Die Neutronenproteinkristallographie ist eine Strukturtechnik, die die Lokalisierung von Wasserstoffatomen ermöglicht und damit wichtige mechanistische Details der Proteinfunktion liefert. Wir stellen hier den Workflow für die Montage eines Proteinkristalls, die Sammlung von Neutronenbeugungsdaten, die Strukturverfeinerung und die Analyse der Neutronenstreulängendichtekarten vor.
Die Neutronenkristallographie ist eine Strukturtechnik, die es ermöglicht, die Positionen von Wasserstoffatomen in biologischen Makromolekülen zu bestimmen und mechanistisch wichtige Informationen über Protonierungs- und Hydratationszustände zu liefern, ohne Strahlenschäden zu verursachen. Die Röntgenbeugung hingegen liefert nur begrenzte Informationen über die Position von Lichtatomen und der Röntgenstrahl induziert schnell Strahlungsschäden an lichtempfindlichen Cofaktoren und Metallzentren. Hier wird der Workflow vorgestellt, der für die IMAGINE- und MaNDi-Beamlines am Oak Ridge National Laboratory (ORNL) verwendet wird, um eine Neutronenbeugungsstruktur zu erhalten, sobald ein Proteinkristall geeigneter Größe (> 0,1 mm3) gezüchtet wurde. Wir demonstrieren die Montage von hydrierten Proteinkristallen in Quarzkapillaren zur Erfassung von Neutronenbeugungsdaten. Ebenfalls vorgestellt wird der Dampfaustauschprozess der montierten Kristalle mit D2O-haltigem Puffer, um den Ersatz von Wasserstoffatomen an austauschbaren Stellen durch Deuterium sicherzustellen. Der Einbau von Deuterium reduziert den Hintergrund, der durch die inkohärente Streuung von Wasserstoffatomen entsteht, und verhindert eine Dichteunterdrückung, die durch ihre negative kohärente Streulänge verursacht wird. Strategien zur Probenausrichtung und Zur Erfassung von Raumtemperaturdaten werden anhand der Quasi-Laue-Datenerfassung bei IMAGINE am High Flux Isotope Reactor (HFIR) veranschaulicht. Darüber hinaus wird die Kristallmontage und das schnelle Einfrieren in flüssigem Stickstoff zur Kryodatenerfassung zur Erfassung labiler Reaktionszwischenprodukte am MaNDi-Flugzeitinstrument an der Spallationsneutronenquelle (SNS) demonstriert. Die Aufbereitung der Modellkoordinaten- und Beugungsdatendateien und die Visualisierung der SLD-Karten (Neutron Scattering Length Density) werden ebenfalls behandelt. Die Strukturverfeinerung gegen reine Neutronendaten oder gegen gemeinsame Röntgen-/Neutronendaten, um eine rein atomare Struktur des interessierenden Proteins zu erhalten, wird abschließend diskutiert. Der Prozess der Bestimmung einer Neutronenstruktur wird anhand von Kristallen der lytischen Polysaccharid-Monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D demonstriert, einem kupferhaltigen Metalloprotein, das am Abbau widerspenstiger Polysaccharide durch oxidative Spaltung der glykosidischen Bindung beteiligt ist.
Die makromolekulare Neutronenkristallographie ist eine Technik, die ein einzigartiges Fenster in die Struktur und zugrunde liegende Chemie von Proteinen bietet. Konzeptionell ähnlich wie die Röntgenbeugung liefert die Neutronenbeugung atomistische Details der makromolekularen Struktur, jedoch ermöglicht die Wechselwirkung von Neutronen mit Kernen die Lokalisierung leichter Atome, die mit Röntgenbeugung oft schwer nachzuweisen sind1. Während der Röntgenbeugung streuen Röntgenstrahlen aus der Elektronenwolke, wodurch leichte Atome wie Wasserstoff (H) in Elektronendichtekarten, die keine auflösung nahe unter Ångström haben, schlecht sichtbar sind2. Im Gegensatz dazu hängt die Streuintensität von Neutronen von komplexen Wechselwirkungen mit dem Kern ab, wobei Isotope desselben Elements unterschiedliche Streulängen aufweisen. Daher haben leichte Atome und ihre Isotope wie Wasserstoff (1H) und Deuterium (2H oder D) eine vergleichbare Sichtbarkeit wie die Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffatome des Rückgrats in SLD-Karten (Neutron Scattering Length Density). Da die Größe der Neutronenstreuung unabhängig von der Anzahl der Elektronen ist, wird die Streuung von leichten Elementen nicht durch schwere Elemente verdeckt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, wie dies bei der Röntgenstreuung beobachtet wird. Die verbesserte Sichtbarkeit von H und seinem Isotop D bei der Neutronenbeugung liefert wertvolle Informationen über den Protonierungszustand von katalytisch wichtigen Resten, Cofaktoren und Liganden und unterstützt die Orientierung von Wassermolekülen und enthüllt wichtige Informationen über katalytische Mechanismen und Proteinchemie3. Die Neutronenbeugung bietet auch den Vorteil, dass es sich um eine zerstörungsfreie Technik handelt, die sich besonders für ionisationsempfindliche biologische Proben eignet, wie Proteine mit Metallzentren oder photosensitive Redoxcofaktoren2. Das Hauptaugenmerk dieses Artikels liegt darauf, einen Überblick über den Workflow zu geben, um eine hochwertige Neutronenproteinkristallstruktur zu erhalten. Wir verweisen den interessierten Leser auf Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 und O’Dell et al.3 für einen hervorragenden Überblick über die Neutronenproteinbeugung und Ashkar et al.7 für weitere Anwendungen der Neutronenstreuung.
Neutronen entstehen hauptsächlich bei Kernreaktionen, bei denen einer von zwei Prozessen zum Einsatz kommt: Kernspaltung an Reaktorquellen oder Spallation an beschleunigerbasierten Quellen8. Reaktorquellen liefern einen kontinuierlichen Neutronenstrahl durch Kernspaltung des 235U-Isotops, während Spallationsneutronenquellen einen gepulsten Neutronenstrahl erzeugen, indem sie ein Ziel, beispielsweise ein flüssiges Metall wie Quecksilber, mit Protonen bombardieren9. Das Oak Ridge National Laboratory (ORNL) in Oak Ridge, Tennessee, beherbergt sowohl eine stationäre Neutronenquelle am High Flux Isotope Reactor (HFIR) als auch eine gepulste 60 Hz-Quelle an der Spallation Neutron Source (SNS). Die IMAGINE-Beamline am HFIR ist ein für biologische Makromoleküle optimiertes Neutronendiffraktometer (Ergänzende Abbildung 1)10. IMAGINE verwendet einen Neutronenbildplattendetektor, um Quasi-Laue-Daten mit einem schmalen Bandpass im Bereich von 2,8 – 4,5 Å von Einkristallen mit Einheitszellenrändern <150 Å zu messen. Das Makromolekulare Neutronendiffraktometer (MaNDi) am SNS ist ein Laue-Neutronendiffraktometer (Time-of-Flight, TOF), das mit einem sphärischen Detektorarray-Rahmen (DAF) ausgestattet ist (ergänzende Abbildung 2)11. MaNDi misst Daten von Einkristallen mit Einheitszellenkanten im Bereich von 10 – 300 Å unter Verwendung einer abstimmbaren Bandbreite von 2 Å-Wellenlängen zwischen 2,0 – 6,0 Å12.
Der Prozess der Erzeugung von Neutronen ist sehr energieintensiv, was im Vergleich zu Röntgenstrahlflüssen an Synchrotronquellen zu relativ schwachen Neutronenstrahlflüssen führt13. Um ausreichende Signal-Rausch-Verhältnisse während der Datenerfassung zu gewährleisten, ist es notwendig, Kristalle geeigneter Größe und Qualität zu züchten14. Typischerweise werden Kristalle mit Volumina > 0,1 mm3 benötigt, um Daten mit angemessenen Statistiken zu sammeln15. Neben geringeren Flussströmen müssen inhärente Eigenschaften der Wechselwirkung zwischen Neutronen und den Probenkernen berücksichtigt werden16. Die Streulänge von Neutronen unterscheidet sich bei Isotopen desselben Elements, eine Eigenschaft, die bei der Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) vorteilhaft ausgenutzt werden kann, um Bereiche einer Probe zu maskieren oder hervorzuheben – ein Prozess, der als Kontrastabgleich17 bekannt ist. In Beugungsexperimenten kann die negativ kohärente Neutronenstreulänge von H (-3,741 fm für 1H) zur Aufhebung der Merkmale der Neutronenstreudichte führen, da die kohärenten Neutronenstreulängen anderer biologisch relevanter Atome, einschließlich Kohlenstoff (6,6511 fm für 12C), Stickstoff (9,37 fm für 14N), Sauerstoff (5,803 fm für 16O), Phosphor (5,13 fm für 31P) und Schwefel (2,804 fm für 32S) sind positiv (Tabelle 1)12,14. Darüber hinaus erhöht die große inkohärente Streulänge von H (25.274 fm) den Hintergrund während der Datenerfassung, was die Qualität des Datensatzes beeinträchtigt und die Datenauflösung beeinträchtigt7. Um diese durch H eingeführten Einschränkungen zu umgehen, ist es für die Neutronenbeugung notwendig, H gegen sein Isotop Deuterium 2H(D) auszutauschen, das eine positive kohärente Neutronenstreulänge (6.671 fm) und eine signifikant geringere inkohärente Streulänge (4.04 fm)19 aufweist. Dies kann durch Perdeuteration erreicht werden, ein Prozess, bei dem das Protein von Organismen exprimiert wird, die in vollständig deuterierten Medien gezüchtet werden, um die vollständige Aufnahme von D an H-Stellen zu gewährleisten20. Es ist auch möglich, Protein teilweise zu deuterieren, indem H durch D nur an den austauschbaren Stellen (titrierbare Gruppen) ersetzt wird, während die nicht austauschbaren kohlenstoffgebundenen Stellen hydriert bleiben21. Dies kann durch das Wachstum von hydrierten Proteinkristallen in deuterierter Mutterlauge erreicht werden22. Am häufigsten wird der H/D-Austausch von hydrierten Proteinen jedoch durch Dampfaustausch nach dem Wachstum von entsprechend großen Kristallen in H2O-basiertem Buffer23 durchgeführt. In solchen Fällen werden Kristalle in einer Quarzkapillare montiert und mit einer D20-basierten Mutterlauge dampfgleich.
Die begrenzten Neutronenflüsse an Neutronenquellen führen zu längeren Datenerfassungszeiten von Tagen bis zu mehreren Wochen24. Bei ORNL verwenden sowohl IMAGINE als auch MaNDi einen schmalen Wellenlängenbandpass im Bereich von 2–6 Å, um die Datenerfassung zu optimieren25. Die Daten können bei Raumtemperatur oder bei Kryotemperatur gesammelt werden. Die Kryo-Datenerfassung kann potenziell die Datenqualität verbessern und eröffnet die Möglichkeit für katalytische Zwischenprodukte, die einfrieren. Nach der Erfassung von Neutronenbeugungsdaten wird ein Röntgendatensatz typischerweise auf demselben Kristall bei gleicher Temperatur oder auf einem Unter identischen Bedingungen gezüchteten Kristall gesammelt26. Die Datenerfassung bei gleicher Temperatur ermöglicht eine Strukturverfeinerung sowohl gegen Röntgen- als auch gegen Neutronendaten, wodurch mögliche temperaturinduzierte Artefakte wie Änderungen der Sichtbarkeit und Position von Gewässern oder die Besetzung von Rückständen mit abwechselnden Konformationen27 verhindert werden. Die gemeinsame Verfeinerung der Röntgenneutronendaten erhöht das Daten-zu-Parameter-Verhältnis und bietet den Vorteil, dass die Protein-Backbone-Koordinaten gegen die Röntgendaten verfeinert werden können, während die Neutronenbeugungsdaten zur Verfeinerung der Position der H/D-Atome verwendet werden28. Dies ist besonders nützlich bei der Verwendung von teilweise deuterierten Proben, bei denen eine Dichtestornierung aufgrund von H-Atomen an nicht austauschbaren Stellen auf dem Protein vorliegt. Obwohl die Anzahl der Röntgenstrukturen die Anzahl der in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegten Neutronenstrukturen bei weitem übersteigt, wurden Softwarepakete, die ursprünglich für die Verfeinerung von Röntgendaten entwickelt wurden, um auch Neutronendaten zu umfassen3,29,30. Nach der Datenerfassung können Modelle mit Refinement-Paketen wie phenix.refine, CNSsolve (nCNS) oder SHELXL28,31,32,33 verfeinert werden. Während des Verfeinerungsprozesses können Neutronenstreudichtekarten für die manuelle Anpassung mit COOT34 visualisiert werden. Nach der Strukturlösung können die Koordinaten und die Neutronen- und/oder Röntgenbeugungsdatendateien an die PDB übermittelt werden, die das Modell validiert und hinterlegt und öffentlich zugänglich macht18,29,30.
Die Strukturanalyse von Proteinen ist ein facettenreicher Ansatz, bei dem zahlreiche Techniken eingesetzt werden, um ihre Funktion und ihren Mechanismus zu untersuchen35. Die Neutronenproteinkristallographie liefert wertvolle chemische Erkenntnisse, um Erkenntnisse aus zusätzlichen Studien wie Röntgenbeugung, Spektroskopie, Kernspinresonanz (NMR) oder Mikrokristallelektronenbeugung (microED)36 zu erweitern und zu ergänzen. Die Neutronenproteinbeugung ist einzigartig positioniert, um Einblicke in enzymatische Mechanismen zu geben, da H-Atome für ihre Chemie von zentraler Bedeutung sind. Das Fehlen von Durch Neutronen verursachten Strahlenschäden macht sie zu einer Sonde, die sich hervorragend für die Untersuchung von Metalloproteinen eignet37. Wir präsentieren hier ein repräsentatives Beispiel für den Prozess der Neutronenproteinbeugung von der Probenvorbereitung bis zur Datenerhebung, Verfeinerung und Analyse (Abbildung 1). Aus dem Metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D) wurden Kristalle von ausreichender Größe für Neutronenbeugungsexperimente gezüchtet. NC LPMO9D ist ein kupferhaltiges Metalloprotein, das am Abbau widerspenstiger Cellulose durch Sauerstoffatomeinfügung an der glykosidischen Bindung beteiligt ist38,39. Die aktive Stelle NcLPMO9D enthält ein mononukleäres Kupferzentrum innerhalb einer charakteristischen “Histidin-Klammer”, die aus dem N-terminalen Histidin und einem zweiten konservierten Histidin besteht (ergänzende Abbildung 3)40. Das N-terminale Pilz-LPMOs ist methyliert, aber die Post-Transitional-Modifikation tritt während der rekombinanten Expression in Hefe nicht auf. Im NcLPMO9D-Ruhezustand liegt das Kupferzentrum in einer Cu2+-Oxidationsstufe vor und wird durch Einzelelektronenreduktion zu Cu1+ aktiviert, so dass molekularer Sauerstoff binden und aktiviert werden kann, indem er schnell zu einer Superoxidspezies reduziert wird41,42. Die gesamte NcLPMO9D-Reaktion erfordert eine weitere Zugabe von einem Elektron und zwei Protonen, um das hydroxylierte Polysaccharidprodukt zu bilden43. Die Identität der aktivierten Sauerstoffspezies, die für die Wasserstoffatomabstraktion (HAA) aus dem Polysaccharidsubstrat verantwortlich ist, wurde nicht identifiziert, und es laufen derzeit intensive Struktur- und Computerstudien44,45. Angesichts der Redoxchemie am aktiven Standort NcLPMO9D ist die Minderung von Strahlenschäden besonders wichtig. Wir veranschaulichen hier die Erfassung von Raumtemperatur- und Kryotemperaturdaten an NcLPMO9D-Kristallen zur Bestimmung der NcLPMO9D-Struktur im Ruhezustand bzw. in aktivierter reduzierter Form46. Der Schwerpunkt liegt auf der Proteinkristallmontage, dem Aufbau des Beamline-Instruments für die Datenerfassung, der Aufbereitung der Daten- und Koordinatendateien und den Verfeinerungsschritten, die zur Modellierung einer rein atomaren Neutronenstruktur erforderlich sind.
Die Neutronenproteinkristallographie ist eine hochempfindliche Technik zur Untersuchung von Protonierungszuständen und der Orientierung von Wassermolekülen in Proteinen. Diese Informationen geben Aufschluss über die katalytischen Mechanismen von Proteinen, da Änderungen der Protonierungs- und Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen oft von zentraler Bedeutung für die Enzymchemie sind10. Die Neutronenproteinkristallographie, obwohl eine informative Technik, hat eine Reihe von Faktoren, die vor der Planung eines Neutronenbeugungsexperiments berücksichtigt werden sollten, nämlich:
Die Neutronenproteinkristallographie ist eine flussbegrenzte Technik. Im Gegensatz zu Röntgenbeugungsdatensätzen werden für Neutronendatensätze aufgrund der technikimmanenten Einschränkungen (Flussbegrenzung, Quasi-Laue, längere Wellenlängen) höhere R-Faktoren und geringere Vollständigkeit, Redundanz und Signal-Rausch-Verhältnisse erwartet. Die Datenerfassung eines einzelnen Frames dauert in der Regel 12 – 18 Stunden. Der Erfolg eines Experiments hängt stark von der Probengröße und -qualität ab, wobei Kristalle von 0,1 mm3 oft die Mindestanforderung sind3. Die Neutronenbeugung erfordert die Produktion großer Mengen an Protein, um Kristallisationstropfen im Bereich von 10 bis 800 μL aufzubauen. Das Mindestvolumen für die Züchtung ausreichend großer Kristalle kann mit einem Volumenrechner unter Berücksichtigung der Kristall- und Probenparameter (https://neutrons.ornl.gov/imagine) geschätzt werden. Das Wachstum großer Kristalle wurde am häufigsten durch Dampfdiffusion erreicht3. Die Hängetropfenkristallisation ermöglicht das Wachstum von Kristallen in großen Tropfen im Bereich von 10-25 μL, während größere Tropfen im Bereich von bis zu ~ 50 μL mit handelsüblichen Sitztropfengeräten eingerichtet werden können14,54. Silikonisierte Neun-Well-Glasplatten können verwendet werden, um sehr große Tropfen mit Volumina von bis zu 800 μL aufzustellen. Diese Glasplatten werden in “Sandwich-Boxen” platziert, die im Handel bei Hampton Research erhältlich sind. Weitere Kristallisationstechniken umfassen die Batchkristallisation, bei der die Grenze der Tropfengröße vom Gefäß vorgegeben wird. Das Batch-Kristallisationsexperiment kann von Mikrolitern bis millilitern reichen55. Die Kristallisation kann auch unter Verwendung der Dialysetechnik durchgeführt werden, bei der das Protein über eine Dialysemembran oder durch Gegendiffusion entlang eines Fällungsmittelkonzentrationsgradienten oder durch einen porösen Pfropfen wie Agarose56,57 mit dem Fällungsmittel ausgeglichen wird. Seeding bietet eine weitere Alternative, um Kristalle des gewünschten Volumens zu erhalten. Mikro- und Makroseierung wurden erfolgreich für große Kristallwuchse eingesetzt, einschließlich großer Kristalle von NcLPMO9D45. Einige Kenntnisse des Proteinphasendiagramms, einschließlich des Einflusses der Temperatur auf die Löslichkeit, helfen bei großem Kristallwachstum.
Bei der Planung eines Neutronenbeugungsexperiments ist die Optimierung der Proteinvorbereitung zur Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses während der Beugungsdatenerhebung unerlässlich7. Um die Dichteunterdrückung und die hohe inkohärente Streuung durch H-Atome zu umgehen, können Neutronen-SLD-Karten verbessert werden, indem H-Atome gegen sein Isotop D ausgetauscht werden, das eine positive kohärente Streulänge und eine geringe inkohärente Streulänge besitzt. Um dies zu erreichen, wird ein Dampfaustausch des hydrierten Proteinkristalls gegen deuterierten Kristallisationspuffer durchgeführt. Dies gewährleistet den H/D-Austausch von Lösungsmittelmolekülen und den labilen, titrierbaren Protein-H-Atomen23. Der Dampfaustausch erfolgt durch Montage des hydrierten Kristalls in einer Quarzkapillare mit D2O-basierten, deuterierten Kristallisationspuffer-“Plugs” und stellt eine effektive, schonende Technik dar, die am häufigsten angewendet wird14,23,35. Der Austausch kann mehrere Wochen dauern und erfordert vorzugsweise, dass der deuterierte Puffer häufig gewechselt wird, um einen maximalen H/D-Austausch zu gewährleisten. Der H / D-Austausch kann auch durchgeführt werden, indem der Kristall direkt in deuteriertem Puffer eingeweicht wird. Um zu vermeiden, dass der Kristall aufgrund von D2O-Exposition unter Stress gesetzt wird, sollte der Einweichvorgang schrittweise durchgeführt werden, indem das D2O: H2O-Verhältnis schrittweise erhöht wird58. Darüber hinaus kann die Kristallisation von hydriertem Protein auch in deuteriertem Puffer für den H/D-Austausch an labilen H-Stellen durchgeführt werden22,59. Es sollte jedoch beachtet werden, dass D2O-basierter Puffer eine Wirkung auf die Proteinlöslichkeit hat, die eine weitere Anpassung der bekannten H2O-basierten Bedingungen erfordert3,59. Es wurde auch beobachtet, dass D2O-basierte Puffer in einigen Fällen zu kleineren Kristallen führen59. Der vollständige Austausch von titrierbaren und kohlenstoffgebundenen H-Atomen zu D kann erreicht werden, indem Proteine in deuterierten Medien exprimiert werden, um eine perdeuterierte Probe zu erzeugen20. Die resultierenden Neutronen-SLD-Karten der perdeuterierten Probe werden signifikant verbessert und zeigen nicht mehr die Dichteaufhebung des hydrierten Probengegenstücks an. Dies ist vorteilhaft bei der Charakterisierung von H / D, das an nicht austauschbaren Stellen in einem Protein oder Cofaktor gebunden ist. Die Expression von perdeuteriertem Protein ist jedoch sowohl kostenintensiv als auch ertragsarm60. Das Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) bietet eine Deuterationseinrichtung für Benutzer, die eine perdeuterierte Probe (https://www.ornl.gov/facility/csmb) erzeugen möchten. Die perdeuterierte Expression wird typischerweise in einem Bioreaktor auf der 1-l-Skala durchgeführt, der ~ 50 mg gereinigtes Protein ergibt61.
Nach der Erfassung der Neutronenbeugungsdaten wird die Verfeinerung und interaktive Modellbildung durchgeführt. Die Verfeinerung kann mit mehreren Software-Suiten ausgeführt werden, einschließlich phenix.refine, nCNS oder SHELXL28,31,32,33. Die Phenix-Suite ist die am häufigsten verwendete Software zur Verfeinerung von Neutronenbeugungsdaten in Verbindung mit Coot, mit der das Modell manuell aus den Neutronen-SLD-Karten erstellt wird34. Obwohl sowohl Phenix als auch Coot die Verarbeitung von Neutronenbeugungsdaten ermöglichen, fehlen ihnen möglicherweise bestimmte Merkmale, die notwendig sind, um die mit Neutronendaten und deuterierten Proben verbundenen Eigenheiten zu verarbeiten. Zum Beispiel enthält Coot keine Geometrieoptimierung für deuterierte Reste, was zu Komplikationen beim Modellaufbau führen kann, da das Feature “Real Space Refine” zu “explodierenden” Residuen führt (ergänzende Abbildung 26) 62. Dies kann gelöst werden, indem Rückhaltedateien für alle deuterierten Rückstände generiert werden. Dies ist jedoch ein intensiver Prozess und solche Bibliotheken sind derzeit nicht öffentlich zugänglich. Bei der Durchführung von Verfeinerungen in Phenix werden austauschbare H/D-Standorte zunächst auf 0,50 Belegung für H und D eingestellt. Wenn Verfeinerungen durchgeführt werden, wird die Belegung von H und D gemäß den Neutronen-SLD-Karten verfeinert. Während des interaktiven Modellbaus sind Fo-Fc-Karten mit Differenzdichte sehr informativ bei der Beurteilung der H / D-Belegung. Anhand von Karten kann festgestellt werden, welche Standorte eine hohe D-Belegung aufweisen, was besonders an dem aktiven Standort, an dem Protonierungszustände katalytisch relevant sind, aufschlussreich ist63. Mehrdeutige Situationen treten jedoch auf, wenn die H: D Die Belegung liegt in der Nähe von 0,70:0,30, was zu einer vollständigen Signalunterdrückung in Neutronen-SLD-Karten führt64. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass Quasi-Laue-Neutronen-Datensätze oft eine Vollständigkeit von etwa 80% aufweisen, was niedriger ist als die routinemäßig beobachteten ≥ 98% für Röntgenbeugungsdaten. Bei der Verfeinerung von Neutronenbeugungsdaten in Phenix werden daher die fehlenden beobachteten Amplituden (Fo) aus dem Modell berechnet, um die Reflexionsliste zu vervollständigen und so eine Modellverzerrung einzuführen. Um dieser potenziellen Verzerrung Rechnung zu tragen, sollten “no_fill” -Karten während der interaktiven Modellerstellung im Gegensatz zu “gefüllten” Karten untersucht werden.
Benutzer können wählen, ob sie eine gemeinsame Röntgen- / Neutronendatenverfeinerung ihrer Struktur oder eine Verfeinerung nur für Neutronendaten durchführen möchten. Die Visualisierung von Neutronen-SLD-Karten, insbesondere bei niedrigerer Auflösung, kann insbesondere für ein hydriertes Protein, in dem H trotz H/D-Dampfaustausch noch an nicht austauschbaren Stellen vorhanden ist, zunächst beunruhigend sein. Dies führt zu Neutronendichtekartenaufhebungen, die den Eindruck von diskontinuierlichen Karten erwecken65,66. Das Sammeln eines entsprechenden Röntgendatensatzes ergänzt diese Aufhebungen vorteilhaft in einer gemeinsamen Verfeinerung (Abbildung 13A und Abbildung 13B). Eine gemeinsame Verfeinerungsstrategie beinhaltet typischerweise die Verfeinerung der Protein-Backbone-Koordinaten anhand der Röntgendaten, während die Neutronenbeugungsdaten verwendet werden, um die Position und Belegung der H / D-Atome an austauschbaren Stellen zu verfeinern28. Da die Einführung einer gemeinsamen H/D-Belegung an austauschbaren Standorten die Anzahl der zu verfeinernden Parameter erhöht, erhöht eine gemeinsame Verfeinerung mit Röntgendaten auch das Daten-zu-Parameter-Verhältnis. Eine gemeinsame Verfeinerung erfordert, dass ein entsprechender Röntgendatensatz bei gleicher Temperatur auf demselben Kristall oder einem unter den gleichen Bedingungen gezüchteten Kristall gesammelt wird. Für Neutronenbeugungsdaten, die bei Raumtemperatur (300K) gesammelt werden, sollte der entsprechende Röntgendatensatz bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Niedrigdosis-Datenerfassungsstrategie gesammelt werden, um Strahlenschäden zu begrenzen. Perdeuterierte Proben hingegen liefern verbesserte und kontinuierliche Neutronen-SLD-Karten, da sie nicht die gleiche Größe der H/D-Signalunterdrückung besitzen. Die Neutronenstreulänge bestimmter Elemente, einschließlich Metalle und Schwefel, macht sie jedoch in Neutronen-SLD-Karten schlecht sichtbar, selbst wenn das Protein perdeuteriert wurde (Abbildung 13C-F)18. Wenn ein Metall charakterisiert werden muss, ist es am besten, die Röntgenbeugung in einer Gelenkverfeinerung zu verwenden oder spektroskopische Techniken anzuwenden, um Beugungsexperimente zu ergänzen. Reine Neutronendatenverfeinerungen werden häufig durchgeführt, wenn der Neutronendatensatz eine hohe Auflösung aufweist oder wenn ein perdeuteriertes Protein verwendet wurde. Darüber hinaus ist die Verfeinerung reiner Neutronendaten besonders nützlich, wenn ein Protein untersucht wird, das sehr empfindlich auf Strahlungsschäden reagiert, da eine von Röntgenstrahlen abgeleitete Struktur strahlungsinduzierte Artefakte besitzen kann. Soll eine reine Neutronendatenverfeinerung durchgeführt werden, muss festgestellt werden, ob der entsprechende Neutronendatensatz eine ausreichende Vollständigkeit und Auflösung aufweist.
ORNL bietet zwei Möglichkeiten zur Erfassung von Neutronenbeugungsdaten: die IMAGINE-Beamline am HFIR sowie die MaNDi-Beamline am SNS36,67. Während beide Instrumente effektive Mittel zum Sammeln eines Neutronenbeugungsdatensatzes bieten, der ähnliche Prinzipien anwendet, hat jedes Instrument einzigartige Spezifikationen, die bei der Beantragung der Strahlzeit berücksichtigt werden sollten. IMAGINE sammelt Quasi-Laue-Daten und ist für die Raumtemperatur-Datenerfassung an Kristallen mit Elementarzellen bis ~100 Å optimiert. MaNDi kann für die Erfassung von Raumtemperatur- und Kryotemperaturdaten unter Verwendung der TOF-Laue-Sammlung auf Kristallen mit Einheitszellen bis zu ~ 300 Å verwendet werden. Vor dem Sammeln eines vollständigen Datensatzes wird ein Test am Kristall durchgeführt, um die Qualität des erhaltenen Beugungsmusters zu bewerten, in dem der Kristall dem Neutronenstrahl für ein einzelnes Bild ausgesetzt wird. Ist der Kristall von ausreichender Qualität, wird analog zur Röntgendatenverarbeitung ein vollständiger Neutronenbeugungsdatensatz gesammelt, indiziert, integriert, skaliert und in einem Prozess zusammengeführt. IMAGINE verwendet Lauegen und Lscale und MaNDi verwendet das Mantid-Paket und verwendet dreidimensionale Profilanpassungen48,50,51,68,69,70. Wissenschaftler, die an einer dieser Einrichtungen nutzer werden, erhalten einen Datensatz im MTZ- oder HKL-Format zur weiteren Analyse.
Die Neutronenbeugung ist eine zerstörungsfreie, hochempfindliche Technik zur Untersuchung des Protonierungszustands und der Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen biologischer Makromoleküle. Es ist besonders nützlich für photosensible Proteine und Metalloproteine. Mehrere Überlegungen bezüglich der Technik sowie der Verarbeitung der Daten müssen vor der Durchführung eines Experiments berücksichtigt werden, aber das Ergebnis liefert Ergebnisse, die wertvolle Einblicke in den katalytischen Mechanismus des interessierenden Proteins geben können. Die Neutronenproteinkristallographie ergänzt computergestützte, strukturelle, biochemische und spektroskopische Studien und ist damit ein wertvolles Werkzeug in der Toolbox des Biologen von Techniken zur Charakterisierung biologischer Makromoleküle.
The authors have nothing to disclose.
Experimente zur Proteinexpression, -reinigung und -kristallisation wurden am Center for Structural Molecular Biology (CSMB), einer Nutzereinrichtung des US-Ministeriums für biologische und Umweltforschung am Oak Ridge National Laboratory, durchgeführt. Neutronenbeugungsdaten wurden an BL-11B MaNDi an der Spallationsneutronenquelle (SNS) am ORNL gesammelt, die von der Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy gesponsert wird. Die Autoren danken Brendan Sullivan für die Unterstützung bei der Datenreduktion. Röntgenbeugungsdaten wurden an den Einrichtungen des Molecular Education, Technology and Research Innovation Center (METRIC) an der North Carolina State University gesammelt, die vom Bundesstaat North Carolina unterstützt wird. GCS würdigt die Unterstützung zum Teil durch die National Research Foundation (NRF), Südafrika und das Graduate Opportunities (GO!) FM bestätigt die Unterstützung von USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |