fontes síncrotrons13. Para garantir relações sinal-ruído suficientes durante a coleta de dados, é necessário cultivar cristais de tamanho e qualidade adequados14. Normalmente, cristais com volumes > 0,1 mm3 são necessários para coletar dados com estatísticas adequadas15. Além dos fluxos mais baixos, devem ser levadas em consideração as propriedades inerentes à interação entre nêutrons e núcleos amostrais. O comprimento de dispersão de nêutrons difere para isótopos do mesmo elemento, uma propriedade que pode ser explorada vantajosamente em dispersão de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) para mascarar ou destacar regiões de uma amostra – um processo conhecido como contraste correspondente17. Em experimentos de difração, o comprimento de dispersão de nêutrons coerente negativo de H (-3.741 fm para 1H) pode levar ao cancelamento de características do mapa de densidade de dispersão de nêutrons, uma vez que os comprimentos coerentes de dispersão de nêutrons de outros átomos biologicamente relevantes, incluindo carbono (6,6511 fm para 12C), nitrogênio (9,37 fm para 14N), oxigênio (5.803 fm para 16O), fósforo (5,13 fm para 31P) e enxofre (2.804 fm para 32S), são positivos (Tabela 1)12,14. Além disso, o grande comprimento de dispersão incoerente de H (25.274 fm), aumenta o fundo durante a coleta de dados, dificultando a qualidade do conjunto de dados e comprometendo a resolução de dados7. Para contornar essas limitações introduzidas por H é necessário, para difração de nêutrons, trocar H por seu deutério isótopo, 2H(D), que tem um comprimento de dispersão de nêutrons coerente positivo (6.671 fm) e comprimento de dispersão incoerente significativamente menor (4,04 fm)19. Isso pode ser alcançado por perditeração, um processo no qual a proteína é expressa por organismos cultivados em mídia totalmente deutada garantindo a incorporação completa de D em locais H20. Também é possível desutar parcialmente a proteína substituindo H por D apenas nos locais trocaveis (grupos titulados) enquanto os locais não permutáveis ligados ao carbono permanecem hidrogenados21. Isso pode ser alcançado pelo crescimento de cristais de proteína hidrogenada em bebidas maternas desuteradas22. Mais comumente, no entanto, a troca de proteínas hidrogenadas é realizada pela troca de vapor após o crescimento de cristais adequadamente grandes em buffer baseado em H2O23. Nesses casos, os cristais são montados em um capilar de quartzo e equilibrados com um licor materno baseado em D20.
Os fluxos limitados de nêutrons em fontes de nêutrons resultam em tempos mais longos de coleta de dados, variando de dias a várias semanas24. Na ORNL, tanto a IMAGINE quanto a MaNDi empregam um bandpass de comprimento de onda estreito na faixa de 2 a 6 Å para otimizar a coleta de dados25. Os dados podem ser coletados à temperatura ambiente ou à temperatura criobito. A coleta de dados criográficos pode potencialmente melhorar a qualidade dos dados e abre a possibilidade de intermediários catalíticos de captura de congelamento. Após a coleta de dados de difração de nêutrons, um conjunto de dados de raios-X é tipicamente coletado no mesmo cristal na mesma temperatura ou em um cristal cultivado em condições idênticas26. A coleta de dados na mesma temperatura permite que o refinamento da estrutura seja realizado em relação aos dados de raios-X e nêutrons, evitando possíveis artefatos induzidos pela temperatura, como mudanças na visibilidade e posição das águas ou nas ocupações de resíduos com conformações alternativas27. O refinamento de dados de nêutrons de raios-X conjunto aumenta a relação dados-parâmetro e oferece a vantagem de permitir que as coordenadas de backbone de proteína sejam refinadas contra os dados de raios-X, enquanto os dados de difração de nêutrons são usados para refinar a posição dos átomos de H/D28. Isso é particularmente útil quando se usa amostras parcialmente desuteradas, onde o cancelamento da densidade devido a átomos de H em locais não-trocáveis na proteína está presente. Embora o número de estruturas de raios-X exceda em muito o número de estruturas de nêutrons depositadas no Protein Data Bank (PDB), pacotes de software inicialmente projetados para o refinamento de dados de raios-X foram expandidos para abranger dados de nêutrons, bem como 3,29,30. Após a coleta de dados, os modelos podem ser refinados usando pacotes de refinamento como phenix.refine, CNSsolve (nCNS) ou SHELXL28,31,32,33. Durante o processo de refinamento, mapas de densidade de dispersão de nêutrons podem ser visualizados para montagem manual usando COOT34. Seguindo a solução da estrutura, as coordenadas e os arquivos de dados de difração de raios-X e nêutrons e/ou raios-X podem ser submetidos ao PDB, que validará e depositará o modelo, tornando-o disponível para acesso público18,29,30.
A análise estrutural das proteínas é uma abordagem multifacetada na qual inúmeras técnicas são usadas para sondar sua função e mecanismo35. A cristalografia da proteína de nêutrons fornece informações químicas valiosas para expandir e complementar os achados de estudos adicionais como difração de raios-X, espectroscopia, ressonância magnética nuclear (RMN) ou difração de elétrons microcristas (microED)36. A difração de proteína de nêutrons está posicionada exclusivamente para fornecer insights sobre mecanismos enzimáticos, uma vez que os átomos H são centrais para sua química. A ausência de danos causados por radiação induzido por nêutrons faz deles uma sonda excepcionalmente adequada ao estudo de metaloproteínas37. Apresentamos aqui um exemplo representativo do processo de difração de proteína de nêutrons desde a preparação da amostra até a coleta, refinamento e análise de dados (Figura 1). Cristais de tamanho suficiente para experimentos de difração de nêutrons foram cultivados da metaloproteína Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D é uma metaloproteína contendo cobre envolvida na degradação da celulose recalcitrante pela inserção de átomos de oxigênio na ligação glicósdica38,39. O local ativo NcLPMO9D contém um centro de cobre mononuclear dentro de uma característica “histidina-brace” composta da histidina n-terminal e uma segunda histidina conservada (Figura Suplementar 3)40. O terminal N de LPMOs fúngicos é metilado, mas a modificação pós-transição não ocorre durante a expressão recombinante na levedura. No estado de repouso NcLPMO9D, o centro de cobre está presente em um estado de oxidação Cu2+ e é ativado por uma única redução de elétrons para Cu1+, permitindo que o oxigênio molecular se ligue e seja ativado por ser rapidamente reduzido a uma espécie de superóxido41,42. A reação geral do NcLPMO9D requer a adição adicional de um elétron e dois prótons para formar o produto de polissacarídeo hidroxilálado43. A identidade das espécies de oxigênio ativadas responsáveis pela abstração do átomo de hidrogênio (HAA) a partir do substrato de polissacarídeo não foi identificada e estudos estruturais e computacionais intensivos estão atualmente em curso44,45. Dada a química redox no local ativo NcLPMO9D, a mitigação de danos causados por radiação é particularmente pertinente. Ilustramos aqui a coleta de dados de temperatura ambiente e crio-temperatura em cristais NcLPMO9D para determinar a estrutura NcLPMO9D no estado de repouso e na forma reduzida ativada, respectivamente46. Destaque para a montagem de cristais proteicos, configuração de instrumentos de feixe para coleta de dados, a elaboração dos dados e arquivos de coordenação e as etapas de refinamento necessárias para modelar uma estrutura de nêutrons de todos os átomos.
A cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica altamente sensível para sondar estados de protonação e orientação de moléculas de água em proteínas. Essas informações lançam luz sobre mecanismos catalíticos proteicos, uma vez que mudanças nas interações de protonação e ligação de hidrogênio são muitas vezes centrais para a química enzimática10. A cristalografia da proteína de nêutrons, embora uma técnica informativa, tem uma série de fatores que devem ser levados em consideração antes de planejar realizar um experimento de difração de nêutrons, ou seja:
Cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica limitada de fluxo. Em contraste com os conjuntos de dados de difração de raios-X, maiores fatores R e menor completude, redundância e razões de sinal-ruído são esperados para conjuntos de dados de nêutrons devido às limitações inerentes à técnica (fluxo limitado, quase-Laue, comprimentos de onda mais longos). A coleta de dados de um único quadro é tipicamente de 12 a 18 horas. O sucesso de um experimento é altamente dependente do tamanho da amostra e da qualidade com cristais de 0,1 mm3, sendo frequentemente o requisito mínimo3. A difração de nêutrons requer a produção de grandes quantidades de proteína para configurar gotas de cristalização variando de 10 a 800 μL. O volume mínimo para o cultivo de cristais suficientemente grandes pode ser estimado usando uma Calculadora de Volume, dado os parâmetros de cristal e amostra (https://neutrons.ornl.gov/imagine). O crescimento de cristais grandes tem sido mais prevalentemente realizado pela difusão de vapor3. A cristalização da queda de suspensão permite o crescimento de cristais em grandes gotas que variam de 10-25 μL, enquanto gotas maiores que variam até ~ 50 μL podem ser configurais usando equipamentos de queda de sessão disponíveis comercialmente14,54. Placas de vidro de nove poços siliconadas podem ser usadas para configurar gotas muito grandes, com volumes de até 800 μL. Estas placas de vidro são colocadas em “caixas de sanduíche” comercialmente disponíveis na Hampton Research. Outras técnicas de cristalização incluem cristalização em lote, na qual o limite do tamanho da gota é ditado pelo vaso. O experimento de cristalização em lote pode variar de microliters a mililitros55. A cristalização também pode ser realizada usando a técnica de diálise na qual a proteína é equilibrada com o precipitante através de uma membrana de diálise ou por contra-difusão ao longo de um gradiente de concentração precipitante ou através de um plugue poroso como agarose56,57. A semeadura oferece outra alternativa para obter cristais do volume desejado. Micro e macroseeding foram empregados com sucesso para um grande crescimento de cristais, incluindo grande cristal de NcLPMO9D45. Alguns conhecimentos do diagrama da fase proteica, incluindo a influência da temperatura sobre a solubilidade, auxiliam no grande crescimento cristalino.
Ao planejar um experimento de difração de nêutrons, a otimização da preparação da proteína para maximizar a relação sinal-ruído durante a coleta de dados de difração é essencial7. Para contornar o cancelamento de densidade e a alta dispersão incoerente causada por átomos H, os mapas de Nêutrons SLD podem ser melhorados trocando átomos de H por seu isótopo D, que possui um comprimento de dispersão coerente positivo e baixo comprimento de dispersão incoerente. Para isso, é realizada a troca de vapor do cristal de proteína hidrogenada contra o tampão de cristalização deuterado. Isso garante a troca de H/D de moléculas de solventes e os átomos de proteína labile e titratáveis H23. A troca de vapor é realizada pela montagem do cristal hidrogenado em um capilar de quartzo com “plugs” de cristalização desuterado baseado em D2O e representa uma técnica eficaz e suave que é mais frequentemente aplicada14,23,35. A troca pode levar várias semanas e, preferencialmente, requer que o buffer deuterado seja frequentemente alterado para garantir a troca máxima de H/D. A troca de H/D também pode ser realizada encharcando diretamente o cristal em tampão desuterado. Para evitar colocar o cristal sob estresse devido à exposição ao D2O, o processo de imersão deve ser realizado gradualmente aumentando gradualmente a razão D2O:H2O58. Além disso, a cristalização da proteína hidrogenada também pode ser realizada em tampão deuterado para troca de H/D em locais de laboratório H22,59. Deve-se notar, no entanto, que o buffer baseado em D2O tem um efeito sobre a solubilidade da proteína que requer ajuste adicional das condições conhecidas baseadas em H2O3,59. Tampões baseados em D2O também foram observados para levar a cristais menores em alguns casos59. A troca completa de átomos H titratáveis e ligados ao carbono para D pode ser alcançada expressando proteínas em mídia deuterada para gerar uma amostra perdeuterated20. Os mapas SLD de nêutrons resultantes da amostra perdidoterada serão significativamente melhorados, não mais exibindo o cancelamento de densidade da contraparte da amostra hidrogenada. Isso é benéfico ao caracterizar h/D vinculado em locais não-trombáveis em uma proteína ou cofator. No entanto, a expressão da proteína perdido é tanto alta em custo quanto baixa em rendimento60. O Centro nacional de Biologia Molecular Estrutural (CSMB) de Oak Ridge oferece uma facilidade de deuteração para usuários que procuram gerar uma amostra perdido (https://www.ornl.gov/facility/csmb). A expressão perdidoterada é tipicamente realizada em um bioreator na escala 1 L que produz ~50 mg de proteína purificada61.
Após a coleta de dados de difração de nêutrons, é realizado refinamento e construção de modelos interativos. O refinamento pode ser executado usando várias suítes de software, incluindo phenix.refine, nCNS ou SHELXL28,31,32,33. O pacote Phenix é o software mais utilizado para refinamento de dados de difração de nêutrons em conjunto com Coot, que é usado para construir manualmente o modelo a partir dos mapas SLD de nêutrons34. Embora tanto Phenix quanto Coot permitam o processamento de dados de difração de nêutrons, eles podem não ter certas características necessárias para processar as idiossincrasias associadas a dados de nêutrons e amostras deutadas. Por exemplo, Coot não contém otimização de geometria para resíduos deuterados, o que pode levar a complicações durante a construção do modelo, uma vez que o recurso “Real Space Refine” resulta em resíduos “explosivos” (Figura Suplementar 26)62. Isso pode ser resolvido gerando arquivos de contenção para todos os resíduos desuterados. No entanto, este é um processo intensivo e tais bibliotecas não estão disponíveis publicamente no momento. Ao realizar refinamentos em Phenix, os sites de H/D trocados serão inicialmente definidos como 0,50 de ocupação para H e D. À medida que os refinamentos são realizados, a ocupação de H e D será refinada de acordo com os mapas de SLD de nêutrons. Durante a construção interativa do modelo, os mapas Fo-Fc de densidade de diferença são muito informativos na avaliação das ocupações de H/D. Mapas podem ser usados para determinar quais locais possuem alta ocupação D, o que é particularmente informativo no local ativo onde os estados de protonação são catalíticomente relevantes63. Situações ambíguas surgem, no entanto, quando o H:D a ocupação está próxima de 0,70:0.30, o que resulta em cancelamento completo de sinal em mapas SLD de nêutrons64. Também deve ser levado em conta que os conjuntos de dados de nêutrons quase-Laue geralmente têm completude em torno de 80%, o que é menor do que o observado rotineiramente ≥ 98% para dados de difração de raios-X. Ao refinar dados de difração de nêutrons em Phenix, as amplitudes observadas ausentes (Fo) são, portanto, calculadas a partir do modelo para completar a lista de reflexão, introduzindo assim viés de modelo. Para explicar esse viés potencial, os mapas “no_fill” devem ser examinados durante a construção de modelos interativos em vez de mapas “preenchidos”.
Os usuários podem optar por realizar um refinamento de dados de raios-X/nêutrons articulares de sua estrutura, ou um refinamento apenas de dados de nêutrons. Visualizar mapas SLD de nêutrons, particularmente em menor resolução, pode inicialmente ser desconcertante especialmente para uma proteína hidrogenada na qual H ainda está presente em locais não-periqueáveis, apesar da troca de vapor H/D. Isso resulta em cancelamentos de mapas de densidade de nêutrons, dando a impressão de mapas descontínuos65,66. A coleta de um conjunto de dados de raios-X correspondente complementa vantajosamente esses cancelamentos em um refinamento articular (Figura 13A e Figura 13B). Uma estratégia de refinamento conjunto normalmente envolve refinar as coordenadas de backbone de proteínas contra os dados de raios-X, enquanto os dados de difração de nêutrons são usados para refinar a posição e ocupação dos átomos de H/D em locais mutáveis28. Uma vez que a introdução da ocupação conjunta de H/D em locais percobráveis aumenta o número de parâmetros sendo refinados, um refinamento conjunto com dados de raios-X também aumenta a relação dados-parâmetros. Um refinamento articular requer que um conjunto de dados de raios-X correspondente seja coletado na mesma temperatura no mesmo cristal ou um cristal cultivado sob as mesmas condições. Para dados de difração de nêutrons coletados à temperatura ambiente (300K), o conjunto de dados de raios-X correspondente deve ser coletado à temperatura ambiente usando uma estratégia de coleta de dados de baixa dose para limitar os danos causados pela radiação. As amostras perdidoteradas, em contraste, fornecem mapas SLD de nêutrons melhorados e contínuos, uma vez que não possuem a mesma magnitude do cancelamento do sinal H/D. No entanto, o comprimento de dispersão de nêutrons de certos elementos, incluindo metais e enxofre, os tornam pouco visíveis em mapas de SLD de nêutrons, mesmo que a proteína tenha sido perdido (Figura 13C-F)18. Se um metal precisa ser caracterizado, é melhor utilizar a difração de raios-X em um refinamento articular ou aplicar técnicas espectroscópicas para complementar experimentos de difração. Refinamentos de dados somente de nêutrons são frequentemente realizados quando o conjunto de dados de nêutrons tem alta resolução ou se uma proteína perdeuterada foi usada. Além disso, o refinamento de dados somente de nêutrons é particularmente útil se uma proteína altamente sensível aos danos causados pela radiação estiver sendo estudada, uma vez que uma estrutura derivada de raios-X pode possuir artefatos induzidos por radiação. Se um refinamento somente de dados de nêutrons deve ser realizado, deve ser verificado se o conjunto de dados de nêutrons correspondente tem completação e resolução suficientes.
A ORNL oferece duas facilidades para coleta de dados de difração de nêutrons: a linha de luz IMAGINE no HFIR, bem como a linha de luz MaNDi no SNS36,67. Embora ambos os instrumentos forneçam meios eficazes para a coleta de um conjunto de dados de difração de nêutrons que emprega princípios semelhantes, cada instrumento tem especificações únicas que devem ser levadas em conta ao solicitar o tempo do feixe. IMAGINE coleta dados quase-Laue e é otimizado para coleta de dados de temperatura ambiente em cristais com células unitárias até ~100 Å. MaNDi pode ser usado para a coleta de dados de temperatura ambiente e crio-temperatura empregando a coleta tof-laue em cristais com células unitárias até ~ 300 Å. Antes de coletar um conjunto de dados completo, é realizado um teste no cristal para avaliar a qualidade do padrão de difração obtido no qual o cristal é exposto ao feixe de nêutrons para um único quadro. Se o cristal for de qualidade suficiente, um conjunto de dados de difração de nêutrons completo será coletado, indexado, integrado, dimensionado e fundido em um processo análogo ao processamento de dados de raios-X. IMAGINE faz uso de Lauegen e Lscale e MaNDi utiliza o pacote Mantid e emprega encaixe de perfil tridimensional48,50,51,68,69,70. Os cientistas que se tornarem usuários em qualquer uma dessas instalações serão fornecidos com um conjunto de dados em formato MTZ ou HKL para análise suplementar.
A difração de nêutrons é uma técnica não destrutiva e altamente sensível para sondar o estado de protonação e as interações de ligação de hidrogênio de macromoléculas biológicas. É particularmente útil para proteínas foto-sensíveis e metaloproteínas. Várias considerações sobre a técnica, bem como o processamento dos dados devem ser levadas em conta antes de realizar um experimento, no entanto, o resultado produz resultados que podem dar uma visão valiosa do mecanismo catalítico da proteína de interesse. A cristalografia de proteína de nêutrons complementa estudos computacionais, estruturais, bioquímicos e espectroscópicos, tornando-se uma ferramenta valiosa na caixa de ferramentas do biólogo de técnicas utilizadas para caracterizar macromoléculas biológicas.
The authors have nothing to disclose.
Experimentos de expressão, purificação e cristalização de proteínas foram realizados no Center for Structural Molecular Biology (CSMB), um Centro de Usuários de Pesquisa Biológica e Ambiental do Departamento de Energia dos EUA no Oak Ridge National Laboratory. Os dados de difração de nêutrons foram coletados no BL-11B MaNDi na Fonte de Neutron spallation (SNS) da ORNL, que é patrocinada pela Divisão de Instalações de Usuários Científicos, Escritório de Ciências Básicas de Energia, Departamento de Energia dos EUA. Os autores agradecem brendan Sullivan pela ajuda com a redução de dados. Os dados de difração de raios-X foram coletados nas instalações do Centro de Inovação molecular, Tecnologia e Pesquisa (METRIC) da Universidade Estadual da Carolina do Norte, que é apoiada pelo Estado da Carolina do Norte. A GCS reconhece o apoio em parte da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), África do Sul e do programa de Oportunidades de Pós-Graduação (GO!) da ORNL. A FM reconhece o suporte do USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |